个前角细胞的 尼氏体特征区域的平均灰度值和面积（％ )，因尼氏体平均灰度与面积（％ )也可反映出神经 细胞胞质中尼氏体对染色液的亲和力的显示程度(见表2)。
[0054]表2 1~3组与4组在染色脊髓神经胞质中尼氏体灰度值及面积（％ )
[0056] *P〈0.01VS2组 **P〈0 · 01VS 对照组
[0057]由表2反映出，在3组尼氏体的平均灰度值最低，可见采用本发明所述染液对尼氏 体含量的显示程度为最好，而1组尼氏体的平均灰度值最高，说明采用美蓝染液对尼氏体含 量的显示程度为最差，其中，3组和4组的平均灰度值与1组、2组相比，有明显下降，说明其染 液对尼氏体的含量的显示程度有明显的增加，在统计学上有差异(P〈〇.01);而3组的平均灰 度值与4组相比有明显下降，在统计学上有差异(P〈0.01);说明其染液对尼氏体含量的显示 程度有明显增加，然而1组和2组之间尼氏体平均灰度的差异相比无统计学意义(P>0.05)。 同时，也可反映出在实施例染色中，1组面积（％ )明显小于3组，有非常显著性差异（P〈 0.01)，4组面积（％ )明显大于1、2组，但无显著性差异(P>0.05)，而2组面积（％ )大于1组，但 无显著性差异(P>〇.〇5)。
[0058]尼氏体的形态观察结果
[0059] 在对1-3组7天、10天和14天染色和4组染色所得的神经细胞胞质中尼氏体进行观 察分析，在1组的14天染色中，显著高于4组和1-3组7天和10天染色笫2组(P〈0.01)，而7天和 10天染色2组之间尼氏体的变化表达发生的差异没有统计学意义(P>0.05);在经3组14天采 用本发明所述染液染色后，在正常动物脊髓神经细胞胞质中布满着天蓝色呈斑网状尼氏 体;而在它经过7天染色后，可在神经细胞胞浆中出现浅而少的尼氏体，经染色10天后，神经 细胞胞质中尼氏体数量比7天中的尼氏体稍多，可见随着染色时间的延长，尼氏体的着色数 量会有所增加，直至14天染色后，尼氏体着色增加不在显著。由附图4统计分析结果显示，1-3组与4组尼氏体平均灰度之间，发生的差异没有统计学意义(P>0.05)。
[0060]由此可见，经这4种染液染色所获得的染色效果优劣不一，1组染液染色效果不如 其余3组，其中，2组背景颜色的对比效果较3组染色液稍差，而3组的细胞胞质中的尼氏体染 色背景颜色对比度在4组中为最好，便于观察以及3组染液染色的鲜艳程度、清晰程度和重 复使用率优于其它3个组的配制方法(P〈0.05);而4组染色时间最短，但着色偏深，而且染液 配制过程中较为繁琐，使用不方便。
[0061]总的说来，在1~4组染色效果上进行比较，它们均可染出尼氏体，而3组染液的染 色效果为最佳，细胞中尼氏体呈天蓝色，核仁、核膜及核染色质分辨良好;而4组染色结果优 于1组和2组。在实验组（1~3组）以及对照组(4组）的染色结果相比较，4组能清晰的显示出 神经细胞质中尼氏体成分，但其结果稍逊于3组，故选用3组（即本发明所述染液，染色14天） 进行染色，能更好的达到提高实验教学与科研质量的要求。此外，也可对脊髓神经细胞胞质 中尼氏体的染色与制作切片的好坏，以及对测量的可靠性与评估的客观性指标都具有一定 的影响，所以，对脊髓切片染色与制作技术的进一步提高，将有助于测量与分析法的更广 泛、更有效的应用。
[0062] 本发明所述染液进行染色的具体实施例如下：
[0063] 染液 1:
[0064] 该染液1由美蓝、硫堇、氯化钠以及70 % -80 %的乙醇溶液组成，乙醇溶液作为溶 剂：
[0065] (1)质量百分比为1 %或0.8 %的硫堇乙醇染色液；
