一种高稳定性决明子色素提取方法与流程

本发明涉及从天然色素提取领域，更具体地，涉及一种高稳定性决明子色素提取方法。

背景技术：

众所周知，色素在食品加工环节等发挥着重要作用，而色素又分为合成色素和天然色素，虽然合成色素与天然色素相比具有制作成本低，简单易得等优点，但合成色素中含有很多对人体有害的化学物质，在食品中添加合成色素容易引发癌变、畸形等各种疾病。随着人们生活水平的提高，人们的食品安全意识也在逐渐增强，绿色健康的食品受到越来越多人的偏爱，故而众多商家和研究人员开始集中于天然色素的开发和利用。

天然色素是来源于天然植物的根、茎、叶、花、果实和动物、微生物等可以食用的色素，使用较多的是植物性色素。天然色素种类繁多，且绝大多数无毒副作用，广泛用于饮料、糖果、糕点、酒类等食品和医疗保健品、化妆品的着色。

有些还具有药理作用和营养价值，例如茶色素不仅着色效果好，还具有抗氧化、调节血糖血脂等作用，姜黄素具有着色强度好、抗炎、抗肿瘤、防治老年斑等作用，是色素行业消费的主流，发展十分迅速。

决明子是植物决明或小决明的成熟干燥的种子，其中不仅含有丰富的碳水化合物、氨基酸和维生素，还含有许多药用成分。早在《本草纲目》、《本经》、《中华本草》、《本草经疏》等医书中便有诸多关于决明子的记载，其味甘、苦、咸，性微寒，具有降血压降血脂，通肠排便的作用，还有清肝明目的功效。民间常用生决明子炒熟放凉或直接用水煎服，有保健作用。现代医学家对决明子的有效成分进行了大量研究，发现决明子中的大黄素、蒽醌化合物、决明子素及微量金属元素等有效成分对人体的疾病治疗发挥着重要功效。决明子中不仅含有丰富的药用成分，还含有大量色素，因此利用决明子提取色素为天然色素的开发提供了一条可行之径。

目前国内天然色素的研发重点主要在于寻找更多可作为色素提取原料的天然植物以及探索各天然色素相匹配的提取精制方法。但是，天然色素由于存在稳定性差、着色弱等缺点，制约了我国天然色素的应用。

乙醇浸渍法是天然色素提取常用的方法，缺点是需回收大量的有机溶剂，且分离效率不高，溶剂对产品有一定的影响，其优点是对色素的溶解能力强，化学性质稳定，对设备腐蚀性小，溶剂与水不互溶，分离法工艺原理简单，操作方便，能够满足大规模工业化生产的需要。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种高稳定性决明子色素提取方法，在乙醇浸渍提取的基础上，辅助超声提取，并且在提取过程中注重对色素大分子的保护，不仅大大提高了色素的提取率，而且增加了决明子色素的稳定性。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种决明子色素提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤s1：将决明子粉碎得决明子粉末；

步骤s2：以质量浓度为30％～70％的乙醇溶液为提取溶剂，浸泡决明子粉末，于50℃～70℃的恒温水浴中超声辅助浸提一定时间；利用超声波的“空化”作用，将有机大分子链破碎成小分子，可以缩短浸提时间，超声时间过长，“空化”作用会将色素大分子继续破碎成更小分子，使色素降解，反而降低色素提取率。

步骤s3：加入氨基酸，继续超声辅助浸提一定时间，之后静置，取上清液；加入氨基酸的作用是对已提取的色素分子进行保护，超声搅拌，让氨基酸充分分散，分散的氨基酸和色素分子通过范德华作用力结合成超分子化合物，不仅使已提取的色素避免被降解，同时未提取的色素继续被浸提出来，提高色素的提取率。多余的氨基酸和其它蛋白质、脂肪酸被沉降去除。上清液为氨基酸和色素的均匀混合物，氨基酸加大了色素的分子量，又具有提高色素稳定性的作用，以及提高色素的耐热和耐光性。优选地，氨基酸为α-氨酸酸，具体的，可以为谷氨酸、天门冬氨酸中的一种或两种组合。

步骤s4：旋转蒸发去除上清液中多余的乙醇提取溶剂；多余的乙醇会对色素的稳定性造成影响。旋转蒸发的温度为60℃～80℃。

步骤s5：加入有机酸混合均匀，调节ph值至3～6，优选地，超声搅拌；有机酸含有游离的氢离子，可以保护色素中的羟基，也具有提高色素稳定性的作用，以及提高色素的耐酸耐碱性。优选地，有机酸为苯甲酸、水杨酸、酒石酸、草酸、苹果酸、柠檬酸中的一种或多种，上述有机酸均为可食用的，增加色素的绿色环保性。

