一种比率型荧光探针的制备方法及其应用与流程

本发明涉及一种针对三价铁离子和植酸的快速检测的比率型荧光探针的制备方法及其应用。

背景技术：

植酸(pa)，又称为肌醇六磷酸，在大豆和谷物等植物的种子中存在广泛。植酸在日常生活中通常用作抗氧化剂、螯合剂以及保鲜剂等，并以其独特的结构和化学性质而在食品、日用化工、医药以及金属加工和高分子工业等领域得到广泛应用。为了更进一步了解其生理作用，植酸的定性和定量分析变得尤为重要。目前，最常用的植酸检测方法是色谱分析法，但该方法存在仪器价格昂贵，检测成本高，操作人员需经专业培训等不足，难以用于现场检测。

荧光分析法由于其操作简便、灵敏度高、选择性好等优点而具有显著的检测优势，在食品安全和环境监测等领域受到广泛关注。但单一荧光探针的荧光强度需要严格控制检测条件才能获得精确的检测结果，外界环境的变化、检测底物的浓度以及仪器的稳定性均会对检测结果产生很大影响。因此，研究操作简单、灵敏度高、稳定性好的新型荧光探针体系实现样品中植酸的定量分析具有重要意义。

与传统单一发射的荧光探针相比，比率型荧光探针通过同时检测同一激发波长下不同波长处的荧光强度可以克服以上因素对检测结果的干扰。目前，比率型荧光探针已应用于金属离子、溶液ph、温度以及生物小分子等物质的检测中。

碳点是一种新型的碳纳米荧光材料，不仅具有优异的光学性能和小尺寸特性，同时具有良好的生物相容性和绿色无毒等性能，在环境检测和生物传感等领域得到广泛应用。利用性质不同的钝化剂对碳点的表面进行修饰，能够改变碳点的性能，从而拓宽其应用范围。由于pa与fe³⁺间具有非常强的络合能力，基于此设计出一种能够高灵敏、快速、低成本以及选择性识别fe³⁺的比率型荧光探针，同时通过荧光恢复机制检测pa，具有十分重要的意义。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种比率型荧光探针的制备方法，

本发明的另一个目的在于提供上述比率型荧光探针在三价铁离子和pa检测中的应用。

为此，本发明所采用的技术方案如下：

(1)制备比率型荧光探针；

(2)配置一定浓度的pa标准溶液；

(3)向荧光探针溶液中加入三价铁，使探针逐渐荧光淬灭，得到探针/三价铁溶液；

(4)向步骤(3)中荧光淬灭的溶液中加入pa，使探针荧光恢复；

(5)测定中探针/三价铁和pa反应前后的荧光强度，根据pa浓度和相对荧光强度变化值之间的关系建立标准曲线；

(6)定量检测：测定待测样品和探针/三价铁溶液反应前后的荧光强度变化，计算相对荧光强度变化值，对比步骤(5)中获得的标准曲线，得到待测样品中pa的含量。

上述方法中，比率型荧光探针的制备方法包括：

s1，包埋红量子点的二氧化硅纳米颗粒的制备：

将曲拉通x-100和正己醇依次加入到环己烷中，混合均匀之后加入红量子点，于5～40℃搅拌5～30min分钟，形成微乳液体系；随后向所述微乳液体系中加入正硅酸乙酯和氨水，室温反应24h，反应结束后向该反应体系加入36ml的异丙醇进行破乳，得到絮状沉淀物，将该絮状沉淀物离心、醇洗多次，直至最后一次的离心上清液无荧光信号为止，冻干后得到包埋红量子点的二氧化硅纳米颗粒，

其中，所述曲拉通x-100的质量用量以所述红量子点的体积计为3.5～4.0g/1ml；所述正己醇的体积用量以红量子点的体积计为4～5μl/1μl；所述环己烷的体积用量以红量子点体积计为15～20μl/1μl；所述正硅酸乙酯的体积用量以红量子点的体积计为0.1～0.2μl/1μl；所述氨水的质量用量以红量子点的体积计为4～5g/1ml；所述异丙醇的体积用量以所述反应体系的体积计为3～4ml/1ml；

s2，包制备氨基化修饰的包埋红量子点的二氧化硅纳米颗粒：

将所述包埋红量子点的二氧化硅纳米颗粒均匀分散在无水乙醇中，向该反应液快速加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，使用蛇形冷凝管油浴加热至85～95℃回流；反应完成后，使其自然冷却至室温，离心分离该产物，之后将其分散于超纯水中，得到氨基化修饰的包埋红量子点的二氧化硅纳米颗粒分散液，