[0066] (2)质量百分比为1 %的美蓝乙醇染色液；
[0067] (3)按硫堇乙醇染色液:美蓝乙醇染色液:0.9%氯化钠溶液的体积比为1:1:9进行 配制成神经细胞尼氏体染液。
[0068]染液 2:
[0069] 该染液2由美蓝、硫堇、氯化钠以及70 % -80 %的乙醇溶液组成，乙醇溶液作为溶 剂：
[0070] (1)质量百分比为1 %或1 %的硫堇乙醇染色液；
[0071] (2)质量百分比为1 %的美蓝乙醇染色液；
[0072] (3)按硫堇乙醇染色液:美蓝乙醇染色液:0.9%氯化钠溶液的体积比为1:1:9进行 配制成神经细胞尼氏体染液。
[0073]染液 3:
[0074] 该染液3由美蓝、硫堇、氯化钠以及70 % -80 %的乙醇溶液组成，乙醇溶液作为溶 剂：
[0075] (1)质量百分比为1 %或0.8 %的硫堇乙醇染色液；
[0076] (2)质量百分比为1 %的美蓝乙醇染色液；
[0077] (3)质量百分比为0.1-0.2%的天青A乙醇染色液；
[0078] (4)质量百分比为0.1-0.2%的天青B乙醇染色液；
[0079] (5)按硫堇乙醇染色液：美蓝乙醇染色液：天青A乙醇染色液：天青B乙醇染色液： 0.9%氯化钠溶液的体积比为1:1:1:1:9进行配制成神经细胞尼氏体染液。
[0080] 染液 4:
[0081 ] 该染液4由美蓝、硫堇、氯化钠以及70 % -80 %的乙醇溶液组成，乙醇溶液作为溶 剂：
[0082] (1)质量百分比为1 %或1 %的硫堇乙醇染色液；
[0083] (2)质量百分比为1 %的美蓝乙醇染色液；
[0084] (3)质量百分比为0.1-0.2 %的天青A乙醇染色液；
[0085] (4)质量百分比为0.1-0.2%的天青B乙醇染色液；
[0086] (5)按硫堇乙醇染色液：美蓝乙醇染色液：天青A乙醇染色液：天青B乙醇染色液： 0.9%氯化钠溶液的体积比为1:1:1:1:9进行配制成神经细胞尼氏体染液。
[0087] 取猫脊髓的颈或腰膨大处的组织，横切长为0.4~0.5cm的组织4块，放入固定液固 定16~20小时；其中固定液是由体积比为1:3:16的冰醋酸、40 %甲醛溶液、70 %酒精液组 成。再取出脊髓组织经蒸馏水洗洗后，等自然干燥，经1%火棉胶液处理短时，取出等自然干 燥后，放入配制好的染液1-4中分别染色14天;入5%的钼酸铵溶液处理20~24小时，入95% 酒精，100%酒精脱水各2小时，入二甲苯透明6小时后，软蜡浸2次，每次30~40分钟;硬蜡浸 2次，每次60分钟；常规石蜡包埋。用石蜡切片机将蜡块切成厚5微米的蜡带；展片与烘干24 ~48小时后，经二甲苯脱蜡2次，各20~30分钟，用中性树胶封固。显微镜下观察结果：染液 1-4染色后的猫神经组织切片均细胞染色清晰，尼氏体分布丰富而均匀，呈天蓝色至兰紫 色，与蓝色的细胞核有明显的区别。
[0088] 表3、染液1-4对应的组织切片染色效果
[0089]
[0090] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对 本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改 进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种用于神经组织尼氏体染色的染料组合物，其特征在于：所述染料组合物由W下 组分按重量份组成：1.0重量份美蓝和0.8-1.0重量份硫堇；所述美蓝的分子结构式如下：所述硫堇的分子结构式如下：2. 