步骤s6：加入环糊精，混合均匀，优选地，超声搅拌；环糊精的环内具有疏水性，环外具有亲水性，色素和氨基酸被包容在内腔中，环糊精具有包埋的保护作用，进一步提高色素的耐热、耐光、耐酸耐碱、抗氧化的性质，同时也可改善色素的亲水性。

步骤s7：加入维生素c和维生素e混合均匀，优选地，超声混合，维生素c为亲水性，维生素e具有疏水性，混合后，维生素c分布于环糊精外，维生素e分布于环糊精内腔，全面提高色素的抗氧化性。

步骤s8：喷雾干燥，得色素粉末。

从上述技术方案可以看出，本发明在乙醇浸渍提取的基础上，辅助超声提取，并且在提取过程中通过增加可食用的氨基酸作为保护剂和稳定剂，提高色素的稳定性以及提高色素的提取率，通过增加有机酸的酸碱调节剂，使决明子色素的ph值处于色素最稳定的范围内，通过增加环糊精的包埋剂，提高色素的稳定性以及提高色素的亲水性，拓宽其应用范围，通过在增加环糊精后的溶液中增加亲水性vc和疏水性ve的抗氧化剂，使环糊精体外和腔内均分布抗氧化剂，提高色素的抗氧化性能。从整体上看，本发明工艺过程简单，无高温高压等剧烈反应，无有毒试剂的引入，不仅提高了决明子色素提取率，而且大大提高了其耐光、耐热、耐酸碱、耐还原和耐氧化的稳定性和亲水性，具有大规模工业化应用前景。

附图说明

图1是其它因素不变时乙醇浓度与吸光度之间的关系曲线图；

图2是其它因素不变时决明子的质量与50％乙醇的体积比(即料液比)与吸光度的关系曲线图；

图3是其它因素不变时温度与吸光度的关系曲线图；

图4是其它因素不变时提取时间与吸光度的关系曲线图；

图5是其它因素不变时提取时间与吸光度的关系曲线图，在提取时间为20min时加入氨基酸；

图6是光照实验中时间与吸光度的关系图；

图7是耐高温实验中温度与吸光度的关系图；

图8是稳定性改善后的色素提取液光照实验中时间与吸光度的关系图；

图9是稳定性改善后的色素提取液耐高温实验中温度与吸光度的关系图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式作进一步的详细说明。

本发明公开了一种决明子色素提取方法，具体步骤如下：

1、决明子样品预处理

将买来的决明子用高速万能粉碎机进行粉碎，收集粉碎后的决明子粉末放置在避光干燥处备用。

2、提取色素

以乙醇溶液为提取剂，超声辅助浸提一定时间，设定提取温度，之后静置，取上层的上清液，离心处理，得高浓度的色素提取液。

超声波辅助萃取是近年来一个新兴的萃取技术，利用超声波产生的强烈的空化效应、机械振动、高加速度、乳化、扩散、击碎和搅拌作用，增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力。

为了优化超声辅助提取时间、提取温度、以及乙醇提取液的量与浓度，本发明分别进行以下实验，

1)乙醇浓度参数优化

准确称取5份1.0g的决明子粉末于锥形瓶中，分别加入30％、40％、50％、60％、70％的乙醇溶液各30ml，编号备用。再将五只锥形瓶放入超声波清洗机中，在60℃下超声提取30min后，各取10ml色素提取液的上清液置于低速离心机中，设定转速为4000r/min,离心十分钟后，取上清液进行稀释，分别测定每份色素提取液的最大吸光度。平行测定三次取平均值。

乙醇浓度与吸光度的关系曲线如图1所示，可见，乙醇浓度为50％时，决明子色素的吸光度值最大，即色素提取率最高。随着乙醇浓度的升高，色素提取率呈下降趋势，可能是因为乙醇浓度过大，破坏色素稳定性的原因。乙醇的质量浓度优选范围为40％～60％。

2)料液比参数优化

准确称取5份1.0g的决明子粉末于锥形瓶中，分别加入50％的乙醇溶液各10ml、20ml、30ml、40ml、50ml，编号备用。再将五只锥形瓶放入超声波清洗机中，在60℃下超声提取30min后，各取10ml色素提取液的上清液置于低速离心机中，设定转速为4000r/min,离心十分钟后，取上清液进行稀释，分别测定每份色素提取液的最大吸光度。平行测定三次取平均值。

决明子的质量与50％乙醇的体积比(即料液比)与吸光度的关系曲线如图2所示，可见，吸光度值随着料液比的增大而逐渐减小，吸光度值降低可能是由提取液中色素浓度造成的。

3)温度对决明子色素提取率的影响

准确称取5份1.0g的决明子粉末于锥形瓶中，分别加入30ml50％的乙醇溶液，编号备用。再将五只锥形瓶分别于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下超声提取30min，各取10ml色素提取液的上清液置于低速离心机中，设定转速为4000r/min，离心十分钟后，取上清液进行稀释，分别测定每份色素提取液的最大吸光度。平行测定三次取平均值。

