一种检测炎症标志物活性的近红外荧光探针及其合成方法与流程

本公开属于物质检测技术领域，具体涉及一种检测炎症标志物活性的近红外荧光探针及合成方法。

背景技术：

外界环境和机体本身能够产生的损伤因子，它们会诱导细胞发生各种损伤性病变。为了控制和清除损伤因子，消灭和消化坏死细胞、组织，并修复机体的损伤，机体的局部和全身会发生一系列复杂的反应，这就是机体的防御性反应——炎症。正常的情况下，炎症是人体的自动防御性反应，有益于人体的健康，但有的情况下，炎症对人体也会是有害的。如果炎性反应长期存在，将会在组织内形成慢性炎症的微环境，会导致发生细胞dna损伤、细胞恶性突变，血管恶性增生等病变，并会加快细胞的恶性增殖和癌症的产生和发展。因此，对炎症相关标志物的快速、准确检测将会对指示炎症和预防癌症具有十分重要的意义。

lta4h(leukotrienea4hydrolase)是一种具有双重活性的酶，已有文献报道lta4h是一种参与宿主防御过程中多肽降解的蛋白质，该蛋白在炎症过程中表达含量升高，与炎症的发生发展密切相关。现在对于检测lta4h与筛选其抑制剂的探针是极其缺乏的，应用于细胞及活体内检测lta4h的探针更是少之又少。

公开内容

针对上述现有技术中存在的问题，本公开的一个目的是提供一种检测炎症标志物活性的近红外荧光探针。一种检测炎症标志物活性的近红外荧光探针，命名为花菁近红外荧光探针(cy-asp)对炎症标志物lta4h的检测表现出高选择性。

为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：

一种检测炎症标志物活性的近红外荧光探针，其结构式为：

当lta4h蛋白的活性中心识别该近红外荧光探针中相应的底物部分后，会切断酰胺键从而使探针荧光明显的增强。将其应用于体外检测与活细胞模型的研究中，都呈现出了良好的检测效果。

本公开的有益效果：

1.本公开的探针分子具有近红外吸收(670nm)与发射(720nm)，有效地较低了自吸收，提高了成像准确度。

2.基于酶的底物专一性与分子内电荷转移原理，设计合成出特异性检测lta4h活性的荧光探针cy-asp，该探针与lta4h反应后发出强烈的红色荧光，能够指示lta4h的氨肽酶活性，而且cy-asp对lta4h具有极高的选择性，不会被其他的氨肽酶切断。

3.本发明的探针分子具有较低的细胞毒性，对细胞的损伤小。

4.本发明的探针分子合成步骤相对简单、产率较高、容易纯化。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1是红外荧光探针cy-asp的质谱图；

图2是中间体c的质谱图；

图3是本发明荧光探针cy-asp与荧光团cy-nh2的紫外吸收光谱图，其中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为紫外吸收强度；

图4是本发明荧光探针cy-asp与lta4h反应随时间响应的发射的荧光谱图，其中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光发射强度；

图5是本发明荧光探针与细胞内相关氨基酸、氨肽酶、小分子等成分的选择性测定柱状图与荧光谱图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

研究表明，在近红外荧光(600nm-900nm)光区，生物样品的自发荧光和自吸收效果都很小，极大的降低了背景干扰。近红外荧光探针的吸收和发射光谱都在近红外区，探针的生物相容性好、毒性小。而且近红外荧光成像具有高选择性和灵敏度的优势，其在空间分辨率和成像深度方面也有一定的优势。

一种上述近红外荧光探针的合成方法，所述方法为以原料a和原料b为起始原料，包括进行酰胺化反应，反应产物脱除叔丁氧羰基得到cy-asp。

所述原料a(cy-nh2)的化学式为(e)-2-(2-(6-氨基-23-二氢-1h-呫吨-4-基)乙烯基)-1-乙基-33-二甲基-3h-吲哚-1-鎓(引自：chen,hua；dong,baoli；tang,yonghe；lin,weiying-[chemistry-aeuropeanjournal,2015,vol.21,#33,p.11696-11700])；结构式为：

所述原料b的化学式为4-(苄氧基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-氧代丁酸(boc-l-天冬氨酸-4-苄酯，aladdin，cas:7536-58-5)；其结构式为：

其中，boc为叔丁氧羰基。

优选的，反应路线如下：

一种上述近红外荧光探针的合成方法，具体步骤为：

1)将原料b溶于二氯甲烷中，加入羧基活化剂，进行活化反应后获得活化中间体；

2)将步骤1)得到的活化中间体与原料a进行酰胺化反应得到酰胺化中间体c；

3)将中间体c在酸性条件下脱除叔丁氧羰基得到cy-asp。

一种上述近红外荧光探针的合成方法，具体步骤为：

1)将原料b溶于二氯甲烷中，加入羧基活化剂，加入助溶剂dmf，进行活化反应后获得活化中间体；

2)将步骤1)得到的活化中间体与原料a在室温下搅拌进行氨基酰胺化反应，反应完成后，旋干溶剂，经硅胶柱层析法分离提纯得到中间体c；

3)将步骤2)得到的中间体c加入三氟乙酸、二氯甲烷在室温下搅拌，反应结束后，加入氢氧化钠溶液，萃取，将有机相旋干，硅胶柱层析分离提纯得到cy-asp。

优选的，步骤1)中所述羧基活化剂为hatu与dipea、edc与hobt、dcc与dmap中的一种混合物；优选的，步骤1)中原料b与羧基活化剂的摩尔比为0.1-0.3mmol：0.2-0.6mmol；优选的，1g原料b对应的二氯甲烷、dmf的体积分别为180-200ml、13-17ml；优选的，所述步骤1)中羧基活化的温度为0-5℃，优选为0-2℃；优选的，所述步骤1)中羧基活化的时间为20-60min，优选为30-40min。