根据权利要求1所述的用于神经组织尼氏体染色的染料组合物，其特征在于:所述染 料组合物由W下组分按重量份组成：1.0重量份美蓝和1.0重量份硫堇。3. 权1-权2任一所述的染料组合物形成的神经组织尼氏体染液，其特征在于:所述染液 由美蓝、硫堇、氯化钢W及70%-80%的乙醇溶液组成，乙醇溶液作为溶剂： (1) 质量百分比为1%或〇.8%-1%的硫堇乙醇染色液； (2) 质量百分比为1%的美蓝乙醇染色液； (3) 按硫堇乙醇染色液:美蓝乙醇染色液:0.9%氯化钢溶液的体积比为1:1:9进行配制 成神经细胞尼氏体染液。4. 一种用于神经组织尼氏体染色的染料组合物，其特征在于：所述染料组合物由W下 组分按重量份组成：1.0重量份美蓝、0.8-1.0重量份硫堇、0.1-〇. 2重量份天青A和0.1-〇. 2 重量份天青B;所述天青A的分子结构式如下：所述天青B的分子结构式如下5. 根据权利要求4所述的用于神经组织尼氏体染色的染料组合物，其特征在于:所述染 料组合物由W下组分按重量份组成：1.0重量份美蓝、1.0重量份硫堇、0.1-0.2重量份天青A 和0.1-0.2重量份天青B。6. 权4-权5任一所述的染料组合物形成的神经组织尼氏体染液，其特征在于:所述染液 由美蓝、硫堇、氯化钢W及70%-80%的乙醇溶液组成，乙醇溶液作为溶剂： (1) 质量百分比为1%或〇.8%-1%的硫堇乙醇染色液； (2) 质量百分比为1%的美蓝乙醇染色液； (3) 质量百分比为0.1-0.2%的天青A乙醇染色液； (4) 质量百分比为0.1-0.2%的天青B乙醇染色液； (5)按硫堇乙醇染色液：美蓝乙醇染色液:天青A乙醇染色液:天青B乙醇染色液:0.9% 氯化钢溶液的体积比为1:1:1:1:9进行配制成神经组织尼氏体染液。7. -种对神经组织尼氏体染色的染色方法，其特征在于:所述染色方法包括W下步骤： 1)动物组织用固定液固定20-24小时后干燥； 2) 放入权3或权6任一所述的染液进行染色7-14天； 3) 固定处理20-24小时； 4) 乙醇分色与脱水、石蜡包埋切片。8. 根据权利要求7所述的染色方法，其特征在于:所述步骤1)中动物组织为整块的动物 神经组织。9. 根据权利要求7所述的染色方法，其特征在于：所述步骤1)中固定液由W下成分组 成:冰醋酸、40 %甲醒溶液、70 %酒精液按体积比为1:3:16。10. 根据权利要求7所述的染色方法，其特征在于:所述步骤1)中干燥的方式为固定液 固定所得动物组织经自然干燥后，再放入1 %火棉胶液中处理，再次自然干燥;所述步骤3) 中固定处理为将步骤2)所得染色后动物组织放入5%的钢酸锭水溶液中固定处理20-24小 时;所述步骤4)中所述乙醇为95%-100%乙醇溶液。
【专利摘要】本发明公开一种生物组织染色领域，具体涉及一种用于神经组织尼氏体染色的染料组合物、染液及染色方法。所述用于神经组织尼氏体染色的染料组合物由以下组分按重量份组成：1.0重量份美蓝和0.8-1.0重量份硫堇；经本发明所述染料组合物染色后的动物神经组织切片的分辨率、美观度和清晰度几个方面均比传统的Pischinger氏染色方法以及其它几种单种染色液染色方法的效果更好。
【IPC分类】G01N1/30, C09B21/00, C09B67/22
【公开号】CN105504873
【申请号】CN201510848670
【发明人】龚林, 候思奎, 陈明
【申请人】龚林, 候思奎, 陈明
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年11月26日