温度与吸光度的关系曲线如图3所示，可见，提取温度为60℃时，决明子色素的吸光度值最大，即色素提取率最高。温度超过60℃后，随着提取温度的升高，色素提取率逐渐下降，可能是因为高温易使色素分解。提取温度的优选区间为50℃～70℃。

4)提取时间对决明子色素提取率的影响

准确称取5份1.0g的决明子粉末于锥形瓶中，分别加入30ml50％的乙醇溶液，编号备用。将五只锥形瓶置于超声波清洗机中，设定提取温度为60℃，分别提取10min、20min、30min、40min、50min，各取10ml色素提取液的上清液置于离心机中，设定转速为4000r/min，离心十分钟后，取每份色素提上清液进行稀释，分别测定取液的最大吸光度。平行测定三次取平均值。

提取时间与吸光度的关系曲线如图4所示，可见，提取时间为20min时，决明子色素的吸光度值最大为0.609abs，此时色素提取率最高。20min之内，随着提取时间的升高，色素提取率逐渐上升，超过20min之后，色素提取率又呈明显的降低趋势。说明并不是提取时间越长，色素提取效果越好，提取时间太长易产生其他杂质，影响色素的提取效果。优选的提取时间为10～30min。

本发明通过design-expert软件，利用box-behnken中心组合设计原理来设计响应面实验。在单因素实验结果的基础上选取提取时间、提取温度、料液比、提取浓度4个因素作为变量，以决明子色素吸光度为响应值来设计实验。实验因素及水平编码见表1。通过对实验结果分析可知：对决明子色素提取影响效果顺序依次为：提取时间>提取温度>提取浓度>料液比。

表1响应面实验因素及水平编码表

因此，超声提取时间过长会严重影响色素的提取率，推断是由于超声作用破坏了色素的结构。本发明出于保护色素的目的，在超声一定时间后，加入保护剂，再继续超声提取，保护已提取到的色素的同时进一步提高提取率。

对上述提取的未经保护剂和稳定剂保护的单纯的决明子色素提取液的稳定性分别进行以下研究：

1)光照实验

将色素提取液装入三只锥形瓶中，分别放到阳光下、室内、避光的橱窗里，以50％的乙醇为参比溶液，每隔2小时测定决明子色素提取液在波长278nm处的吸光度。每组测三次。参见图6，可见，在光照条件下，色素提取率有明显降低，耐光照性差。

2)耐高温实验

将四个色素提取液锥形瓶分别放入60℃、70℃、80℃、90℃的恒温水浴锅中。以50％的乙醇为参比溶液，恒温3h后测定决明子色素提取液在波长278nm处的吸光度，每组测三次。参见图7，可见，决明子色素的耐高温性差。

3)抗氧化性测定

配置0.1mol/l的过氧化氢和高锰酸钾溶液，取2份15ml稀释过后的决明子色素提取液，放入50ml锥形瓶中，分别加入相同体积的过氧化氢溶液、高锰酸钾溶液，摇匀，再静置20min，测定其在278nm处的吸光度值。每组测三次。测定结果见表2。由表2可知，过氧化氢和高锰酸钾等氧化剂会使决明子色素提取液吸光度明显降低，色素提取率显著下降，可见决明子色素的抗氧化性差。

表2：抗氧化性实验

4)抗还原性测定。

配置0.1mol/l的抗坏血酸溶液、亚硫酸钠溶液，取2份15ml稀释过后的决明子色素提取液，放入50ml锥形瓶中，分别加入相同体积的抗坏血酸溶液、亚硫酸钠溶液，摇匀，再静置20min，测定其在278nm处的吸光度值。每组测三次。测定结果见表3，可见，抗坏血酸和亚硫酸钠等抗氧化剂会使决明子色素提取液吸光度明显降低，色素提取率显著下降，可见决明子色素的抗还原性差。

表3抗还原性实验

本发明从改善决明子色素的稳定性出发，对决明子色素的提取工艺进行改进。

由于决明子色素的主要成份为大黄素、蒽醌化合物类，通过在蒽醌类色素中引入强给电子基或者增加色素的分子量均会提高色素的稳定性、耐高温耐光照性等。本发明优选氨基酸作为保护剂，氨基酸中含有强给电子基团氨基，并且氨基酸还含有较弱的羧基给电子基团，同时，蒽醌类化合物也含有强给电子基团-oh以及联苯环上的较弱给电子基团，因此，利用分子间的范德华力，氨基酸的首尾的氨基和羧基分别连接蒽醌类化合物上的弱、强给电子基团，使氨基酸成为连接色素的桥梁，钝化活性基团，以及增加色素分子量，起到保护色素、提高色素稳定性的目的。优选地，氨基酸为α-氨酸酸，且优选极性强的，例如谷氨酸、天门冬氨酸中的一种或两种组合。

