合成核酸的方法

专利名称：合成核酸的方法
技术领域：
本发明涉及由特异核苷酸序列构成的核酸的合成方法，一种有用的扩增核酸的方法。
背景技术：
基于核苷酸序列互补性的分析方法可直接分析遗传特征。因此，该分析是一种鉴定遗传疾病，癌变，微生物等非常强有力的方法。而且，检测的对象是基因自身，所以某些情况下耗时而又繁琐的操作过程如培养中的就可省略。
然而，当样品中靶基因量非常少时一般不易检测，因此必须对靶基因自身或其检测信号进行扩增。作为扩增靶基因的方法，PCR(聚合酶链式反应)方法已为大家所知(Science，230，1350-1354，1985)。目前，PCR方法是体外扩增核酸序列最普遍的技术方法。指数式扩增结果使其具有高灵敏度的优点，所以该方法牢牢地确立了一种非常好的检测途径。此外，由于回收到的扩增产物可以是DNA，因此作为一种支持遗传工程技术例如基因克隆和结构决定的重要工具，该方法得到了广泛应用。然而PCR方法明显有下述的问题实际操作中必须要用专门的温度控制器；扩增反应的指数式上升导致在定量中产生问题；样品和反应溶液易受到外部污染，使混入的核酸作为模板错误地运行。
基因组信息的日益增多，单核苷酸多态性(SNPs)分析逐步受到了注意。通过设计引物使其核苷酸序列包含SNPs，依靠PCR检测SNPs是可行的。也就是，是否存在与引物互补的核苷酸序列可通过是否存在反应产物的决定得出推断。然而，一旦PCR中偶然误合成互补链，在接下去的反应中该产物以模板运行，就会造成错误的结果。实际应用中，据说引物末端仅一个碱基不同就很难严格控制PCR。因此，必须改进特异性使PCR应用于SNPs的检测上。
一方面，实际中还在应用连接酶合成核酸的方法。LCR方法(连接酶链式反应(ligase chain reaction)，Laffler TG；Garrino JJ；Marshall RL；Ann.Biol.Clin.(Paris)，519，821-6，1993)是基于这样的反应，该反应中两个相邻的探针与靶序列杂交并且通过连接酶互相连接。在缺少靶核苷酸序列的情况下所述两探针不能被连接，因此连接产物的存在是靶核苷酸序列存在的象征。LCR方法也需要控制温度用于从模板分离互补链，遇到PCR方法中相同的问题。对于LCR，有通过增加在相邻探针间提供缺口并利用DNA聚合酶填补缺口的步骤以改进特异性方法的报道。该改进方法所期望的是特异性的改进，然而，由于需要控制温度所以仍然存在问题。此外，使用额外酶导致费用增加。
称为SDA的方法(链置换扩增，strand displacement amplification)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，392-396，1992][Nucleic.Acid Res.，20，1691-1696，1992]也是人们所知的扩增具有序列与靶序列互补的模板DNA的方法。SDA方法中，在替换双链5’-侧的序列时，用特定的DNA聚合酶从与某核苷酸序列3’-侧互补的引物开始合成互补链。本发明中简单表达5’-侧和3’-侧指的是模板链的，由于新合成的互补链替换了5’-侧的双链，称该项技术为SDA方法。SDA方法中限制酶识别序列作为引物预先插入到退火序列中就可去除PCR方法中必须的温度变化步骤。即通过限制酶生成的切口供给3’-OH基作为互补链的合成起点，并且先合成的互补链通过链置换合成得以释放单链，接着再次作为模板用于下面的互补链合成。这样，在SDA方法中就不需要PCR方法中所必须的复杂温度控制。
然而在SDA方法中，除了链置换型DNA聚合酶，还要用到生成切口的限制酶。需要应用额外酶是导致较高费用的主要原因。此外，由于限制酶不是用来断开两条链，而是为产生切口(也就是仅断开其中一条链)，dNTP衍生物例如α-硫代dNTP被用作合成的底物使其它链能抗该酶的消化。因此，SDA扩增产物与天然核酸结构不同，并且对用限制酶来断裂或将扩增产物应用到基因克隆上存在限制。这方面也是导致费用较高的主要原因。另外，SDA方法应用在未知序列时，与用于引入缺口的限制酶识别序列相同的核苷酸序列可能存在于要被合成的区中。这种情况下，有可能阻止完全互补链的合成。
NASBA(基于核酸序列的扩增(nucleic acid sequence-based amplification)，也称TMA/转录介导扩增方法)也是我们所知的扩增核酸方法，其中不需要复杂的温度控制。NASBA是反应系统，其中DNA通过DNA聚合酶在以靶RNA为模板，加入有T7启动子的探针而得以合成，第二探针进入双链使产物得以生成，接着以生成的双链DNA为模板通过T7 RNA聚合酶转录而扩增大量的RNA(Nature，350，91-92，1991)。NASBA需某些热变性步骤直到双链DNA形成，但是接下去的转录反应在等温条件下通过T7 RNA聚合酶得以进行。然而必须要用多种酶组合例如反转录酶，RNase H，DNA聚合酶和T7 RNA聚合酶，然后多种酶的组合与SDA相似这对于费用是不利的。而且由于设定多种酶的反应条件复杂，该方法很难作为一般的分析方法得以推广。已知的核酸扩增反应中，还存在如上所述复杂的温度控制及需用到多种酶的问题。
对这些已知的合成核酸的反应，很少有关于进一步改进核酸合成的效率而又不损失特异性或费用的尝试的报道。例如在称为RCA(滚环扩增，rolling-circle amplification)的方法中，显示具有一系列核苷酸序列与挂锁探针(padlock probe)互补的单链DNA在靶核苷酸存在下可被连续的合成(Paul M.Lizardi et al.，Nature Genetics，19，225-232，July，1998)。在RCA中，用到具有特殊结构挂锁探针，其中在LCR中一条链的寡核苷酸每个5’-和3’-末端构成相邻的探针。然后以挂锁探针为模板通过结合聚合酶催化合成链置换型互补链的反应，合成互补链的连续反应得以启动，该模板在靶核苷酸序列存在下被连接并环化。由此生成的单链核酸具有一种重复的连续的结构，每个区由相同的核苷酸组成。引物进一步被退火使该单链核酸合成其互补链，从而实现高度扩增。但仍存在需多种酶的问题。而且，互补链合成的启动取决于连接两邻近区的反应，并且其特异性基本上与LCR中的相同。
