专利名称：一种从紫色小白菜叶片中提取花青素的方法
技术领域：
本发明属于蔬菜营养成分的提取方法，具体涉及一种从紫色小白菜叶片中提取花青素的方法。
背景技术：
色素是一种重要的食品添加剂，随着科技的进步和人类健康意识的提高，人们发现合成色素存在不同程度的慢性毒性、致畸性和致癌性。研究开发安全、无毒和具有保健功能的天然色素，是当今社会发展的必然趋势。花青素是一类广泛存在于植物体中类黄酮类天然色素，一般以糖苷的形式积累于液泡内。花青素不仅使花卉、水果和蔬菜呈现美丽的颜色，还赋予其更高的功能性，如抗紫外线、抗病、抗虫等，而且还可以清除自由基，具有很强的抗氧化能力，在医学上已证明对花青素对人类血液循环失调、肝机能障碍、心血管、癌症和艾滋病等疾病具有一定的疗效，因此日益受到重视。紫色小白菜是韩国应用细胞质雄性不育系育成的杂交Fl(中文名称“紫罗兰”)，2006年在国内市场销售，深受欢迎。“紫罗兰” 个体生长速度较慢，叶片正面紫色，背面绿色，叶脉紫色，叶柄翠绿。在秋季栽培条件下，由于阳光充足，叶片的亮紫色表现尤为突出。“紫罗兰”紫色小白菜叶色独特，有必要对其紫色小白菜紫色成分花青素进行研究。花青素是一种水溶性色素，易溶于极性溶剂，如水，甲醇，乙醇等。植物中花青素的提取方法比较成熟的主要有浸提法、超声波法和微波法。超声波法、微波法能够提高提取率，缩短提取时间，但设备成本较高、工艺复杂、能耗较高等。浸提法设备简单、操作简便、工序简单，是应用时间最长，应用范围最广的提取方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从紫色小白菜叶片中提取花青素的方法。为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案得以实现
一种从紫色小白菜叶片中提取花青素的方法，其特征在于，该方法以紫色小白菜叶片为原料，经冷冻冻干粉并粉碎、乙酸溶液浸提，高速离心、过滤，得到高浓度的花青素提取液，具体包括下列步骤
步骤一，将紫色小白菜叶片在-40°C下进行冷冻干燥，干燥后进行粉碎并过40目筛，得到紫色小白菜叶片冻干粉；
步骤二，将紫色小白菜叶片冻干粉置于离心管中，以35%体积分数的乙酸溶液作为提取溶剂，采用浸提法，在25°C环境下，提取2次，每次提取的料液比为1:10，提取时间Imin 左右；
步骤三，每次的提取液于HOOOrpm下离心lOmin，取上清液过0. 45 μ m滤膜，即得到高浓度的花青素提取液；
步骤四，两次得到的花青素提取液，单独或合并后进行色素的浓缩和精制即得纯品。本发明提供的从紫色小白菜中提取花青素的方法，其有益之处在于1)简单该方法简便易行，实验条件温和。2)省时提取时间短。3)高效提取液中花青素含量较高，且不含有干扰色素——叶绿素。4)成本低廉提取剂选用的乙酸，成本低廉；提取温度25°C，即室温环境，几乎没有能耗；提取液中花青素含量较高，而没有传统提取剂常见的叶绿素干扰现象，这就大大简化了分离纯化的步骤，降低了分离纯化的成本。5)安全提取剂安全无毒，所提取色素可安全应用于食品领域。
图1是不同提取剂提取的花青素光谱； 图2是不同溶液环境中的叶绿素光谱； 图3是不同浓度乙酸提取的花青素光谱； 图4是不同提取方法提取的花青素光谱； 图5是不同提取次数提取的花青素光谱。以下结合实验和实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施例方式本发明的从紫色小白菜叶片中提取花青素的方法，将紫色小白菜叶片在-40°C冷冻干燥，粉碎，将紫色小白菜叶片粉末置于离心管中，以35%体积分数的乙酸为提取液，料液比为(g/mL)l 10，提取温度25°C，提取时间Imin左右，共提取两次，高速离心并过滤后得到较纯的花青素提取液。提取液定量稀释后在可见光区进行光谱扫描，以确定花青素的特征吸收峰位及峰值，并检验有无叶绿素的干扰。两次得到的花青素提取液，单独或合并后进行色素的浓缩和精制即得纯品。本发明的从紫色小白菜叶片中提取花青素的方法，使用乙酸/水的混合溶剂，在一定温度下进行提取，可以高效率、高纯度地获得花青素提取液。避免了传统提取方法的大量叶绿素析出现象，是相对较纯的提取液，减少了精制工序。本发明的方法是根据相似相溶的原理进行的。