超声辅助提取可以提高色素的提取率，但是，超声时间过长，超声波会将色素分子进一步分解为小分子，从而使色素损失，本发明对超声提取的步骤进行改进，在乙醇溶液浸提，在一定温度下超声辅助提取一定时间后，加入氨基酸，然后继续超声辅助浸提一定时间。

具体地，准确称取5份1.0g的决明子粉末于锥形瓶中，分别加入30ml50％的乙醇溶液，编号备用。将五只锥形瓶置于超声波清洗机中，设定提取温度为60℃，分别提取10min、20min、30min、40min、50min，当3、4、5号试剂提取时间达到20min时，加入0.3g谷氨酸，各取10ml色素提取液的上清液置于离心机中，设定转速为4000r/min，离心十分钟后，取每份色素提上清液进行稀释，分别测定取液的最大吸光度。平行测定三次取平均值。

提取时间与吸光度的关系曲线如图5所示，和图4结果相比，在提取时间为20min时加入氨基酸，明显提高了色素的稳定性。

3、提纯、保护和固体化

接下来本发明继续对提取的色素进行提纯、保护和固体化，延长保质期，以及作为色素添加剂直接被使用。

使用旋转蒸发去除上清液中多余的乙醇提取溶剂，得高浓度色素提取液，避免乙醇溶剂对色素的影响。具体地，将超声提取后的上清液置于旋转蒸发仪中，旋转蒸发的温度为60℃。

对高浓度色素提取液用可食用的有机酸进行ph调整，使ph值处于3～6的弱酸范围内，由于前一步骤已对色素进行保护，该步骤以及后面的步骤可以使用超声辅助搅拌，使混合更充分，那么，更易形成氨基酸均匀分布在色素中的超分子结构。具体地，用柠檬酸调整ph值至5。

调整完酸碱度后，继续加入环糊精水溶液，优选地，超声混合，环糊精的环内具有疏水性，环外具有亲水性，色素和氨基酸被包容在内腔中，环糊精具有包埋的保护作用。具体地，加入10ml浓度为0.1g/ml的环糊精水溶液。

在被环糊精包埋保护的色素中，继续加入维生素c和维生素e，优选地，超声混合，使色素具有抗氧化性。具体地，分别加入0.05g维生素c和0.05g维生素e。

喷雾干燥，得色素粉末。

4、对保护后的色素提取液进行稳定性实验

1)光照实验

取三个磨口带塞的锥形瓶编号，分别向其中加入15ml50％的乙醇溶剂稀释过后的0.1mg/ml决明子色素提取液。分别将三只锥形瓶放到阳光下，室内，避光的橱窗里。以50％的乙醇为参比溶液，每隔2小时测定决明子色素提取液的最大吸光度。每组测三次取平均值。参见图8，和图6相比，可见，稳定性改善后的决明子色素的耐光性得到提高。

2)耐高温实验

取四个磨口带塞的锥形瓶编号，分别向其中加入15ml50％的乙醇溶剂稀释过后的0.1mg/ml决明子色素提取液。将四个锥形瓶分别放入60℃、70℃、80℃、90℃的恒温水浴锅中。以50％的乙醇为参比溶液，恒温3h后测定决明子色素提取液的最大吸光度，每组测三次取平均值。见图9，和图7相比，可见，稳定性改善后的决明子色素的耐高温性得到提高。

3)抗氧化性测定

配置0.1mol/l的过氧化氢和高锰酸钾溶液，取2份15ml50％的乙醇溶剂稀释过后的0.1mg/ml决明子色素提取液，放入50ml锥形瓶中，分别加入相同体积的过氧化氢溶液、高锰酸钾溶液，摇匀，再静置20min，测定其在278nm处的吸光度值。每组测三次。测定结果见表4。和表2相比，决明子色素的抗氧化性得到提高。

表4：抗氧化性实验

4)抗还原性测定。

配置0.1mol/l的抗坏血酸溶液、亚硫酸钠溶液，取2份15ml50％的乙醇溶剂稀释过后的0.1mg/ml决明子色素提取液，放入50ml锥形瓶中，分别加入相同体积的抗坏血酸溶液、亚硫酸钠溶液，摇匀，再静置20min，测定其在278nm处的吸光度值。每组测三次。测定结果见表5，和表3相比，可见，决明子色素的抗还原性得到提高。

表5抗还原性实验

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。