为了提供3’-OH，在已知方法中在3’-末端提供给核苷酸序列与其互补的序列，并且在末端形成发夹环(Gene 71，29-40，1988)。以靶序列自身为模板互补链的合成在发夹环处开始形成由互补核苷酸序列构成的单链核酸。例如，在PCT/FR95/00891中同一链末端发生退火的结构与互补的核苷酸序列的连接已经实现。然而，末端消除与该互补链配对的碱基并且在同一链上重新再构成碱基配对，该方法中这步是必须的。据估计该步的运行取决于涉及碱基对配对的互相互补的核苷酸序列末端的一种微平衡状态。也就是，在与互补链配对的碱基和同一链上配对的碱基间维持一种平衡状态。利用这种平衡状态并且仅与同一链中核苷酸退火的链是互补链合成的起点。于是，认为应设定严格的反应条件以获得高的反应效率。进一步地，在先端技术中，引物自身形成一种环的结构。因此，一旦形成引物二聚物，不管是否存在靶核苷酸序列，扩增反应会自动开始，于是就会合成非特异性产物。这可是严重的问题。此外，引物二聚物的形成和接下来的非特异性合成反应中引物的消耗导致所需反应的扩增效率降低。
此外，有利用不充当DNA聚合酶模板的区来实现能与同一链退火的3’-末端结构的报道(EP713922)。由于生成二聚物引物，在末端动力平衡的利用及非特异性合成反应的可能性方面，该报道存在与上面所述的PCT/FR95/00891相同的问题。另外，不能为DNA聚合酶提供模板的区应被制成引物。
此外，将上述NASBA原理应用于各种信号扩增反应中，经常利用末端具有发夹结构寡核苷酸来提供双链的启动子区(JP-A 5-211873)。然而，这些并不是那些为互补链合成连续提供3’-OH的技术。而且，在JP-A 10-510161(WO96/17079)中用发夹环结构以达到获得RNA聚合酶转录的DNA模板的目的，该发夹环结构在同一链3’-末端退火。模板通过转录成RNA和RNA到DNA反转录得以扩增。然而，该方法中，反应系统不结合大量的酶就不能被构成。

发明内容
本发明的目的是提供一种合成核酸的方法，该方法基于一种新的原理。更具体地的目的是提供一种能实现依靠序列高效合成核酸的低成本方法。也就是，本发明的目的是提供通过在一种单酶甚至等温条件下完成核酸合成和扩增的方法。本发明的另一目的是提供一种核酸合成的方法，该方法可实现用已知的核酸合成反应原理很难达到的高特异性，还提供一种用该合成方法扩增核酸方法。
本发明人把注意力集中在该事实上，利用聚合酶催化链置换型的互补链合成而不需复杂的温度控制，有益于核酸的合成。该DNA聚合酶是SDA和RCA中用到的酶。然而，即使用这样的酶，在以引物为基础的已知方法中总是需要另一种酶反应提供3’-OH作为合成的起点，例如SDA。
这些情况下，本发明人用与已知方法完全不同的方法讨论了3’-OH的供给，结果发现通过利用具有特定结构的寡核苷酸，不需任何额外酶反应3’-OH就可被提供，由此得出本发明。即本发明涉及合成核酸的方法，通过用所述核酸合成方法扩增核酸的方法和应用所述方法的新寡核苷酸，如下所述
(1)合成在其一条链上具有交替连接之互补核苷酸序列的核酸的方法，所述方法包括a)提供一种核酸，其3′末端具有可与同一条链上的部分F1c退火的F1区，并且通过所述F1区与F1c的退火可形成包含了可进行碱基配对的F2c区在内的环；b)以与F1c退火的F1 3′末端为起点合成互补链；c)使在其3′末端包含与F2c区互补的F2序列的寡核苷酸退火并以该寡核苷酸为合成起点，通过聚合酶催化链置换型互补链合成反应而进行互补链合成，以置换步骤b)中所合成的互补链；d)使一种多核苷酸退火并以其3′末端为合成起点，通过聚合酶催化链置换型互补链合成反应而进行互补链合成，以置换步骤c)中所合成的互补链，其中所述多核苷酸在其3′末端包含一种与步骤c)中合成的互补链的任意区域互补的序列；(2)如(1)所述的方法，其中步骤d)中所述合成起点为同一链上3′末端的可与R1c区退火的R1区，通过R1与R1c的退火可形成包含了可进行碱基配对的R2c区在内的环。
(3)一种寡核苷酸，其至少由以下两个区域X2及X1c构成，且X1c连接至X2的5′侧，X2区具有与含特定核苷酸序列的核酸中任意X2c区互补的核苷酸序列；X1c区具有与含特定核苷酸序列的核酸中X2c区5′侧的X1c区基本相同的核苷酸序列。
(4)如(1)所述的方法，其中步骤a)所述的核酸是通过以下步骤产生的第二核酸i)使如(3)所述寡核苷酸的F2区与作为模板的核酸中的F2c区退火，其中所述寡核苷酸中，X2区为F2区，X1c区为F1c区；ii)以所述寡核苷酸中的F2为起点合成具有与所述模板互补之核苷酸序列的第一核酸；iii)使步骤ii)中合成的第一核酸的任意区处于可进行碱基配对的状态；
iv)使一种寡核苷酸退火并以该寡核苷酸为合成起点，合成第二核酸，并使该核酸3′末端的F1处于可进行碱基配对的状态，其中所述寡核苷酸具有与步骤iii)中的第一核酸中可进行碱基配对的区域互补的核苷酸序列。
(5)如(4)所述的方法，其中步骤iii)中可进行碱基配对的区域为R2c，且步骤iv)中的寡核苷酸为如(3)所述的寡核苷酸，其中X2c区为R2c区，X1c区为R1c区。
(6)如(4或5)所述的方法，其中步骤iii)及iv)中可进行碱基配对的状态通过聚合酶催化链置换型互补链合成反应而产生，该反应的合成起点启用两种外引物一种是与模板中F2c的3′侧退火的外引物，另一种是与作为步骤iv)中第一核酸合成起点的区域的3′侧退火的外引物。
(7)如(6)所述的方法，所述反应中所用的每种寡核苷酸与其在模板中的互补区之间的解链温度在相同严谨条件下存在以下的关系(外引物/模板3′侧区)≤(F2c/F2及R2c/R2)≤(F1c/F1及R1c/R1)。
(8)如(4)-(7)中任一项所述的方法，其中所述作为模板的核酸为RNA，且步骤ii)中的互补链通过具有反转录酶活性的酶来合成。
