本发明涉及荧光纳米球的制备方法，特别是涉及一种包覆型的羧基化SiO2荧光纳米球的制备方法。
背景技术：
二氧化硅微球制备简单、性质稳定、表面易修饰、生物相容性好，且在生理条件下不降解，在化学、工程和生物医学等学科领域得到了广泛的应用。特别是功能化的二氧化硅荧光微球不仅具有优越的光学性能，还是出色的生物材料，将其通过表面功能基团与生物大分子特异性结合后，可以实现高灵敏度、高选择性的靶向结合，应用于分子示踪、免疫分析、光学仪器校正、药物释放等生物领域。
CN 1782020A公开了含有碲化镉荧光量子点的二氧化硅荧光微球的制备方法，其将作为荧光探针的碲化镉物理包埋在二氧化硅微球中，不仅毒性大，还易泄漏、淬灭。CN 105037662A公开了铕键合型纳米二氧化硅荧光微球的制备方法，文献(Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2017, 157, 286-296)也报道了在氨基化二氧化硅纳米球表面，通过磺酰胺键引入香豆素荧光化合物，然而，这两种荧光微球表面都缺少功能基团，不便后续生物学等方面的研究。唐倩倩等(化学学报, 2010, 68, 18, 1925-1929)报道的介孔二氧化硅荧光微球则是经二硫键引入荧光素，但是二硫键易在谷胱甘肽溶液中断裂，从而导致荧光泄露。
此外，文献报道的二氧化硅纳米球多采用反相微乳液法制备得到，其制备过程耗时较长。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种形态结构稳定、单分散性好、发光效率高的包覆型羧基化SiO2荧光纳米球的制备方法。
本发明所述包覆型羧基化SiO2荧光纳米球的制备方法是以具有双键的烯丙基荧光探针、甲基丙烯酸与硅烷偶联剂KH151为原料，聚合反应得到荧光聚合物，再通过化学键的作用，将其接枝在SiO2纳米球的表面，以制备得到包覆型羧基化SiO2荧光纳米球。
进一步地，本发明具体是通过下述各步骤来制备所述包覆型羧基化SiO2荧光纳米球的。
1)、取水、无水乙醇和氨水混和均匀，加入正硅酸乙酯，室温下进行搅拌反应，反应产物以水和无水乙醇洗涤、干燥，得到SiO2纳米球。
2)、将烯丙基荧光探针、硅烷偶联剂KH151、甲基丙烯酸和偶氮二异丁腈加入无水甲醇中，惰性保护下进行加热回流反应，蒸除溶剂甲醇后得到羧基化的烯丙基荧光探针-KH151聚合物。
3)、在无水甲苯中加入SiO2纳米球和羧基化的烯丙基荧光探针-KH151聚合物，惰性保护下进行加热回流反应，制备得到包覆型羧基化SiO2荧光纳米球。
本发明上述制备方法中，所述的烯丙基荧光探针是烯丙基-4-甲基香豆素、烯丙基荧光素、烯丙基罗丹明B、烯丙基咔唑中的任意一种。
本发明所述步骤1)中SiO2纳米球的制备中，所述水、无水乙醇、氨水与正硅酸乙酯的体积比为6～7∶15～16.5∶1.6～1.8∶1。
进而，是将所述原料混合后，在室温下搅拌反应0.5～3h。
本发明所述步骤2)中羧基化的烯丙基荧光探针-KH151聚合物的制备中，所述硅烷偶联剂KH151、偶氮二异丁腈、烯丙基荧光探针、甲基丙烯酸的质量比为1∶0.4～0.7∶0.8～1.8∶1～2。
进而，是将所述原料在65～70℃下回流反应6～8h。
本发明所述步骤3)中，优选将过量的羧基化的烯丙基荧光探针-KH151聚合物与SiO2纳米球在105～115℃下回流反应20～24h。
