用于神经组织尼氏体染色的染料组合物、染液及染色方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物组织染色领域，具体涉及一种用于神经组织尼氏体染色的染 料组合物、染液及染色方法。
【背景技术】
[0002] 尼氏体(Nissl body)发现者是神经解剖学家Framz Nissl氏（1860~1919)，他在 1892年首次使用甲苯胺蓝染出了以他本人的名字命名的小体并对结果进行观察到尼氏小 体呈现出深蓝色，它具有强嗜碱性，均匀分布。在大神经元中，如脊髓运动神经元中，呈粗大 的斑块状;而在小神经元里，如神经节内的神经元，呈细颗粒状。在电镜下，尼氏体由发达的 粗面内质网和游离核糖体构成，表明神经元具有活跃的蛋白质合成功能，主要合成更新细 胞器所需要的结构蛋白、合成神经递质所需的酶类以及肽类的神经递质。
[0003] 尼氏（Nissl)染色法是应用碱性染料显示神经元的一种常规方法，广泛应用于脑 内核团的定位、核团内神经元的类型、分布和计量学分析，它对于揭露机体神经细胞状况的 判定具有重大参考价值。选用Pischinger氏法作标准方法，为实验对照组对猫脊髓进行尼 氏体染色，它的基本程序为:组织切片-梯度酒精脱蜡至水-入染液lOmin-0.2M醋酸缓冲 液(PH4.6)分化1~3min-显微镜下观察到尼氏体清晰为止-5%钼酸铵液处理3~5min- 蒸馏水洗-常规脱水透明-中性树胶封固-结果观察-摄片、图像与分析。它可以显示出 神经细胞的分布情况以及对确定神经细胞的类型。同时，对研究神经细胞在生理或病理状 态下的形态变化有一定的价值。因此，尼氏染色法已成为对中枢神经系统的显微结构研究 中的四大主要方法之一，近一个世纪以来一直为科学家们普遍采用。其目的是为了探索和 开发具有新结构、新靶标的染色剂。
[0004] 因此，要完美与清晰的显示出神经组织中尼氏体的染色除选择优良的试剂以外， 还要不断的创新，改变染料分子的性质，才能获得更好的染色效果，才有利于更好的为医学 教学与科学研究服务，同时也为研发神经系统新型染色技术提供了重要的线索和理论依 据。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明提供一种用于神经组织尼氏体染色的染料组合物、染液及染色 方法，经其染色后的动物神经组织切片的分辨率、美观度和清晰度几个方面均比传统的 Pischinger氏染色方法以及其它几种单种染色液染色方法的效果更好。
[0006] 为解决以上技术问题，本发明提供的第一方面的技术方案是采用一种用于神经组 织尼氏体染色的染料组合物，所述染料组合物由以下组分按重量份组成：1.〇重量份美蓝和 0.8-1.0重量份硫堇;所述美蓝的分子结构式如下：
[0008] 所述硫堇的分子结构式如下：
[0009] 优选的，所述染料组合物由以下组分按重量份组成：1.0重量份美蓝和1.0重量份 硫堇。
[0010] 另外，本发明提供的第二方面的技术方案为前述任一所述的染料组合物形成的神 经细胞尼氏体染液，所述染液由美蓝、硫堇、氯化钠以及70 % -80 %的乙醇溶液组成，乙醇溶 液作为溶剂：
[0011] (1)质量百分比为1 %或〇. 8 % -1 %的硫堇乙醇染色液；
[0012] (2)质量百分比为1%的美蓝乙醇染色液；
[0013] ⑶按硫堇乙醇染色液:美蓝乙醇染色液:0.9%氯化钠溶液的体积比为1:1:9进行 配制成神经组织尼氏体染液。