(9)扩增在其一条链上具有交替连接之互补核苷酸序列的核酸的方法，所述方法通过重复以下步骤完成A)提供一种模板，使其3′末端和5′末端具有由互补于相同链上每一末端区的核苷酸序列组成的区，当这些互补核苷酸序列退火时，形成可在两者之间进行碱基配对的环；B)以与同一链退火的上述模板的3′末端为合成起点合成互补链；C)使3′末端互补于3′末端侧的环内核苷酸序列的寡核苷酸与环部退火，并以该寡核苷酸为合成起点，通过聚合酶催化链置换型互补链合成反应而合成互补链，以置换步骤B)中合成的互补链，使其3′末端处于可进行碱基配对的状态；D)使步骤C)中具有能进行碱基配对的3′末端的链作为(A)中的新模板。
(10)如(9)所述的扩增方法，其中步骤C)中寡核苷酸的5′末端具有一段与作为步骤B)之合成起始点的3末端互补的核苷酸序列。
(11)如(10)所述的扩增方法，进一步包含这样的步骤以步骤C)中的寡核苷酸作为合成起始点合成的互补链用做步骤A)中的模板。
(12)如(9)所述的扩增方法，其中步骤A)的模板是通过如(5)所述方法合成的。
(13)如(1)或(9)所述的方法，其中链置换型互补链合成反应是在解链温度调节剂的存在下实施的。
(14)如(13)所述的方法，其中解链温度调节剂为甜菜碱。
(15)如(14)所述的方法，其中允许反应溶液中甜菜碱的浓度为0.2-3.0M。
(16)一种检测样品中靶核苷酸序列的方法，包括实施如(9)-(15)中任一项所述的扩增方法并观察是否生成扩增产物。
(17)如(16)所述的方法，其中在扩增产物中加入包含与所述环互补的核苷酸序列的探针，进而观察两者之间的杂交。
(18)如(17)所述的方法，其中所述探针被标记在颗粒上，并观察通过杂交而发生的聚集反应。
(19)如(16)所述的方法，其中如(9)-(15)中任一项所述的扩增方法在核酸检测试剂的存在下实施，并根据该检测试剂的信号变化来观察是否生成扩增产物。
(20)用如(16)所述方法检测靶核苷酸序列中的突变的方法，其中核苷酸序列中作为扩增对象的突变阻碍了组成该扩增方法的任一互补链的合成。
(21)合成在其一条链上具有交替连接之互补核苷酸序列的核酸的试剂盒，其包括以下组分i)如(3)所述的寡核苷酸，其中作为模板的核酸中F2c区域是X2c，位于F2c 5′端的F1c是X1c；ii)一种寡核苷酸，其包含互补于以i)的寡核苷酸为引物而合成的互补链中任意区域的核苷酸序列；iii)一种寡核苷酸，其具有与作为模板的核酸中F2c区3′侧的F3c区互补的核苷酸序列；iv)一种用于催化链置换型互补链合成反应的DNA聚合酶，和，v)一种核苷酸，其作为组分iv)的底物。
(22)如(21)所述的试剂盒，其中ii)的寡核苷酸为如(3)所述的寡核苷酸，以i)的寡核苷酸为合成起点合成的互补链中任意R2c区为X2c，位于R2c 5′侧的R1c为X1c。
(23)如(22)所述的试剂盒，进一步包含以下组分vi)一种寡核苷酸，其具有与用i)的寡核苷酸作为起点合成的互补链中任意R2c区3′侧的R3c区互补的核苷酸序列。
(24)一种用于检测靶核苷酸序列的试剂盒，其中在如(21)-(23)中任一项所述试剂盒的基础上，还进一步包含用于检测核酸合成反应产物的检测试剂。
具有互补核苷酸序列交替地连接在单链里的核酸是本发明合成的目的，该核酸指的是具有互相互补核苷酸序列并排连接在单链里的核酸。此外，本发明中它应包含用于在互补链间成环的核苷酸序列。本发明中该序列称为成环序列。本发明合成的核酸基本上由通过成环序列连接的互相互补的链组成。一般而言，不管是否部分涉及碱基配对，一个在配对碱基分离时不能被分离成两个或更多分子的链称为单链。同一链中互补核苷酸序列可形成碱基配对。本发明通过容许具有核苷酸序列交替地连接在单链里的核酸在同一链内碱基配对，可获得分子内碱基配对的产物，该产物供给组成明显双链的区和不涉及碱基配对的环。
也就是，本发明具有互补核苷酸序列交替地连接在单链里的核酸可被定义为单链核酸，其中包含能在同一链中退火的互补核苷酸序列，并且其退火产物，在弯曲铰链部分组成不涉及碱基配对的环。具有互补核苷酸序列的核苷酸可退火成不涉及碱基配对的环。成环序列可以是任意的核苷酸序列。成环序列能碱基配对以启动用于置换的互补链的合成。并优先地被提供与位于其它区的核苷酸序列不同的序列，以获得特异性退火。例如，在一优选的实施方案中，成环序列基本上包含与F2c(或R2c)区相同的核苷酸序列，F2c(或R2c)区位于源于模板核酸的区(例如F1c或R1c)的3’-侧，并在同一链内退火。
本发明中基本相同的核苷酸序列定义如下。也就是，当以某序列作为模板合成的互补链与靶核苷酸序列退火以供给合成互补链的起点时，该某序列基本上与靶核苷酸序列相同。例如，基本上与F2相同的序列不但完全包括与F2相同的序列，还包括能作为模板的核苷酸序列，所述模板能给出与F2退火的核苷酸序列并能作为合成互补链的起点。本发明术语“退火”指的是通过根据沃森-克里克定律的碱基配对，形成双链结构的核酸。因此，即使组成碱基配对的核酸链为单链，如果分子内互补核苷酸序列碱基配对，退火也会发生。既然通过碱基配对核酸组成双链结构，因此本发明退火和杂交有相同的意思。
本发明组成核酸的核苷酸序列对数至少为1。本发明所期望的模型，核苷酸序列对数可为1的整倍数。该情况中，本发明组成核苷酸的互补核苷酸序列对数理论上没有上限，在由多组互补核苷酸序列构成的本发明合成产物核酸时，该核酸由重复相同的核苷酸序列组成。
本发明合成的具有互补核苷酸序列交替地连接在单链里的核酸与天然存在的核酸不可能有相同的结构。已知当通过核酸聚合酶作用合成核酸时如果用核苷酸衍生物作为底物，就可合成核酸衍生物。所用核苷酸衍生物包括放射性同位素标记的核苷酸或结合配体标记的核苷酸衍生物例如生物素或地高辛。这些核苷酸衍生物可用于标记产物核酸。或者，如果底物是荧光核苷酸，则产物核酸可能为荧光衍生物。而且产物可为DNA亦可为RNA。生成的产物通过结合实现核酸聚合反应的引物结构，聚合反应底物类型，聚合反应的试剂而定。