进一步地，本发明将SiO2纳米球与羧基化的烯丙基荧光探针-KH151聚合物回流反应的反应产物先后用水和乙醇反复洗涤，直至洗涤液不再检测出荧光，干燥后得到最终的包覆型羧基化SiO2荧光纳米球产品。
本发明首先采用自由基聚合的方法，将烯丙基荧光探针、甲基丙烯酸与KH151聚合得到羧基化的烯丙基荧光探针-KH151聚合物，再通过高温脱水缩合法，将该荧光聚合物经-Si-O-Si-键化学键和在SiO2纳米球表面，得到包覆型羧基化SiO2荧光纳米球。该荧光纳米球不仅具有羧基化功能基，还具有牢固的-Si-O-Si-键，避免了产品的荧光泄漏、淬灭。
与现有技术相比，本发明制备方法具有以下优点：1、将烯丙基荧光染料、甲基丙烯酸和乙烯基三乙氧基硅烷(KH151)经自由基聚合得到荧光聚合物，并通过化学键将该荧光聚合物键和在SiO2纳米球表面，使荧光微球不仅具有羧基功能基团，还保证了较高的微球整体发光效率，荧光染料稳定存在，不容易泄漏、淬灭。2、荧光纳米球的载体是无机材料SiO2，其具有许多高分子材料无法比拟的特性，如物理刚性、化学稳定性、在溶剂中可忽略的溶胀性、无毒性、胶体稳定性、高生物相容性、优异的光学透光性及表面易功能化等，尤其是表面羧基化的SiO2荧光纳米球，其活性羧基可以与多种无机离子或无机、有机、生物分子发生反应，在生物化学、化学分析等领域具有广泛的应用前景。3、本发明采用的烯丙基荧光染料中，烯丙基咔唑是近紫外或深蓝色光荧光材料，烯丙基荧光素和烯丙基香豆素是发绿光的荧光材料，烯丙基罗丹明B是近红外或发红光的荧光材料，由此能够制备获得具有蓝色、绿色和红色荧光的包覆型羧基化SiO2荧光纳米球。4、本发明采用溶胶-凝胶法制备得到SiO2纳米球，操作时间短，将其采用高温缩合法引入荧光聚合物，操作简便，且制备荧光微球的成本低廉。
附图说明
图1是SiO2纳米球的扫描电镜(SEM)图。
图2是SiO2纳米球的透射电镜(TEM)图。
图3是羧基化SiO2荧光纳米球(a)和SiO2纳米球(b)的红外光谱图。
图4是实施例1烯丙基4-甲基香豆素的紫外光谱图(插图)和荧光光谱图及其SiO2荧光纳米球的荧光光谱图(乙醇作溶剂)。
图5是实施例2烯丙基荧光素的紫外光谱图(插图)和荧光光谱图及其SiO2荧光纳米球的荧光光谱图(水作溶剂)。
图6是实施例3烯丙基荧光素的紫外光谱图(插图)和荧光光谱图及其SiO2荧光纳米球的荧光光谱图(水作溶剂)。
图7是实施例4烯丙基咔唑的紫外光谱图(插图)和荧光光谱图及其SiO2荧光纳米球的荧光光谱图(乙醇作溶剂)。
图8是实施例1～4的荧光显微镜图。
具体实施方式
下述实施例仅为本发明的优选技术方案，并不用于对本发明进行任何限制。对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1。
在100mL三口瓶中加入蒸馏水28mL、无水乙醇65mL、氨水7mL，混和均匀，再加入正硅酸乙酯(TEOS)4mL，室温下磁力搅拌反应1.5h。产物离心分离，以水和无水乙醇交替反复洗涤，50℃下真空干燥，得到SiO2纳米球。
图1和图2是所制备SiO2纳米球的SEM和TEM图，可知SiO2纳米球具有良好的球形度且单分散性好，为制备包覆型羧基化荧光纳米球奠定了基础。
称取间苯二酚3.3g(30mmol)，常温下缓慢加入浓硫酸60mL至间苯二酚完全溶解，置于冰水浴中，缓慢滴加乙酰乙酸乙酯3.9mL(1.95mmol)，滴加完毕后，继续反应1h。然后升温至室温，继续反应24h，将反应液倒入约300mL的冰水中并剧烈搅拌，出现灰白色沉淀，抽滤，无水乙醇重结晶，获得灰白色固体，50℃真空干燥箱中干燥，得到4-甲基-7-羟基香豆素。
