一种4,4`‑二(3‑氨基苯)‑2,2`‑双噻唑pH荧光探针及其制备和应用的制作方法

本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种4, 4'-二(3-氨基苯)-2, 2'-双噻唑pH荧光探针及其制备和应用。

背景技术：

pH作为一个重要参数，在食品生产、化学反应控制、环境分析、医学诊断以及生命科学等众多领域中都发挥着重要作用。对于有机生物体而言，维持体内pH平衡尤为重要，pH环境紊乱可能引起细胞的异常发育，甚至致癌。因此，生物体内pH的监测一直备受关注。已报道的pH检测方法有酸碱滴定法、电位滴定法和荧光分析法等。其中荧光分析法由于灵敏度高、选择性好、响应快、成本低且操作方便等优点而被广泛使用。而且，随着荧光探针与共聚焦激光扫描技术的结合，荧光成像技术为活细胞内pH的变化提供了高空间和时间的观察。目前，许多杰出的荧光探针都已被用于中性或弱酸性（pH 4-7）条件下生物体系中pH的监测，然而pH低于4或碱性条件下的探针却报道的很少。因此，设计研究这样的探针并应用于生物成像颇具挑战。

技术实现要素：

本发明为了解决现有pH荧光探针仅能用于中性或弱酸性（pH 4-7）条件下生物体系中pH的监测，而不能应用于pH低于4的条件下生物体系中pH监测的问题，提供了一种4, 4'-二(3-氨基苯)-2, 2'-双噻唑pH荧光探针及其制备和应用。

本发明由如下技术方案实现的：一种4, 4'-二(3-氨基苯)-2, 2'-双噻唑pH荧光探针，用二硫代乙二酰胺与2-溴-3'-硝基苯乙酮反应生成4,4'-二(3-硝基苯基)- 2,2'-双噻唑，然后将4,4'-二(3-硝基苯基)- 2,2'-双噻唑与水合肼反应生成4, 4'-二(3-氨基苯)-2, 2'-双噻唑pH荧光探针，所述4, 4'-二(3-氨基苯)-2, 2'-双噻唑pH荧光探针结构如式（1）， 。

4, 4'-二(3-氨基苯)-2, 2'-双噻唑pH荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

（1）4,4'-二(3-硝基苯基)- 2,2'-双噻唑的合成：将0.0082mol二硫代乙二酰胺和30ml无水乙醇加入到三口烧瓶中，启动磁力搅拌，加热使二硫代乙二酰胺溶于无水乙醇中，用恒压滴液漏斗将0.0042mol的2-溴-3'-硝基苯乙酮滴加到二硫代乙二酰胺的无水乙醇溶液中，加热回流反应2-3h，反应完成后，抽滤，滤饼用50~60℃的热乙醇清洗3-4次；粗产品用1,4-二氧六环重结晶得纯品4,4'-二(3-硝基苯基)- 2,2'-双噻唑，产率87.8%；

（2）4, 4'-二(3-氨基苯基)-2, 2'-双噻唑的合成：磁力搅拌并加热条件下，将步骤（1）所制备的4, 4'-二(3-硝基苯基)-2, 2'-双噻唑0.0024mol溶解于100ml的DMF中，溶解后再加入0.2g六水合三氯化铁和0.3g活性炭粒，控制温度为75-85℃，将50%水合肼50ml溶于50ml无水乙醇中并滴加入上述加有六水合三氯化铁和活性炭粒的4, 4'-二(3-硝基苯基)-2, 2'-双噻唑溶液中，溶液由棕黄色变为墨绿色，并析出灰黑色固体，继续在75-85℃反应11-13h，反应结束后，冷却抽滤，将滤液蒸发除去DMF后，加入100ml蒸馏水，析出浅绿色固体，抽滤，水洗，所得滤饼用无水乙醇重结晶，得纯品4, 4'-二(3-氨基苯基)-2, 2'-双噻唑，产率78.7%。

步骤（1）中所述反应采用TLC跟踪监测，TLC所用展开剂为：V_乙酸乙酯：V_石油醚=1:1；步骤（2）中所述反应采用TLC跟踪监测，TLC所用展开剂为：V_乙酸乙酯：V_石油醚=1:1。其具体合成路线如图1所示。

所述的4, 4'-二(3-氨基苯)-2, 2'-双噻唑pH荧光探针用于pH的荧光检测的步骤为：

（1）将4, 4'-二(3-氨基苯)-2, 2'-双噻唑用DMSO溶解，配制成浓度为1mmol/l的荧光探针储备液；

（2）将2ml的v/v为1/3的DMSO/水体系和20µl荧光探针储备液加入荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测；

（3）用蒸馏水配制0.1M的H⁺溶液，将2ml的v/v为1/3的DMSO/水体系和20µl荧光探针储备液加入荧光比色皿中，进行pH滴定实验；以pH为横坐标，荧光强度F为纵坐标绘制图并进行Sigmoidal拟合，求得pK_a=3.10；通过线性拟合得到该探针的最佳线性响应范围为pH 2.53-3.58, 回归方程为：F=4577.02-1194.34ｘpH，线性系数为R² = 0.9990。