利用DNA聚合酶能启动有上述结构的核酸的合成，该DNA聚合酶具有链置换活性以及F1区具备在3’-末端与同一链上的部分F1c区退火形成包含可碱基配对的F2c区在内的环。有许多关于互补链合成反应的报道，其中形成发夹环，以发夹环序列自身为模板，而本发明中提供给发夹环部分能碱基配对的区，并且具有在合成互补链时利用该区的新特点。通过将该区用作合成的起点，先前以发夹环序列自身为模板合成的互补链被替换。接着位于替换链3’-末端R1c区(任意区)处于一种可碱基配对的状态。具有与该R1c互补序列的区通过退火进行互补链合成，导致生成核酸(2分子)，该核酸具有从F1延伸到R1c的核苷酸序列和其互补链通过成环序列通过彼此结合而形成。本发明中可任意地选择任意区例如上面R1c，如果它可与该区互补的核苷酸序列的多核苷酸退火。并且以多核苷酸为合成起点合成的互补链，该合成的互补链对本发明具有必不可少的作用。
本发明用到术语“核酸”，本发明核酸通常既包括DNA又包括RNA。
然而，功能为合成互补链的模板的，来自天然DNA或RNA的其核苷酸被人工衍生物所替换的核酸或修饰核苷酸也包括在本发明的核酸范围中。通常本发明的核酸被包含于生物样品中，生物样品包括动物，植物或微生物的组织，细胞，培养物和分泌物，或它们的提取物。本发明的生物样品包括细胞内寄生物基因组DNA或RNA例如病毒或支原体。本发明的核酸一般由包含在所述生物样品的核酸衍生而来。例如由mRNA合成cDNA，基于生物样品衍生来的核酸而扩增的核酸，是本发明的核酸的典型实例。
本发明核酸的特征是在3’-末端被提供F1区，可与同一链上的部分F1c退火，通过该F1区与同一链上的F1c退火，可形成包含可碱基配对的F2c区在内的环，可在各种方法中得到该核酸。在最优选的实施方案中，利用有下述结构的寡核苷酸，通过合成互补链的反应可提供该结构。
也就是，本发明有效的寡核苷酸至少由下面两个区X2和X1c构成，其中X1c与X2的5’-侧相连。
X2区具有与核酸中X2c区互补的核苷酸序列，所述核酸具有特异核苷酸序列。
X1c区有与X1c区基本上相同核苷酸序列，所述X1c区位于具有特异核苷酸序列的核酸里X2c区5’-侧。
此处通过本发明寡核苷酸结构所决定的具有特异核苷酸序列的核酸指的是以本发明寡核苷酸为引物时充当模板的核酸。在基于本发明的合成方法检测核酸情况中，所述具有特异核苷酸序列的核酸是检测的靶子或是检测靶子衍生的核酸。具有特异核苷酸序列的核酸指的是其中至少一部分核苷酸序列是公开的或可预言的。公开的部分核苷酸序列是X2c区和位于其5’-侧X1c区。可推测这2个区是邻近的或隔开存在的。通过两区的相对位置，可由产物核酸自我退火时，形成的环部状态来决定。优选两区的距离是互相分离不太远以便使核酸产物自我退火优先于分子间的退火。因此，两区位置关系优选的是邻近的，距离通常为0到500碱基。然而，在下述自我退火成环中，有这样的情况，预计的所述两区相互太近的状态下将不利于环的形成。在环中，需要一种新寡核苷酸退火和以所述寡核苷酸为合成的起点顺利启动链置换的互补链反应的结构。更优选的是，X2c区和位于其5’-侧X1c区的距离设计成0到100个碱基，更期望是10到70个碱基。数值为不包括X1c和X2的长度。构成环部分的碱基数该长度加上相当于X2的区。
组成基于本发明所述寡核苷酸的核苷酸序列特征所用术语“相同的”和”互补的”并不意味着绝对相同和绝对互补。也就是，与某序列相同的序列包括与某序列退火的核苷酸序列互补的序列。另一方面，互补序列是严格条件下能退火的序列，提供作为互补链合成的起点3’-末端。
通常，对于具有特异核苷酸序列的核酸，组成本发明寡核苷酸的X2区和X1c区位置邻近而没有重叠。如果核苷酸序列中有共同部分，两区就会有部分覆盖，由于X2起到引物的功能，它总是3’-末端。另一方面，如下所述X1c将引物的作用供给互补链3’-末端，该互补链由核酸为模板合成，因此应被设计在5’-末端。以该寡核苷酸为合成的起点得到互补链，在下一步中以该互补链为模板合成反向互补链。并且最终本发明寡核苷酸部分为模板被拷贝进互补链。拷贝生成的3’-末端有核苷酸序列X1，该序列在同一链中与X1c退火成环。
本发明中，寡核苷酸是满足两个要求的核苷酸，即必须能形成互补碱基配对，并且在3’-末端供给-OH基为互补链合成的起点。因此，其主链并不必限于磷酸二酯键一种连接。例如，它可由硫代磷酸衍生物组成主链或者是基于肽连接的肽核酸，所述硫代磷酸衍生物为S取代P。碱基是指那些可互补配对的碱基。天然存在五种碱基，即A，C，T，G和U，碱基也可为类似物例如溴脱氧尿苷。优选的是，本发明寡核苷酸不仅可用做合成的起点还可为互补链合成的模板。本发明术语多核苷酸包括寡核苷酸。本发明所用术语“多核苷酸”的链长没有被限制，而所用术语“寡核苷酸”指的是有相对短的链长的核苷酸聚合物。
下述各种核酸合成反应中在给定的条件下，本发明寡核苷酸链有能与互补链碱基配对并保持一定的特异性这样一种长度。具体地，它由5-200个碱基组成，更优选10-50个碱基对。识别已知聚合酶的链长至少为5个碱基。该聚合酶催化依靠序列的核酸合成反应。所以退火部分的链长应长于该长度。另外，统计学上所期望10个碱基的长度或更长以获得所期望核苷酸特异性。另一方面，由于化学合成制备太长核苷酸序列比较困难。因此上述链长是所期望范围的实例。例证的链长指的是部分与互补链退火的链长。正如下面所描述的，本发明寡核苷酸可最终至少分别与两区退火。因此，这里例证的链长应理解为组成寡核苷酸的每个区的链长。
此外，本发明的寡核苷酸可用已知的标记物标记。标记物包括结合配体例如地高辛和生物素，酶，荧光物，发光物，放射性同位素。众所周知通过荧光类似物替换组成寡核苷酸的碱基的技术(WO95/05391，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，6644-6648，1994)。