[0014] 另外，本发明提供的第三方面的技术方案为一种用于神经组织尼氏体染色的染料 组合物，所述染料组合物由以下组分按重量份组成：1.〇重量份美蓝、0.8-1.0重量份硫堇、 0. 1-0. 2重量份天青A和0. 1-0. 2重量份天青B;所述天青A的分子结构式如下：
[0015] 所述天青B的分子结构式如下
[0016] 优选的，所述染料组合物由以下组分按重量份组成：1.0重量份美蓝、1.0重量份硫 堇、0.1-0.2重量份天青A和0.1-0.2重量份天青B。
[0017] 另外，本发明提供的第四方面的技术方案为前述任一所述的染料组合物形成的神 经组织尼氏体染液，所述染液由美蓝、硫堇、氯化钠以及70%_80%的乙醇溶液组成，乙醇溶 液作为溶剂：
[0018] (1)质量百分比为1 %或0.8 % -1 %的硫堇乙醇染色液；
[0019] (2)质量百分比为1%的美蓝乙醇染色液；
[0020] (3)质量百分比为0.1-0.2 %的天青A乙醇染色液；
[0021 ] (4)质量百分比为0.1-0.2%的天青B乙醇染色液；
[0022] (5)按硫堇乙醇染色液：美蓝乙醇染色液：天青A乙醇染色液：天青B乙醇染色液： 0.9%氯化钠溶液的体积比为1:1:1:1:9进行配制成神经细胞尼氏体染液。
[0023] 另外，本发明提供的第五方面的技术方案为一种对神经组织尼氏体染色的染色方 法，所述染色方法包括以下步骤：
[0024] 1)动物组织用固定液固定20-24小时后干燥；
[0025] 2)放入权3或权6任一所述的染液进行染色7-14天；
[0026] 3)固定处理20-24小时；
[0027] 4)乙醇分色与脱水、石蜡包埋切片。
[0028]优选的，所述步骤1)中动物组织为整块的动物神经组织。
[0029] 11、优选的，所述步骤1)中固定液由以下成分组成:冰醋酸、40 %甲醛溶液、70 %酒 精液按体积比为1:3:16。
[0030] 优选的，所述步骤1)中干燥的方式为固定液固定所得动物组织经自然干燥后，再 放入1 %火棉胶液中处理，再次自然干燥。
[0031] 优选的，所述步骤3)中固定处理为将步骤2)所得染色后动物组织放入5%的钼酸 铵水溶液中固定处理20-24小时。
[0032] 优选的，所述步骤4)中所述乙醇为95%-100%乙醇溶液。
[0033] 本申请所述用于神经组织尼氏体染色的染料组合物的基本说明如下：
[0034] 本发明人通过长时间的研制得出，本申请所述的染料组合物可以有效的对生物组 织进行染色，经其染色后的动物神经组织切片的分辨率、美观度和清晰度几个方面均比传 统的Pischinger氏染色方法以及其它几种单种染色液染色方法的效果更好。
【附图说明】
[0035]图1是经1组硫堇染液染色之后对应猫脊髓的显微镜下观察得到的组织切片效果 显示图；
[0036] 图2是经2组美蓝染液染色之后对应猫脊髓的显微镜下观察得到的组织切片效果 显示图；
[0037] 图3是经3组本发明所述染液染色之后对应猫脊髓的显微镜下观察得到的组织切 片效果显示图；
[0038] 图4是1-4组染液染色14天后的猫脊髓组织切片的尼氏体平均灰度值。
【具体实施方式】
[0039] 为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对 本发明作进一步的详细说明。
[0040] 下面将列举一些与本申请相关的用于动物神经组织尼氏体染色的染液及其实施 步骤。
[0041] 实验步骤:实验动物组织样品制备与分组