其中，所述无水乙醇的质量用量以包埋红量子点的二氧化硅纳米颗粒质量计为8～12ml/1mg；所述3-氨丙基三乙氧基硅烷体积用量以包埋红量子点的二氧化硅纳米颗粒质量计为50～75μl/1mg，

s3，蓝量子点溶液的制备：

将赖氨酸以及柠檬酸溶于超纯水中，固体全部溶解后转移至聚四氟乙烯反应釜中于150～250℃下反应4～6h，之后利用透析袋将反应釜中的溶液在超纯水中透析20～50h，透析后的蓝量子点储存在4℃冰箱中，

其中，所述赖氨酸和柠檬酸的物质的量分别为4～6mmol和9～11mmo；所述透析袋的截留分子量为500da。

s4，比率型荧光探针的制备：

称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺分别溶解于超纯水中，之后与步骤s3制备的蓝量子点溶液混合，黑暗条件下反应搅拌27～33min；随后向上述反应液中加入步骤2制备的氨基化修饰的包埋红量子点的二氧化硅纳米颗粒分散液，并在室温下反应12h；反应结束后，离心分离该产物，得到所述比率型荧光探针，

其中，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐质量用量以所述蓝量子点溶液的体积计为30mg/1ml；所述n-羟基琥珀酰亚胺质量用量以所述蓝量子点溶液的体积计为70mg/1ml。

相对荧光强度变化值根据公式(f-fa)/fa×100％计算，其中fa表示探针/三价铁的荧光强度，f表示探针/三价铁与不同浓度pa反应后的荧光强度。

在步骤(3)中，具体步骤为分别取多组相同体积的0.5～1ml比率型荧光探针溶液于石英比色皿中，分别加入10μl浓度不同的氯化铁，室温下静置15min使其完全反应。

在步骤(5)中，具体步骤为分别取多组相同体积的0.7ml比率型荧光探针溶液于石英比色皿中，加入10μl浓度为10mm的氯化铁溶液，静置15min使其完全反应，之后分别加入10μl不同浓度的植酸水溶液。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、相比其他的比率型荧光探针，本探针在检测时，具有相当优秀的特异性。并且稳定性好、制备简单本、价格便宜等优点，而且大大缩短了反应时间，对三价铁离子的检测低至0.83μm。通过对比可以发现，本探针比单一的蓝量子点荧光探针的检测范围更宽，检测限更低。

2、本研究的设计采用荧光“off-on”模式，由于fe³⁺对于蓝量子点的荧光淬灭作用以及植酸与fe³⁺之间强烈的相互作用，实现了该比率型荧光探针对于植酸的特异性检测。通过3δ/k公式计算可以得到其检测限(1.5μm)。与现有的植酸检测方法(离子质谱法、高效液相色谱法、电化学法等)相比，其检测限具有可比性。

针对以上问题，我们设计了一种比率型荧光探针微球，能够选择性的识别三价铁离子，并且通过荧光恢复机制检测植酸的新方法。该技术量子点具有荧光强度高，毒性低、稳定性好，经修饰以后生物相容性较好，耐光性好，荧光寿命长和抗漂白能力强等优点，同时该方法操作简单、检测快速且灵敏度高。另外,采用该技术对实际水样加以实际检测应用,效果良好。