本发明其它寡核苷酸还可被结合到固相。或者，寡核苷酸的任意部分可用结合配体标记，例如生物素，间接地由结合配体例如固定抗生物素蛋白所固定。固定寡核苷酸为合成的起点时，合成反应产物核酸为固相所捕获，有利于其分离。通过核酸特异性指示物或与标记探针的杂交可对分离部分进行检测。靶核酸片段由任意限制酶消化产物还可得以回收。
本发明所用术语“模板”是指用于合成互补链时作为模板的核酸。具有核苷酸序列与模板互补的互补链意思是指对应于模板的链。但是二者的关系只是相对的。即合成的互补链可以再次起到模板的功能。也就是，互补链可作为模板。
本发明有用的寡核苷酸并不限于上述2区，可包含额外区。将X2和X1c分别设计到3’-和5’-末端，任意序列可在其间插入。例如它可是限制酶的识别序列，RNA聚合酶所识别的启动子，或编码核酶的DNA。通过利用其作为限制酶的识别序列，本发明合成的具有互补的序列交替地连接到单链里的核酸可被断裂成同样长度的双链核苷酸。将启动子序列设计成RNA聚合酶能识别的，本发明的合成产物作为模板以允许进一步转录成RNA。还可通过设计编码核酶的DNA，转录产物自断裂的系统就可实现。这些额外核苷酸序列是那些在形成双链后发挥作用的序列。因此，在本发明单链核苷酸成环时，这些序列不起作用，直至核酸被延伸并在缺环情况下退火成具有互补核苷酸序列的链时才发挥作用。
当启动子与基于本发明的寡核苷酸以允许合成区转录的方向进行结合时，本发明在相同核苷酸序列被重复的部位的反应产物实现高效转录系统。通过将该系统与合适的表达系统结合，就可翻译蛋白。即利用该系统在细菌或动物细胞或在体外转录和翻译成蛋白。
可化学合成本发明具有上述结构的寡核苷酸。或者，天然核酸由例如限制酶断裂可以改变上述的碱基序列的组成或它们的连接方式。
本发明实施合成反应的基本原理参考图5-图6，该反应通过利用上述有用的寡核苷酸与DNA聚合酶结合得以实施，在核酸合成反应中该DNA聚合酶有链置换反应的活性。首先X2(相应于F2)作为模板，上述寡核苷酸(图5中的FA)与模板核酸退火，以提供互补链合成的起点。图5中由FA合成起点合成的互补链被由外引物(F3)合成的互补链(下述)所替换而形成单链(图5-A)。在进一步合成互补链时，该互补链与正生成的互补链互补，图5-A合成的互补链核酸3’-末端有与本发明寡核苷酸互补的核苷酸序列。即由于本发明寡核苷酸5’-末端有与X1c区(相应于F1c)相同的序列。如此合成的核酸3’-末端有互补序列X1(F1)。图5显示从R1为合成起点合成的互补链被由外引物R3为合成起点合成的互补链所替换。一旦3’-末端部分通过该替换使其可碱基配对，在同一链上的3’-末端X1(F1)与X1c(F1c)退火，进行以自身为模板的延伸反应(图5-B)。然后，位于其3’-末端的X2c(F2c)形成环，该环不涉及碱基配对。本发明寡核苷酸中X2(F2)退火成该环，以所述寡核苷酸为合成起点合成互补链(图5-B)。以先合成的产物为模板的合成反应的产物，通过链置换反应被替换使其碱基配对。
本发明通过用一种基本组成为可进行核酸合成的任意反向引物，其中所述核酸是以该寡核苷酸为引物合成的互补链用作模板。大多数核酸合成产物如图6中所示的可被得到。从图6中可看出，(D)是本发明所期望的核酸产物，具有互补的核苷酸序列交替地连接在单链里。通过处理例如热变性一旦转变成单链，其它产物(E)再次作为形成(D)的模板。如果双链产物(D)核酸通过热变性被转换成单链，同一链内发生退火高几率而不能形成最初的双链。这是因为具有相同解链温度(Tm)的互补链的分子内反应优先于分子间反应进行。从同一链中退火产物(D)衍生的每一条单链在同一链中被退火，并且返回到(B)状态。每条链进一步分别供给一个(D)分子和(E)分子。通过重复这些步骤，有可能连续合成具有互补核苷酸序列交替地连接在单链里的核酸。在1循环中形成的模板和产物以指数形式增加，因此使反应非常有效。
为实现图5(A)状态，最初合成的互补链，至少在反向引物退火的部分，可碱基配对。该步可通过任意方法得以完成。针对最初的模板，尤其准备了一个外引物，该外引物比由本发明寡核苷酸退火的F2c区在模板上更与3’-侧的F3c区退火。如果通过聚合酶催化链置换型互补链合成，将该外引物用作合成的起点以合成互补链，本发明从F2c为合成起点合成的互补链被替换，结果通过R1与R1c区退火使其碱基配对(图5)。通过利用链置换反应，直到现在在等温条件下该反应可得以进行。
在使用外引物时，在从F2c合成之后开始进行从外引物(F3)的合成。在最简单的方法中，使内引物浓度高于外引物的浓度。特定地，所用引物通常在2倍到50倍，优选4倍到10倍的浓度，因此反应可按所期望的进行。此外，设置外引物解链温度(Tm)低于内引物中X1的Tm(相当于F1和R1)，因此可以控制合成的时间。也就是，(外引物F3F3c)≤F2c/F2)≤(F1c/F1)或(外引物/在模板3’-侧的区)≤(X2cX2)≤(X1cX1)。这里，(F2c/F2)≤(F1c/F1)是因为F1c/F1间退火优先与F2退火成环，F1c/F1间退火是分子内的反应，并可因此高几率优先进行。然而，为了给出更多的反应条件而考虑到Tm是有意义的。甚至在设计反向引物中，相似的反应条件理所当然的应考虑到。通过利用这种关系，可获得统计学上理想反应的条件。如果其它条件不变，通过结合退火的互补链的长度和组成碱基配对的碱基，理论上解链温度(Tm)可以被计算出来。因此，那些本领域的技术人员根据公开的本说明书能导出更好的条件。
此外，称为邻近堆积的现象控制外引物退火时间的选择。邻近堆积使不能独立退火的寡核苷酸在邻近双链部分上能退火的现象(ChiaraBorghesi-Nicoletti et al.，Bio Techniques，12，474-477(1992))。即外引物设计成邻近F2c(X2c)并且不能独立地退火。通过这样做，直到F2c(X2c)退火时，最初的外引物才能退火，因此F2c(X2c)的退火优先进行，根据这一原则，实例显示作为一系列反应引物的必需寡核苷酸的核苷酸序列所设置。该步骤在通过加热变性或用DNA解旋酶也可得以实现。