其过程的实质是花青素从细胞内部向溶剂转移的传质过程溶剂分子从溶剂主体传递到粉状颗粒的表面，细胞中的成分由于扩散作用迅速进入溶剂中。最终花青素从粉状颗粒溶解于溶剂主体中。其中，花青素在所选溶剂中溶解度的大小以及向溶剂扩散的难易程度是影响提取率的两个主要因素。而花青素在所选溶剂中的扩散速度又取决于固体颗粒大小、料液比、提取温度等因素。花青素通常储存于植物细胞的液泡内，而液泡膜和细胞膜产生的扩散阻力使得其浸提速率比较小。对原料进行诸如干燥或粉碎之类的预处理，有助于植物细胞膜的破裂，溶剂也容易进入植物细胞内部直接溶解花青素，从而可以提高提取效率。在发明人给出的实验中，以下参考文献被引用
1杨东平，氮肥对小白菜生长及硝酸盐积累的影响[J]，安徽农业科学，2010,38 (33) 18825-18827。2张德双，张凤兰，余阳俊，赵岫云，于拴仓，徐家炳，紫色大白菜育种思路初探[J]，长江蔬菜，2008，lib :14-17 ；
3高彦祥，许正虹，食用天然色素安全性研究进展[J]，食品科学，2005，26 (Si) 158-162。4Alison Downham, Paul Collins. Colouring our foods in the last and next millennium[J]. International Journal of Food Science and Technology, 2000, 35. 5 2 2 ο5陈鼎，夏春镗，花青素类天然色素的光降解比较[J]，同济大学学报(医学版)， 2006,27 (5) :13-16，20。6岳辉吉，朱杰.天然色素的超声提取研究[J]，现代生物医学进展，2006，6(5): 11-13。7陈耀兵，圣地紫罗兰油菜栽培基质的选择试验[J]，湖北民族学院学报(自然科学版)，2006，24 (4) :324-327。8王华兴，陈锦屏，赵丽华.山楂果实色素含量测定方法的研究[J]，中国果菜， 1996，(1) :23-25。9Creasy, L. L. The Role of Low Tempetature in anthocyanin synthesis in mclntosh apples. Proc. Amer. Soc. Hort. Sci. 1968(93): 716-724。10卢钰，董现义，杜景平，李永强，王明林，花色苷研究进展[J]，山东农业大学学报(自然科学版)，2004，35 (2):315-320。11白逾，丁来欣，“勿忘我”花色素的提取及稳定性研究[J]，食品科技，2009，34 (3) :180-184。12雷然，庄华梅，付惠，苜蓿花色素的提取及性质研究[J]，云南化工，2007，34 (3) :35-37,43。13胡晓丹，孙爱东，王彩霞，张德权，超声波辅助提取紫苏叶中花色素苷的工艺研究[J]，食品工业科技，2008，29 (6) 183-185，188。14刘超，紫甘薯花青素的提取及其稳定性和抗氧化性的研究[D]，长沙湖南农业大学，2008。1材料与方法 1. 1材料
北京好地种子有限公司销售的“紫罗兰”小白菜种子，其个体生长速度较慢，叶片正面紫色，背面绿色，叶脉紫色，叶柄翠绿。温室中栽培，商品采收期采收叶片，-40°C下冷冻干燥，磨碎后过40目筛，于密闭、干燥、避光环境中保存备用。1. 2试验方法
1. 2. 1花青素的提取
提取工艺的优化采用单因素试验。单因素及其水平为 提取温度(°C) :25、35、45、55、65、75 ； 料液比(g/mL) :1:5、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 ； 提取时间(min) 1 min、5 min、15 min、30 min、45 min、60min ； 提取次数1、2、3、4次。经过不同的提取工艺提取后，离心(14000rpm, IOmin),取上清液过0. 45 μ m滤膜并定量稀释后上样测定。1. 2. 2光谱扫描确定花青素的特征峰位及峰值
测定液用岛津UV-2550紫外-可见分光光度计进行光谱扫描。花青素实际吸光度由以下公式(1)、(2)视情况择一进行换算，提取液浓度由公式 (3)进行计算:
A= (Aa-Acn) -0. 1 (Acp-Acn)(1)
A=Aa-HiAcp(2)