[0042] 选用健康成年家猫5只，体重1.5~2.0kg，用2%的戊巴比妥钠（40mg/kg)腹腔麻 醉，固定采用自左心室通过静脉套管快速灌注生理盐水冲洗，待流出清亮液体后，灌注10 % 中性甲醛固定30分钟，暴露脊髓颈、腰膨大，取其横切长为0.4~0.5cm的组织24块，放入固 定液中固定20~24小时，其中固定液是由体积比为1:3:16的冰醋酸、40 %甲醛溶液、70 %酒 精液组成。再将所取组织随机分成两组，对照组和实验组，3块用于对照组，21块用于实验 组。对照组用Pischinger氏美蓝液染色(4组），实验组采用美蓝染液(美蓝质量百分比浓度 为1 %的乙醇溶液，1组）、硫堇染液(硫堇质量百分比浓度为1 %的乙醇溶液，2组）以及本发 明所述染液(3组)进行染色，实验组每种染液染色的组织各7块。分别经染色7天、10天、14天 后，取出放95%的酒精30min，100%的酒精各lh，二甲苯15min，入软蜡2h，入硬蜡2h，硬蜡包 埋，烘干24~48小时，切片厚5um;展片后，经二甲苯脱蜡，中性树胶封片;结果经显微镜观察 与分析。
[0043]尼氏体判断的意义
[0044]尼氏体是神经细胞中所特有的结构，它是位于胞体和树突(轴丘和轴突除外）内的 嗜碱性物质，呈大小不等的块状或颗粒状;它的主要化学成分是核糖核酸和蛋白质，常称为 核蛋白体，是蛋白质合成场所；它的形态与大小，在不同的神经元内表现不同，当神经细胞 受到损伤时，尼氏体会显著减少甚至消失;它的形态、大小在各种不同的染色液中和不同的 生理机能状态下的同一种神经细胞都有所不同，这反映了染色液对粗面内质网的着色程度 有变化，例如细胞体未坏死，则溶解的尼氏体可以重现，胞体代谢也可逐渐恢复，它的数量 和分布的改变可以作为判断神经细胞病变程度或药物治疗疗效的良好指标。
[0045]细胞形态特征的染色的结果
[0046]经1~4组染液染色对应的组织样品所对应神经细胞的染色的结果，在显微镜下观 察切片的染色效果和尼氏体以及细胞形态的保存情况并分别作了比较，在1、2和4组可观察 到在组织染色效果和尼氏体以及细胞形态的保持都无较大区别，而在3组对尼氏体以及细 胞形态染色与保持方面的合格指数值更高，即尼氏体着色呈紫兰色，细胞核与细胞质染色 更鲜艳。经过1~4组染液染色以后相对应的组织样品以及它们的神经细胞所对应的染色结 果(见表1)。
[0047] 表1在1~4组染液染色对应的组织样品所对应神经细胞的染色质量指数表
[0048]
[0049] 上述实验中经1组硫堇染液染色、2组美蓝染液染色、3组本发明所述染液染色之 后，对应猫脊髓的显微镜下观察得到的组织切片效果显示图，可参见附图1~3所示。
[0050] 图像分析
[0051] 应用平均灰度质对尼氏体进行定量方面的研究与分析，由于尼氏体数量的多少在 图像分析中用平均灰度和面积（％)来表示。而经尼氏染色获得的数据处理需借助于图像处 理技术，其中，平均灰度在图像分布中表示图像的透光率，分为256级，最暗为0级，最亮为 256级。其中尼氏体平均灰度质越低，说明了染色越深，即细胞内尼氏体含量就越高。为此， 可知尼氏体的平均灰度值与细胞内尼氏体含量的关系，即平均灰度质越低，其细胞内尼氏 体含量越高，也可见平均灰度质和尼氏体染色深度成反比；在图像上灰度的深浅也反映了 各部分尼氏体颜色的深浅程度以及含量的多少，若染色获得的切片标本颜色越浅，却灰度 的值反而出现越高的现象。
[0052] 数据处理
[0053] 所有测定值以平均值上标准差表示。统计学意义通过Microsoft Excel5 .Ofor widows电子表格软件中的F检验和t检验进行评价，P值〈0.05为具有显著性差异。应用 Luzed-F型图像分析系统，对脊髓染色的切片在20倍物镜下随机抽样测定30