称取4-甲基-7-羟基香豆素200mg(0.4mmol)、四丁基溴化铵(TBAB)0.28g(0.8mmol)，用三氯甲烷30mL溶解，加入无水碳酸钠0.2g、少量碘化钾及去离子水30mL，室温下搅拌15min，缓慢滴加3-溴丙烯0.11mL，30～40℃下搅拌约4h，以分液漏斗分出有机相，水相用三氯甲烷萃取，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，旋蒸后获得黄绿色固体，柱层析，得到4-甲基-7-O-烯丙基香豆素。
称取4-甲基-7-O-烯丙基香豆素0.030g、乙烯基三乙氧基硅烷(KH151)0.0337g、甲基丙烯酸(MAA)0.0337g、偶氮二异丁腈(AIBN)0.0138g和无水甲醇10mL，加入100mL三口瓶中，氮气保护下搅拌加热至70℃回流反应7h。反应产物在真空条件下蒸干溶剂甲醇，得到羧基化的4-甲基-7-O-烯丙基香豆素-KH151聚合物，充入氮气封存。
称取SiO2纳米球0.1g，用无水甲苯10mL将羧基化的4-甲基-7-O-烯丙基香豆素-KH151聚合物转移至三口瓶中，氮气保护下回流反应24h。反应结束后，将产物用乙醇和水反复洗涤，直至上清液没有荧光为止，真空干燥，得到包覆型羧基化SiO2荧光纳米球。
图4是4-甲基-7-O-烯丙基香豆素的紫外光谱图(插图)和荧光光谱图(a)，以及SiO2荧光纳米球的荧光光谱图(b)。所述荧光光谱图是以乙醇作为溶剂，在激发波长321nm下进行测定。从图中看出，羧基化SiO2荧光纳米球(b)的荧光发射光谱相对于4-甲基-7-O-烯丙基香豆素发生了红移(13nm)，由此可以表明4-甲基-7-O-烯丙基香豆素已经成功地接枝在SiO2纳米球的表面。
实施例2。
在100mL三口瓶中加入蒸馏水21mL、无水乙醇48.75mL、氨水5.25mL，混和均匀，再加入正硅酸乙酯(TEOS)3mL，室温下磁力搅拌反应2.5h。产物离心分离，以水和无水乙醇反复洗涤，50℃下真空干燥，得到SiO2纳米球。
按文献(J. Mater. Chem., 2009, 19, 2018-2025)方法，将荧光素2.00g，3-溴丙烯2.42g和无水碳酸钾4.97g投入反应瓶中，加入溶剂DMF 50mL，催化剂碘痕量，阻聚剂对苯二酚痕量，在无水无氧条件下，71℃反应25h，得烯丙基荧光素黄色粗品，氯仿重结晶，柱色谱得烯丙基荧光素纯品。
称取烯丙基荧光素0.0468g、KH151 0.0425g、MAA 0.0526g、AIBN 0.0186g和无水甲醇10mL，加入100mL三口瓶中，氮气保护下搅拌加热至70℃回流反应7h。反应产物在真空条件下蒸干溶剂甲醇，得到羧基化的烯丙基荧光素-KH151聚合物，充入氮气封存。
称取SiO2纳米球0.1g，用无水甲苯10mL将羧基化的烯丙基荧光素-KH151聚合物转移至三口瓶中，氮气保护下回流反应24h。反应结束后，将产物用乙醇和水反复洗涤，直至上清液没有荧光为止，真空干燥，得到包覆型羧基化SiO2荧光纳米球。
图3(a)是羧基化烯丙基荧光素-KH151接枝SiO2荧光纳米球的红外谱图，(b)是SiO2纳米球的红外谱图。(a)和(b)进行比较，在1300～1750cm-1间具有不同峰，且1633cm-1为羧基特征峰，故羧基已被成功接枝在SiO2纳米球表面。