如果具有F2c(X2c)的模板核酸为RNA，图5-(A)状态也可通过不同的方法实现。例如，如果该RNA链被分解，使R1可碱基配对。也就是使F2与RNA中F2c退火并且通过反转录酶合成的互补链为DNA。通过碱变性或用核糖核酸酶处理作用于DNA/RNA双链中的RNA，作为模板的RNA被分解，其中从F2合成的DNA形成单链。由于酶选择性分解双链DNA/RNA中的RNA，RNase H的某些反转录酶或核糖核酸酶活性得以应用。这种方式中，使反向引物与能碱基配对的R1c退火。因此，不必需要导致R1c处于碱基配对的外引物。
或者，反转录酶链置换活性可被用在通过如上述外引物的链置换，这种情况中，反应系统可仅通过反转录酶构成，即用RNA为模板，通过反转录酶在模板中F2与F2c的退火有可能合成互补链和从退火为F3c外引物F3为合成起点合成互补链以及同时替换先前合成的互补链，外引物F3位于F2c的3’-侧。当反转录酶以DNA为模板进行合成互补链的反应时，所有通过反转录酶进行合成互补链的反应包括以与R1c退火的R1作为合成起点的互补链的合成，该互补链在链置换反应中作为模板；以与R3c退火的R3作为合成起点的互补链的合成及同时的链置换发应，R3位于R3c的3’-侧。在所给反应条件下不能预计反转录酶显示DNA/RNA链置换活性时，可以结合具有如上述链置换活性的DNA聚合酶。如上述以RNA为模板获得第一条单链核酸的模式为本发明的优选模式。另一方面，如果使用既具有链置换活性又有反转录酶活性的DNA聚合酶诸如Bca DNA聚合酶，通过相同的酶不但从RNA的第一条单链核酸的合成，而且接下去以DNA为模板的反应可得以类似地进行。
通过利用有特定结构的反向引物，本发明上述反应方式导致各种内在的变化。最有效的变化在下面描述。也就是，组成[5]中所描述的寡核苷酸在本发明最有利的模型中用作反向引物。[5]中的寡核苷酸是其中以F2为引物合成的互补链中的任意区R2c和R1c分别为X2c和X1c的一种寡核苷酸。通过使用这样反向引物，有意义链和反义链中发生一系列反应(向前的和反向的)，所述一系列反应是指成环反应和从该环合成和替换互补链的反应。结果本发明中有效合成核酸的反应得到大大改善，该核酸具有互补核苷酸序列交替地连接在单链上，而等温条件下一系列这样的反应是可以进行的。在下文中，作为参考更具体地描述了

图1到3所概述的该模型。
下面模型中，基于本发明的2种寡核苷酸得以制备。为了说明，将其命名为FA和RA.组成FA和RA的区如下所述X2 X1cFA F2 F1cRA R2 R1c这里，F2是模板核酸中F2c区的互补核苷酸序列。R2与任意区R2c互补的核苷酸序列，R2c包含在以F2为引物合成的互补链中。F1c和R1c分别是位于F2c和R2c下游的任意核苷酸序列。F2和R2间的距离可是任意的。即使其长度约1kbp，合适的条件下，充分合成是可行的，尽管取决于用于实施合成互补链的DNA聚合酶的合成能力，特定地，当用到Bst DNA聚合酶时，如果F2和R2c的距离为800bp，优选500bp或更小，就一定能合成所需的产物。涉及温度循环的PCR中，通过重点改变温度使酶活性得到降低被认为是降低了长核苷酸序列合成效率。在本发明优选的模式中，扩增核酸步骤中不需要温度循环，因此甚至长核苷酸序列的合成和扩增可确信能实现。
首先，针对模板核酸使FA中F2退火，并用作互补链合成的起点。接下去直到图1(4)的反应步骤与本发明先前所述的基本模型(图5)相同。图1(2)中退火序列为F3，就是上述的外部引物。用以该引物为合成起点进行链置换型互补链合成反应的DNA聚合酶从FA合成的互补链被置换并且处于碱基配对。
当(4)中R2c处于碱基配对时，在R2c/R2的结合里反向引物RA于此退火。以该位置为合成起点进行互补链的合成直到该链延伸到在FA 5’-末端的F1c。在该合成互补链的反应之后，用于替换的外引物R3在此退火合成互补链，在此期间链置换也在进行，使从RA为合成起点合成的互补链作被替换。由此替换的互补链中，RA位于其5’-端，与FA互补的序列位于其3’-端。
因此在被替换的单链核酸3’-侧，同一链上存在有与F1c互补的F1序列。F1迅速与同一分子内排列的F1c退火以启动互补链的合成。当在同一链中3’-末端(F1)与F1c退火时，形成含F2c的环。正如图2-(7)明确显示的，该环部分可碱基配对。本发明的寡核苷酸FA与该环部分退火，并作为互补链(7)的合成起点，所述寡核苷酸具有与F2c互补的序列。当在先前从F1启动的互补链合成中的反应产物被替换时，从环进行互补链的合成。结果自身为模板合成的互补链在3’-末端再次可碱基配对。该3’-末端被提供同一链中能退火到R1c的R1区，并且由于分子内的反应迅速，所述两链被优先退火。与上述反应相同的从以FA为模板合成的3’-末端开始的反应也在该区得以进行。结果，通过连续的合成互补链及接下去的置换，本发明具有互补核苷酸序列交替地连接到相同单链的核酸，从3’-末端R1为起始点得以继续延伸。由于R2c总是被包含在通过3’-末端R1的分子内退火形成的环中，在接下去的反应中提供R2的寡核苷酸(RA)在3’-末端退火成环。
当注意力集中在从寡核苷酸开始被合成为互补链核酸时，该核酸以自身为模板得以延伸，所述寡核苷酸在单链核酸中退火成环，本发明具有互补核苷酸序列交替地连接在单链里的核酸的合成也在进行。即当自环的互补链的合成到图2-(7)中RA时，合成得以完成。然后，当通过该核酸替换的核酸的合成启动互补链(图3-(8))合成时，反应到达曾作为合成起点的环，并且替换重新开始。这种方式中，从环开始被合成的核酸也被替换。结果得到同一链中能退火的3’-末端R1(图3-(10))。该3’-末端R1在同一链中与R1c退火以启动互补链的合成。除了用F替代R外该反应与图2-(7)中的相同。因此，图3-(10)所示结构有起到新核酸的作用得以继续自我延伸并形成新的核酸。