可逆性和稳定性实验证明该荧光探针对pH的测定具有良好的光稳定性和可逆性。

经实验验证，其它金属阳离子不干扰体系对H⁺的测定。

本发明的探针用于生物体内pH值的检测。

与现有技术相比，本发明作为选择性检测生物体内pH的荧光探针有如下优点：本发明所述荧光探针制备方法简单、快速；可用于极酸性条件下pH的检测；反应灵敏且选择性高；检测手段简单，只需要借助荧光光谱仪；该荧光探针还可用于生物成像。

附图说明

图1为本发明所述4, 4'-二(3-氨基苯)-2, 2'-双噻唑pH荧光探针的合成路线图；图2为实施例2中4, 4'-二(3-氨基苯)-2, 2'-双噻唑pH荧光探针的pH滴定荧光图；图3为4, 4'-二(3-氨基苯)-2, 2'-双噻唑pH荧光探针对pH响应的的工作曲线图；图4为实验例1中4, 4'-二(3-氨基苯)-2, 2'-双噻唑pH荧光探针在中性和酸性条件下与各种金属阳离子的荧光柱状图；图5为实验例2中4, 4'-二(3-氨基苯)-2, 2'-双噻唑pH荧光探针在不同pH条件下的可逆性检验图；图6为实验例2中4, 4'-二(3-氨基苯)-2, 2'-双噻唑pH荧光探针在不同pH条件下的光稳定性检测图；图7为实验例3中4, 4'-二(3-氨基苯)-2, 2'-双噻唑pH荧光探针在大肠杆菌内的荧光成像图,放大倍数为：63×10，图中白色圆圈内探针在共聚焦荧光成像仪下发显示的蓝色荧光。

具体实施方式

实施例1：一种4, 4'-二(3-氨基苯)-2, 2'-双噻唑pH荧光探针，结构如式1，。

4, 4'-二(3-氨基苯)-2, 2'-双噻唑pH荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

（1）4,4'-二(3-硝基苯基)- 2,2'-双噻唑的合成：将0.0082mol即2g二硫代乙二酰胺和30ml无水乙醇加入到100ml三口烧瓶中，启动磁力搅拌，加热使二硫代乙二酰胺溶于无水乙醇中，趁热用恒压滴液漏斗将0.0042mol即0.5g的2-溴-3'-硝基苯乙酮溶于20ml无水乙醇并滴加到二硫代乙二酰胺的无水乙醇溶液中，加热回流反应2-3h，采用TLC跟踪监测，TLC所用展开剂为V_乙酸乙酯：V_石油醚=1:1，R_f=0.28。在254nm紫外灯下显示土黄色荧光。反应完成后，抽滤，滤饼用50~60℃的热乙醇清洗3-4次；粗产品用1,4-二氧六环重结晶得纯品4,4'-二(3-硝基苯基)- 2,2'-双噻唑1.47g，产率87.8%，熔点＞300℃；

反应现象记录：滴入2-溴-3'-硝基苯乙酮后，反应约5分钟后出现橘黄色沉淀，继续反应，颜色逐渐变浅，最后变为土黄色。

¹H NMR(DMSO: δ/ppm): 8.842 ppm (s, 1H, Th-H); 8.735 ppm (s, 1H, Ar-H); 8.502 ppm (d, 1H, Ar-H); 8.266 ppm (d, 1H, Ar-H); 7.831 ppm (m, 1H, Ar-H)。

（2）4, 4'-二(3-氨基苯基)-2, 2'-双噻唑的合成：磁力搅拌并加热条件下，将步骤（1）所制备的4, 4'-二(3-硝基苯基)-2, 2'-双噻唑0.0024mol即1g溶解于100ml的DMF中，溶解后再加入0.2g六水合三氯化铁和0.3g活性炭粒，控制温度为75-85℃，将50%水合肼50ml溶于50ml无水乙醇中并滴加入上述加有六水合三氯化铁和活性炭粒的4, 4'-二(3-硝基苯基)-2, 2'-双噻唑溶液中，溶液由棕黄色变为墨绿色，并析出灰黑色固体，继续在75-85℃反应11-13h，采用TLC跟踪监测，TLC所用展开剂为V_乙酸乙酯：V_石油醚=1:1，R_f=0.44。在254nm紫外灯下显示蓝色荧光。反应结束后，冷却抽滤，将滤液蒸发除去DMF后，加入100ml蒸馏水，析出浅绿色固体，抽滤，水洗，所得滤饼用无水乙醇重结晶，得纯品4, 4'-二(3-氨基苯基)-2, 2'-双噻唑0.67g，产率78.7%，熔点242℃-243℃。

反应现象记录：水合肼滴入溶液后，溶液逐渐由棕黄色变成墨绿色，并有灰黑色固体生成。

¹H NMR(DMSO：δ/ppm): 8.114 ppm (s, 1H, Th-H)，7.258 ppm (s,1H, Ar-H)，7.131 ppm (d, 2H, Ar-H)，6.593 ppm (m, 1H, Ar-H)，5.240 ppm(s, 2H, N-H)。