优选的，所述步骤2)中酰胺化反应的温度为20-25℃；优选的，所述步骤2)中酰胺化反应的时间为18-26h，优选为20-24h；优选的，所述步骤2)中原料a和原料b摩尔比为1:1.5～2；优选的，硅胶柱层析的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合物，二氯甲烷和甲醇的体积比为18-22：1。

优选的，1g原料a对应的步骤3)中的三氟乙酸、二氯甲烷的体积为12-15ml、255-257ml；优选的，所述步骤3)中氢氧化钠溶液的溶质的体积分数为8-12％；优选的，所述步骤3)中萃取通过二氯甲烷和水的混合物。

优选的，所述步骤3)中脱除叔丁氧羰基的温度为20-25℃；优选的，所述步骤3)中脱除叔丁氧羰基的时间为1-2h；优选的，所述步骤3)中硅胶柱层析洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合物，二氯甲烷和甲醇的体积比为13-17:1。

上述红外荧光探针cy-asp在检测lta4h蛋白的活性中的应用。

上述红外荧光探针cy-asp在筛选抗炎药物中的应用。

下面结合实施例对本发明进一步说明

实施例1

近红外荧光探针的合成。

原料a和原料b为参照参考文献制备得到。

在氮气的保护下，将原料b(76mg，0.2mmol)，hatu(152mg，0.4mmol)和dipea(50μl，0.4mmol)溶于15ml二氯甲烷，加入到50ml的两口烧瓶中，加入1mldmf助溶。0℃下反应30min，活化羧基。再加入原料a(39mg，0.1mmol)。20℃搅拌反应24h。反应完成后，旋干溶剂，经硅胶柱层析法分离提纯，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝20:1。最后得到蓝色的中间体c。

在氮气的保护下，将中间体c加入到50ml的两口烧瓶中，再将0.5ml三氟乙酸、10ml二氯甲烷加到烧瓶中，脱除叔丁氧羰基保护基团，20℃搅拌，薄层层析板监测反应终点。反应结束后，用10％氢氧化钠中和剩余的三氟乙酸。再通过二氯甲烷与水萃取，留有机相，旋干。随后，经硅胶柱层析法分离提纯，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝15:1。最后得到纯净蓝色的cy-asp(24mg，0.04mmol，产率40％)。

实施例2

近红外荧光探针的合成。

原料a和原料b为参照参考文献制备得到。

在氮气的保护下，将原料b(91.2mg，0.24mmol)，hatu(182.4mg，0.48mmol)和dipea(60μl，0.48mmol)溶于18ml二氯甲烷，加入到50ml的两口烧瓶中，加入1.5mldmf助溶。2℃下反应30min，活化羧基。再加入原料a(46.8mg，0.12mmol)。23℃搅拌反应22h。反应完成后，旋干溶剂，经硅胶柱层析法分离提纯，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝18:1。最后得到蓝色的中间体c。

在氮气的保护下，将中间体c加入到50ml的两口烧瓶中，再将0.7ml三氟乙酸、12ml二氯甲烷加到烧瓶中，脱除叔丁氧羰基保护基团，23℃搅拌，薄层层析板监测反应终点。反应结束后，用12％氢氧化钠中和剩余的三氟乙酸。再通过二氯甲烷与水萃取，留有机相，旋干。随后，经硅胶柱层析法分离提纯，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝17:1。最后得到纯净蓝色的cy-asp(28.8mg，0.048mmol，产率40％)。

效果测试：

将染料分子溶解在水溶性有机溶剂，水溶性有机溶剂为生理盐水、tris-hc缓冲液、乙腈、二甲亚砜。

分别研究了探针cy-asp在ph＝7.4缓冲水溶液及各种常见的有机试剂中的光物理性质并将其用于活细胞的成像实验。

活细胞的染色方法是将培养好的细胞放于含有探针分子的缓冲溶液中孵育，孵育一定的时间后除去孵育液，进行激光共聚焦成像。

探针与lta4h反应的紫外吸收、荧光发射及选择性实验：

对照组的组成包括：cy-asp(10μm)、tris-hcl(100mm)、nacl(100mm)、ph＝7.4；实验组的组成包括：cy-asp(10μm)、tris-hcl(100mm)、nacl(100mm)、ph＝7.4、lta4h(4μg/ml)。

测定cy-asp与荧光团原料a的紫外吸收光谱图，其光谱图显示于图3。横坐标为波长(nm)，纵坐标为紫外吸收强度，发现cy-asp与原料a相比在吸收波长上有20nm的移动。测定对照组的发射波长，并测定实验组随时间变化的发射波长变化。其光谱图显示于图4。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光发射强度。由图4可以得到，随着孵育时间的继续延长，荧光强度也持续性增强，最大激发也由720nm蓝移到了710nm。图5为cy-asp对多种的生物学相关成分的响应情况，已检测的生物学相关成分包括各种氨肽酶(氨肽酶n、亮氨酸氨肽酶、甲硫氨酸氨肽酶)，氨基酸(甘氨酸，丙氨酸，半胱氨酸，赖氨酸，精氨酸)，盐(zn²⁺,mg²⁺,ca²⁺)，葡萄糖和维生素c。如图5所示，cy-asp只有当lta4h存在时，荧光强度有明显的增强。这个说明与生物体内其他组分相比，cy-asp对lta4h有极好的选择性，可以用在复杂的细胞及活体生物环境中，特异性检测lta4h活性。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。