与上述反应相反，从图3-(10)所示的核酸启动合成核酸的反应，导致从合成起点3’-末端F1开始延伸，也就是说，本发明中一个核酸被延伸，继续提供能启动延伸的新核酸的反应分别进行，而且，随着链的延伸，不仅在末端而且在同一链上产生许多成环序列，当这些成环序列经链置换反应可碱基配对时，寡核苷酸退火充当形成新核酸的反应的起点。通过不但在末端而且在链内开始的合成反应，获得进一步有效的扩增。基于本发明的寡核苷酸RA被结合为如上所述的反向引物，其中延伸和随后新核酸的形成得以进行。而且，本发明中该新形成的核酸本身得到了延伸，也导致了后面新核酸的形成，一系列这样的反应，理论上可永久地获得非常有效的核酸扩增。另外，本发明的反应可在等温条件下进行。
因此，积累的反应产物具有一种结构，该结构在F1和R1间具有核苷酸序列，并且其互补链交替地连接，然而，重复单元两末端均有由连续核苷酸序列F2-F1(F2c-F1c)或R2-R1(R2c-R1c)组成的区，例如，图3-(9)中，序列(R2-F2c)-(F1-R2c)-(R1-F1c)-(F2-R2c)自5’-侧按照这样的顺序连接。这是因为基于本发明的扩增反应以这样一种原理进行，即反应以寡核苷酸作为合成起点从F2(或R2)开始，接着，互补链通过以自身3’-末端作为合成起点从F1(或R1)合成的反应得以延伸。
这里，在最优选的模型中，本发明寡核苷酸FA和RA为退火成环部分的寡核苷酸。然而即使不使用这些具有限制结构的寡核苷酸，本发明扩增反应可通过利用能启动自环开始的互补链合成的寡核苷酸而得以实现，也就是，正在延伸的3’-末端，一旦被自从环开始合成的互补链所替换，就又一次供给环部分。因为从环开始的互补链合成中总是以具有互补核苷酸序列交替地连接到单链里核酸作为模板。很明显，可以合成本发明所需核酸。然而，如此合成的核酸通过置换后形成环进行互补链的合成。但是没有可用于接下去形成环的3’-末端，因此不能作为新模板使用。所以不象通过FA或RA启动合成的核酸，这种情况中的产物，不能得到所希望的指数式扩增。由于这种原因，具有FA或RA结构的寡核苷酸可用于高效地合成本发明的核酸。
一系列这样的反应通过下面的描述得以进行，向模板单链核酸添加下面的成分，并接着在组成FA和RA的核苷酸序列与其互补核苷酸序列能形成稳定碱基配对而酶的活性能得以保持的这样一种温度下培养混合物。
·4种寡核苷酸FA，RA，外引物F3，和外引物R3，·用于进行置换型互补链合成的DNA聚合酶，·用作DNA聚合酶底物的寡核苷酸。
因此，无需设定PCR之类的温度周期。稳定的碱基配对这里指的是反应系统中至少一部分寡核苷酸可提供互补链合成起点的状态。例如，能导致稳定碱基配对所需条件将温度设置为低于解链温度(Tm)。一般而言，解链温度(Tm)是具有互补核苷酸序列的核酸有50％碱基配对。本发明中将温度设定为解链温度(Tm)或低于解链温度不是最重要的条件，但被认为是达到高效合成的一个反应条件。如果所用模板核酸是双链，所述核酸至少在寡核苷酸退火区的应可碱基配对。由于这个原因，一般进行热变性，并且在反应开始前作为预处理仅进行一次。
该反应在下面成分存在下进行，能使酶反应处于合适pH值的缓冲液，退火或维持酶催化活性的必需盐，保护酶的介质以及调控解链温度(Tm)所必须的调控物。对于缓冲液，例如所用的在中性或弱碱性范围有缓冲作用的Tris-HCl。根据所用的DNA聚合酶调节pH值，对于盐，KCl，NaCl，(NH4)2SO4等适量加入以保持酶的活性并调控核酸的解链温度(Tm)，保护酶的介质使用牛血清白蛋白或糖类。此外，一般用二甲基亚砜(DMSO)或甲酰胺作为解链温度(Tm)的调控物。通过利用解链温度(Tm)的调控物在限定的温度条件下寡核苷酸的退火得到了调控。而且，甜菜碱(N，N，N-三甲基甘氨酸)或四烷基铵盐(tetraalkyl)通过其等稳定作用(isostabilization)对于改善链置换的效率也是有效的。通过向反应溶液中加入0.2-3.0M甜菜碱，优选0.5-1.5M，可得到所希望的本发明对核酸扩增的促进作用。因为这些解链温度的调控物有降低解链温度的作用，那些合适的严谨性和反应性条件要结合盐的浓度，反应温度等凭经验而定。
本发明重要的特征是除非许多区的位置关系得以保持，否则一系列反应不能进行。由于这个特征，伴随互补链非特异合成的非特异合成反应得到了有效阻止。也就是即使发生某非特异反应，在合成接下去的扩增步骤中产物作为起始物质的可能性也得到了降低，而且，通过许多区调控反应的进展，有可能导致在类似的核苷酸序列中能精确的鉴定出所需产物的检测系统可被随意地组成。
利用所述特征检测基因突变。本发明使用外引物模式中，所用4个引物，即2个外引物和本发明寡核苷酸组成的2引物。若所述6区包含在4个寡核苷酸中不起作用的话，则本发明的合成反应不能进行。具体地，作为互补链合成起点的每个寡核苷酸3’-末端的序列和以所述互补链为合成起点的序列X1c区5’-末端的序列是重要的序列。因此设计这些重要的序列使相对应的突变能被检测，本发明合成反应的产物能得以观察，存在或不存在诸如碱基缺失或插入的突变、或诸如SNPs的遗传多态性可得到广泛的分析。更具体地，设计估计有突变或多态性的碱基使其与作为互补链合成起点的寡核苷酸3’-末端附近的或在互补链作为合成起点的5’-末端的碱基相当，如果在互补链合成起点的3’-末端或其附近存在误配，互补链合成核酸的反应受到明显地抑制。本发明中除非初始反应中产物末端的结构导致重复反应，否则不会得到高度扩增的反应。因此，甚至在发生错误合成时，构成扩增反应的互补链的合成在某步骤中总是被中断，因此，在误配的情况下不会存在高度扩增的反应。结果是误配有效地抑制了扩增反应，最终导致产生准确的结果。也就是可以说基于本发明的核酸的扩增反应对核苷酸序列的检查有一高度完整的机制。这些特征是在诸如扩增反应仅在2个区进行的PCR方法中很难预料到的优点。
合成互补序列后，显示本发明所用寡核苷酸特征的X1c区可作为合成的起点，并且该互补序列与新合成的同一链中X1序列退火，其中的合成反应以自身为模板进行的。因此，即使形成在前沿领域研究中常常成为问题的所谓的引物二聚物，该寡核苷酸不能成环。因此，归因于引物二聚物形成的非特异性扩增，在理论上是不能发生的。由此，所述寡核苷酸有助于改善该反应的特异性。