其具体合成路线如图1所示。

实施例2：4, 4'-二(3-氨基苯)-2, 2'-双噻唑pH荧光探针用于pH的荧光检测的步骤为：

（1）将4, 4'-二(3-氨基苯)-2, 2'-双噻唑用DMSO溶解，配制成浓度为1mmol/l的荧光探针储备液；

（2）将2ml的v/v为1/3的DMSO/水体系和20µl荧光探针储备液加入荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，进行pH应该滴定实验。实验结果见图2。结果显示，随着待测样的加入，415nm处的荧光强度逐渐增强。仪器参数:激发波长和发射波长的狭缝宽度分别为2.5 nm、5.0 nm，荧光探针溶液的最大激发波长为: λ_ex为255 nm和最大荧光发射波长为: λ_em为415 nm。

实施例3：绘制4, 4'-二(3-氨基苯)-2, 2'-双噻唑pH荧光探针对pH响应的工作曲线：

用蒸馏水配制0.1M的H⁺溶液，将2ml的v/v为1/3的DMSO/水体系和20µl荧光探针储备液加入荧光比色皿中，进行pH滴定实验（pH变化范围为7.40-1.46）；以pH为横坐标，荧光强度F为纵坐标绘制图，所得工作曲线图见图3，根据工作曲线图进行Sigmoidal拟合，求得pK_a=3.10；通过线性拟合得到该探针的最佳线性响应范围为pH 2.53-3.58, 回归方程为：F=4577.02-1194.34ｘpH，线性系数为R² = 0.9990。

实验例1：4, 4'-二(3-氨基苯)-2, 2'-双噻唑pH荧光探针在添加入各种金属阳离子的中性和酸性条件下对pH的荧光检测：

在pH为7.40和pH 3.01的2mL DMSO/水 (1/3, v/v) 体系中均加入20µl荧光探针储备液，再分别加入其它的金属离子：0. Blank; 1.K⁺ (24mM); 2.Na⁺ (24mM); 3.Mg²⁺(0.5mM); 4.Ca²⁺ (2mM); 5.Al³⁺ (0.2mM); 6.Pb²⁺ (0.2mM); 7.Zn²⁺ (0.2mM); 8.Mn²⁺ (0.2mM); 9.Co²⁺ (0.2mM); 10.Cr³⁺ (0.2mM); 11.Ni²⁺ (0.2mM); 12.Hg²⁺ (0.2mM); 13.Cu²⁺ (0.05mM); 14.Bi⁺ (2mM); 15.Fe²⁺ (0.2mM); 16.Fe³⁺ (0.05mM)，分别测其荧光光谱，绘制不同金属阳离子对415nm处荧光强度的柱状图，实验结果见图4。实验验证结果显示，其它金属阳离子不干扰体系对H⁺的测定。

实验例2：4, 4'-二(3-氨基苯)-2, 2'-双噻唑pH荧光探针在不同pH条件下的可逆性和光稳定性的检测：

在2mL DMSO/水 (1/3, v/v) 体系中加入20µL荧光探针储备液，调节pH在7.40和2.01之间变化时，分别记录415 nm处荧光强度的变化。实验结果见图5，如图所示pH的降低会使荧光强度迅速升高，而快速升高pH至中性条件，则导致荧光强度瞬间淬灭，5次循环改变pH值后，酸性条件下的荧光强度仍然成功恢复。此外，探针对不同pH的响应和荧光恢复时间不超过1s。表明荧光探针对pH的响应具有很好的可逆性。

在pH 2.61, 3.31和7.40的DMSO/水 (1/3, v/v) 体系中，加入20 μL 荧光探针储备液，检测415 nm处的荧光强度随时间的变化。实验结果见图6，如图所示，2h内的荧光强度值基本保持不变，说明该荧光探针对外界空气、溶液体系等具有很好的光稳定性。

通过可逆性和稳定性实验证明本发明所述4, 4'-二(3-氨基苯)-2, 2'-双噻唑pH荧光探针对pH的测定具有良好的光稳定性和可逆性。

实验例3：4, 4'-二(3-氨基苯)-2, 2'-双噻唑pH荧光探针在大肠杆菌内的荧光成像检验：

将37℃含有大肠杆菌的LB培养基（胰蛋白胨19 g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10 g/L）放在180r/min的浓缩器上培养17 h，然后离心分离大肠杆菌。沉积物用无菌水洗涤然后使其悬浮在pH为5.02和1.21的缓冲溶液中培养，5min后加入DMSO溶解的荧光探针储备液使其最终浓度为20μM，最后放到摇床上振荡2h。共聚焦成像时将混合物涂到载玻片上，用波长为405 nm激光激发，收集发射波段为375-475 nm的蓝色荧光。实验结果如图7所示，探针在共聚焦荧光成像仪下发很弱的蓝色荧光，随着pH的减小，蓝色荧光逐渐增强。充分证明了本发明所述4, 4'-二(3-氨基苯)-2, 2'-双噻唑pH荧光探针能够用于生物体内pH值的检测，同时也能用作生物成像。