附图说明

图1为本发明制备方法的流程图；

图2为本发明的实施例1中蓝量子点的tem图；

图3为本发明的实施例1中红色发射的包埋量子点的表面氨基化修饰的二氧化硅纳米微球的tem图；

图4为本发明的实施例1中制备的蓝量子点，红色发射的包埋量子点的表面按计划修饰的二氧化硅纳米微球以及比率型荧光探针的荧光光谱图；

图5为本发明的实施例1中制备的蓝量子点，红色发射的包埋量子点的表面按计划修饰的二氧化硅纳米微球以及比率型荧光探针的红外光谱图；

图6为本发明的实施例2制得的比率型荧光探针在不同浓度的三价铁离子浓度下的荧光发射光谱以及相对荧光强度比值f0/fa和三价铁离子浓度的关系；

图7为本发明的实施例3制得的比率型荧光探针在不同浓度植酸下的荧光发射光谱以及相对荧光恢复指数(f0-fa)/fa和植酸浓度的关系。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：

参见图1，一种比率型荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

s1、蓝量子点的制备：

本实施例采用高温热分解法制备表面羧基修饰的蓝量子点。具体步骤为：将0.73g赖氨酸以及2.1g柠檬酸溶于20ml超纯水中，固体全部溶解后转移至装有50ml聚四氟乙烯的反应釜中，在200℃下反应5h，之后将反应釜自然冷却至室温。为除去反应产物中的杂质和小分子，利用分子量为500da的透析袋将该溶液在超纯水中透析36h，得到表面羧基修饰的蓝量子点溶液，将该蓝量子点溶液储存在4℃冰箱中，备用。其tem图见图2。由图可见，制备的蓝量子点呈现球状，分散性较好。

s2、包埋红量子点的二氧化硅纳米颗粒的制备：

在100ml圆底烧瓶中依次加入7.7ml环己烷，1.42g曲拉通x-100和1.8ml正己醇，混合均匀之后加入400μl红量子点溶液，将该体系磁力搅拌10min形成稳定的反相微乳液体系。随后向烧瓶中加入50μl正硅酸乙酯和200μl氨水，室温反应24h。反应结束后向该反应体系加入36ml的异丙醇进行破乳，得到絮状沉淀物。将该反应物离心、醇洗多次，直至最后一次的离心上清液无荧光信号为止，得到包埋红量子点的二氧化硅纳米颗粒产物。将该产物冻干，用于后续反应。

包埋红量子点的二氧化硅纳米颗粒的氨基化修饰：将4mg步骤s2制得的冻干产物均匀分散在40ml无水乙醇中，向该反应液快速加入250μl3-氨丙基三乙氧基硅烷，磁力搅拌加热至90℃回流，反应24h。冷凝管的上端连接装有氯化钙的干燥管，防止空气中含有的水蒸气进入该反应体系。反应完成后，使其自然冷却至室温，离心分离该产物，之后将其分散于4ml超纯水中，得到氨基化修饰的包埋红量子点的二氧化硅纳米颗粒分散液。其tem图见图3。由图3可以看出，该纳米颗粒呈球形，颗粒分布均匀，粒径尺寸介于30-40nm之间。由tem图谱可以确定红量子点已成功包埋到二氧化硅内部。

s3、比率型荧光探针的制备：

称取180mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和420mgn-羟基琥珀酰亚胺分别溶解于1ml超纯水中，之后与6ml步骤s1制备的蓝量子点溶液混合，黑暗条件下反应搅拌30min。随后向上述反应液中加入1ml前述制备的氨基化修饰的包埋红量子点的二氧化硅纳米颗粒分散液，并在室温下反应12h。反应结束后，离心分离该产物，将分离后的产物，得到所述比率型荧光探针。

将上述比率型荧光探针分散于8ml去离子水中，得到比率型荧光探针水溶液，并储存在4℃冰箱备用。其红外光谱图见图4。分别检测空白二氧化硅颗粒和包埋红量子点的二氧化硅纳米颗粒的红外光谱，以空白二氧化硅纳米颗粒作为参照，对比二者结构上的异同。此外，相比于空白二氧化硅纳米粒子，包埋红量子点的二氧化硅纳米颗粒的红外谱图出现了多个不同的吸收峰，1675cm^-1、950cm^-1和2980cm^-1分别表示的是c＝o的伸缩振动吸收峰、o-h的面外弯曲振动吸收峰以及c-h的伸缩振动吸收峰。综上，ftir图谱进一步证明已成功将合成包埋红量子点的二氧化硅纳米颗粒。