提取液浓度(mg/mL) =AXMWXDf/ ( ε XL) (3)
式中A 花青素实际吸光度·Α 花青素特征吸收峰值；Am 叶绿素特征吸收谷值；Α。ρ 叶绿素特征吸收峰值；m 干扰系数，即叶绿素在花青素特征吸收峰处的峰值与其本身的特征吸收峰值之比；丽矢车菊素-3-葡萄糖苷的分子量，449. 2 ；DF 稀释倍数；ε 矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数，26900 ；L 比色皿光程，Icm0公式(1)在测定液中叶绿素含量较少时采用，公式(2)在测定液中叶绿素含量较多时采用[8_9]。每个处理3次重复，用邓肯新复极差法进行差异显著性分析。2结果与分析 2. 1提取剂的筛选
以10%浓度(体积分数，下同)的乙酸水、1%浓度的HCl-甲醇、1%浓度的HCl-乙醇和1% 浓度的HCl-丙酮为提取剂，25°C下浸提30min。提取的花青素光谱扫描结果如图1所示，叶绿素在不同溶剂环境中的光谱如图2所示，花青素实际吸光度如表1所示。表1 不同提取剂的花青素提取效果比较
飄·霞急___芘奮豪祷λ A子tt系数j A ι L................................................. 一-“I 纖？？ 爾水驗紅—0. 254XSHCl-Φ 653 1 0.5040. 226530 b I 0.5290.415iVKi-乙 B 红S654 [ 0,4560. 22453 .n I 0.3840. 262ifflci-WR麵654 0. S0. 245.529, C 1 0,18 0.035
由图1可以看出，4种提取剂只有10%浓度的乙酸水的提取液中没有叶绿素的析出。通过提纯紫色小白菜中的叶绿素，得出了叶绿素在1%浓度的HCl-甲醇、1%浓度的HCl-乙醇、 1%浓度的HCl-丙酮中的干扰系数，利用公式(2)计算得出花青素的实际吸光度。在表1中， 不考虑测定环境的差异，以1%浓度的HCl-甲醇的特征峰值为最高，以1%浓度的HCl-丙酮的特征峰值为最低，几乎为0。考虑到甲醇的毒性对该色素在食用天然色素方面的应用有很大限制，并且其叶绿素提取量太高，增加了进一步色素提纯和精制的工作量，所以选择10% 浓度的乙酸水作为提取剂。
2.2乙酸提取浓度的筛选
在 25°C下，设置 11 个乙酸浓度的梯度(％) :5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55 ；25°C 下分别提取30min，离心并过滤后取上清液，定量稀释同时调整乙酸浓度统一为10%，平衡 2h后上样测定。提取的花青素光谱扫描结果如图3所示，花青素实际吸光度如表2所示。
表2 不同浓度乙酸的花青素提取效果比较
权利要求
1. 一种从紫色小白菜叶片中提取花青素的方法，其特征在于，该方法以紫色小白菜叶片为原料，经冷冻干燥并粉碎，乙酸溶液萃取，高速离心，过滤，得到花青素提取液，具体包括下列步骤步骤一，将紫色小白菜叶片在-40°C下进行冷冻干燥，干燥后粉碎并过40目筛，得到紫色小白菜叶片冻干粉；步骤二，将紫色小白菜叶片冻干粉置于离心管中，以35%体积分数的乙酸溶液作为提取溶剂，在25°C环境下，浸提2次，每次提取的料液比为1:10，提取时间lmin;步骤三，每次的提取液于HOOOrpm下离心lOmin，取上清液过0. 45 μ m滤膜，即得到高浓度的花青素提取液；步骤四，两次的花青素提取液单独或合并后进行色素的浓缩和精制，即得纯品。
全文摘要
本发明公开了一种从紫色小白菜叶片中提取花青素的方法，该方法以紫色小白菜叶片为原料，经冷冻干燥并粉碎，以35%体积分数的乙酸为提取剂，25℃浸提两次，能够较充分的提出花青素。本发明提供的方法简便易行，试验条件无毒、温和、能耗低；提取时间短；提取液花青素浓度高；提取剂筛选过程中充分考虑了紫色小白菜叶绿素高的特点，有效避开了叶绿素析出对花青素的干扰，光谱扫描中没有发现叶绿素的特征峰。用于提取的溶剂安全无毒，有利于环境保护和色素在食品领域的推广。
文档编号C09B61/00GK102167691SQ20111006065
公开日2011年8月31日 申请日期2011年3月14日 优先权日2011年3月14日
发明者张鲁刚, 李长新 申请人:西北农林科技大学