图5是烯丙基荧光素的紫外光谱图(插图)和荧光光谱图(a)，以及SiO2荧光纳米球的荧光光谱图(b)。所述荧光光谱图是以水作为溶剂，在激发波长454nm下进行测定。从图中看出，羧基化SiO2荧光纳米球(b)的荧光发射光谱相对于烯丙基荧光素发生了红移(4nm)，由此可以表明烯丙基荧光素已成功地接枝在SiO2纳米球的表面。
实施例3。
在100mL三口瓶中加入蒸馏水14mL、无水乙醇32.5mL、氨水3.5mL，混和均匀，再加入正硅酸乙酯(TEOS)2mL，室温下磁力搅拌反应3h。产物离心分离，以水和无水乙醇交替反复洗涤，50℃下真空干燥，得到SiO2纳米球。
按文献(J. Mater. Chem., 2009, 19, 2018-2025)方法，将罗丹明B 240g，碳酸钾0.73g，3-溴丙烯2.65g投入反应瓶中，加入溶剂DMF 50mL，催化剂碘痕量，阻聚剂对苯二酚痕量，在无水无氧条件下，71℃反应25h，合成烯丙基罗丹明B粗品，经柱色谱得烯丙基罗丹明B纯品。
称取烯丙基罗丹明B 0.0555g、KH151 0.0486g、MAA 0.0676g、AIBN 0.023g和无水甲醇10mL，加入100mL三口瓶中，氮气保护下搅拌加热至70℃回流反应7h。反应产物在真空条件下蒸干溶剂甲醇，得到羧基化的烯丙基罗丹明-KH151聚合物，充入氮气封存。
称取SiO2纳米球0.1g，用无水甲苯10mL将羧基化的烯丙基罗丹明-KH151聚合物转移至三口瓶中，氮气保护下回流反应24h。反应结束后，将产物用乙醇和水反复洗涤，直至上清液没有荧光为止，真空干燥，得到包覆型羧基化SiO2荧光纳米球。
图6是烯丙基罗丹明B的紫外光谱图(插图)和荧光光谱图(a)，以及SiO2荧光纳米球的荧光光谱图(b)。所述荧光光谱图是以水作为溶剂，在激发波长558nm下进行测定。从图中看出，羧基化SiO2荧光纳米球(b)的荧光发射光谱相对于烯丙基罗丹明B发生了红移(4nm)，由此可以表明烯丙基罗丹明B已成功地接枝在SiO2纳米球的表面。
实施例4。
在100mL三口瓶中加入蒸馏水35mL、无水乙醇81.25mL、氨水8.75mL，混和均匀，再加入正硅酸乙酯(TEOS)5mL，室温下磁力搅拌反应2h。产物离心分离，以水和无水乙醇交替反复洗涤，50℃下真空干燥，得到SiO2纳米球。
将咔唑、氢氧化钾和3-溴丙烯投入反应瓶中，加入溶剂、催化剂和阻聚剂，在无水无氧和一定温度下反应，粗产品经柱色谱即得N-烯丙基咔唑纯品。
称取N-烯丙基咔唑0.0528g、KH151 0.0561g、MAA 0.0612g、AIBN 0.0216g和无水甲醇10mL，加入100mL三口瓶中，氮气保护下搅拌加热至70℃回流反应7h。反应产物在真空条件下蒸干溶剂甲醇，得到羧基化的烯丙基咔唑-KH151聚合物，充入氮气封存。
称取SiO2纳米球0.1g，用无水甲苯10mL将羧基化的烯丙基咔唑-KH151聚合物转移至三口瓶中，氮气保护下回流反应24h。反应结束后，将产物用乙醇和水反复洗涤，直至上清液没有荧光为止，真空干燥，得到包覆型羧基化SiO2荧光纳米球。
图7是烯丙基咔唑的紫外光谱图(插图)和荧光光谱图(a)，以及SiO2荧光纳米球的荧光光谱图(b)。所述荧光光谱图是以乙醇作为溶剂，在激发波长293nm下进行测定。从图中看出，羧基化SiO2荧光纳米球(b)的荧光发射光谱相对于烯丙基咔唑发生了红移(2nm)，由此可以表明烯丙基咔唑已成功地接枝在SiO2纳米球的表面。
图8依次是实施例1～4的荧光显微镜图。由图可以看出，羧基化SiO2荧光纳米球具有强的发光特征，表明烯丙基荧光探针均匀地接枝在微球表面，稳定性好。