其荧光光谱见图5，由图5可以看出，该纳米探针在380nm的激发波长下，在445nm和633nm处有非常明显的荧光峰，它们分别代表蓝量子点和红量子点的荧光发射峰。

实施例2：三价铁离子浓度的检测

取0.7ml实施例1制备的比率型荧光探针溶液于1cm×1cm的石英比色皿中，分别加入10μl浓度不同的三价铁离子，室温下静置15min使其完全反应。以380nm为激发波长，400-750nm为扫描范围，在狭缝宽度均为2.5nm的条件下测定其荧光发射光谱。结果见图6。

由图5可以发现，随着加入的三价铁离子浓度不断升高，比率型荧光探针在445nm处的荧光强度不断降低，而其在633nm处的荧光强度基本没有变化。同时也可以看出，比率型荧光探针的荧光强度比(f0/fa)与三价铁离子浓度在9-120μm之间呈现出良好的线性关系(r²＝0.995)，检测限为0.26μm。

取一组比率型荧光探针溶液于石英比色皿中，加入未知浓度的三价铁离子溶液，室温下静置10min使其完全反应。以380nm为激发波长，400-750nm为扫描范围，在狭缝宽度均为2.5nm的条件下测定其荧光发射光谱。根据线性关系计算出三价铁离子浓度为18.8μm，该结果与icp检测结果相同。

实施例3：植酸浓度的检测

取0.7ml实施例1制备的比率型荧光探针水溶液于1cm×1cm的石英比色皿中，分别加入10μl浓度为10mm的氯化铁溶液，室温下静置15min使其完全反应，之后再分别加入10μl不同浓度的植酸水溶液。以380nm为激发波长，400-750nm为扫描范围，在狭缝宽度均为2.5nm的条件下测定该比率型荧光探针的荧光发射光谱。结果见图7。

由图6可以看出，随着pa的不断加入，比率型荧光探针在445nm处蓝量子点的荧光逐渐恢复，而红量子点在633nm处的荧光强度没有明显变化。该比率型荧光探针的荧光恢复指数(f0-fa)/fa与pa的浓度在0.08-1.6mm之间呈现出良好的线性关系(r²＝0.990)。其中，f0和fa分别表示比率型荧光探针在445nm和633nm处的荧光强度。

取一组比率型荧光探针溶液于石英比色皿中，加入10μl浓度为10mm的氯化铁溶液，室温下静置15min使其完全反应。再加入未知浓度的植酸溶液，以380nm为激发波长，400-750nm为扫描范围，在狭缝宽度均为2.5nm的条件下测定其荧光发射光谱。根据线性关系计算出植酸浓度为0.94mm，该结果与高效液相色谱法检测结果相同。

实施例4：荧光比率探针的选择性

为了测试该比率型荧光探针对三价铁离子检测的特异性，我们选取了一些常见的金属离子进行测定。在实施例1制备的比率型荧光探针水溶液中分别加入10mm干扰物质，如k⁺,fe²⁺,na⁺,mg²⁺,ca²⁺,zn²⁺,cu²⁺,ni²⁺,cr³⁺,pb²⁺,al³⁺,ba²⁺，在与fe³⁺相同的检测条件下进行荧光测定。实验结果表明，除去fe³⁺之外的其它干扰物质都不会引起比率型荧光探针荧光强度比的变化，说明比率型荧光探针可以对三价铁离子选择性识别。

为了确定比率型荧光探针对植酸检测的特异性，我们选取了一些常见物质(金属阳离子、阴离子、牛血清蛋白)进行干扰性测定。向探针分散液中加入10mmfe³⁺，静置15min，待其稳定后，向该比率型荧光探针-三价铁离子复合体系的分散液中加入10mm干扰物质，如bsa,k⁺,na⁺,mg²⁺,zn²⁺,cu²⁺,fe²⁺,cl^-,so4^2-,no^3-等，在与植酸的检测条件相同的情况下进行荧光测定。实验结果表明，除去植酸之外的其它干扰物质均不能导致该探针的荧光恢复，说明比率型荧光探针可以对植酸选择性识别。