此外，本发明所示外引物F3(图1-(2))或R3(图2-(5))被结合并由此使上述一系列反应在等温条件下得以进行。也就是，本发明提供一种扩增具有互补序列交替地连接在单链里的核酸的方法。其中包含在上述9中所示的步骤。该方法中，在F2c/F2间，R2c/R2间，F1c/F1间及R1c/R1间选择能发生稳定退火的温度条件，通过在F2c/F2和R2c/R2的退火而分别地促进邻近堆积(contiguous stacking)现象优选的是确定在F3c/F3和R3c/R3间退火。
本发明用到术语核酸“合成”和“扩增”。本发明核酸的合成指的是从作为合成起点的寡核苷酸开始的核酸延伸。如果不但所述合成而且其它核酸的形成以及所形成核酸的反应的延伸能够连续进行，一系列这样的反应广义上称为扩增。
所产生的单链核酸在3’-末端有能与同一链中F1c部分退火的F1区，进行同一链中F1区与F1c的退火，能形成含有可碱基配对的F2c区的环，是本发明重要的成分。这样的单链核酸还可以下述原理的方式供给。也就是，互补链的合成根据具有下述结构的引物才容许进行。5’-[与引物中X1c区退火的X1区]-[能形成碱基配对序列环]-[X1c区]-[具有与模板互补的序列区]-3’。
制备具有与模板互补的序列区，两个核苷酸序列，即一个核苷酸序列(引物FA)与F1互补并且一个核苷酸序列(引物RA)与R1c互补。组成要合成核酸的核苷酸序列组成包含从F1区延伸到R1c区的核苷酸序列和从具有与该核苷酸序列互补的核苷酸序列的R1区延伸到F1c区的核苷酸序列。能在引物内退火的X1c和X1可为任意的序列。然而，在引物FA和RA间的区内，优选的是使该X1c/X1区的序列不同。
首先，通过引物FA从模板核酸F1区进行互补链的合成，接着在已合成的互补链中R1c区可碱基配对，使其它引物退火形成互补链的合成起点，该步骤中合成的互补链3’-末端有与组成起始合成链5’-末端的引物FA互补的序列。因此在其3’-末端被提供X1区，其中X1区在同一链中与X1c区退火成环。由此提供本发明特征性3’-末端的结构，接下去的反应组成先前显示为最优选模式的系统。退火成环部分的寡核苷酸在3’-末端被提供X2区，在5’-末端被提供X1区，X2区与环中X2c区互补。在先前的反应系统中，用引物FA和RA合成与模板核酸互补的链，将环结构供给核酸的3’-末端。该方法中，通过很短的引物就可有效地提供本发明特征性末端结构。另一方面，所述模型中，组成环的全部核苷酸序列可作为引物被提供，并且必须合成长引物。
如果包含限制酶识别区的核苷酸序列可用作反向引物，则可构建本发明不同的模型。利用包含限制酶识别序列的反向引物的反应参考图6具体描述。当图6-(D)得以完成时，通过限制酶产生切口相当于反向引物中限制酶识别位点。以该切口为合成起点开始合成链置换型互补链的反应。因为反向引物位于组成(D)的双链核酸的两末端，合成互补链的反应也可从两末端开始，尽管基本上基于先端技术中所述的SDA方法，本发明作为模板的核苷酸序列具有互补核苷酸序列交替地连接的结构，从而构成本发明独一无二的核酸系统。作为要产生切口的反向引物互补链的一部分应被设计为结合dNTP衍生物，通过限制酶阻止双链断裂产生对核酸酶一种对抗性。
也可能将RNA聚合酶启动子插入反向引物。图6-(D)中从两末端的转录通过RNA聚合酶识别该启动子得以进行，在该情况中与先前应用SDA的模型非常相似。
本发明合成的核酸是单链，就单链而言，由互补核苷酸序列构成，其大部分均为碱基配对的。通过利用这个特征，对合成的产物可进行检测。通过实施本发明合成核酸的方法，在有荧光色素作为双链特异性嵌入剂(double-specific intercalater)例如溴化乙锭，SYBR Green I或Pico Green，随着产物的增加可观察到荧光的强度增加。通过监测它，就可能在封闭系统中跟踪实时(real-time)合成反应。也可考虑在PCR方法中应用该类型的检测系统，但是认为有许多问题，因为不能区分产物信号和引物二聚物的信号等。然而，当本发明应用该系统时，增加非特异碱基配对的能力非常低，因此，预计高灵敏度和低干扰可能同时能获得，与应用双链特异性嵌入剂(double-specific intercalater)相似，在同一系统中可利用荧光能量的转移用于实现检测系统的方法。
本发明合成核酸的方法通过DNA聚合酶催化合成链置换型的互补链反应而得到支持。上述反应期间，也包含不必需链置换型聚合酶的反应步骤。然而，为了组成试剂的简单化及经济的观点，使用一种DNA聚合酶有利，该种DNA聚合酶，下列的酶是已知的。此外，本发明范围中可利用这些酶的各种突变体，它们都具有用于互补链合成的序列-依赖活性和链置换活性。其中突变体指的是包括那些仅具有导致酶所需的催化活性的结构或那些通过例如氨基酸中突变对催化活性，稳定性或热稳定性所进行的修饰的突变体。
Bst DNA聚合酶Bca(exo-)DNA聚合酶DNA聚合酶I克列诺(Klenow)片段Vent DNA聚合酶Vent(Exo-)DNA聚合酶(缺少核酸外切酶活性的Vent DNA聚合酶)Deep Vent DNA聚合酶Deep Vent(Exo-)DNA聚合酶(缺少核酸外切酶活性的Deep Vent DNA聚合酶)Φ29 phage DNA聚合酶MS-2 phage DNA聚合酶Z-Taq DNA聚合酶(宝酒造)KOD DNA聚合酶(东洋纺绩)这些酶中，Bst DNA聚合酶和Bca(exo-)DNA聚合酶是特别所需的酶，因为它们具有某种程度的热稳定性和高催化活性。在优选的实施方案中，本发明的反应可等温的实现，但由于解链温度的调节(Tm)等，不可能总是能利用所需温度条件来维持酶的稳定。因此，它是酶的热稳定所需的条件之一。尽管等温反应是可行的，热变性可提供核酸作为最初的模板，在这方面，热稳定酶的使用拓宽了试验方案的选择。
Vent(Exo-)DNA聚合酶是既有链置换活性又有高度热稳定性的酶。已知涉及通过DNA聚合酶链置换的互补链合成反应通过加入单链结合蛋白得到促进(Paul M.Lizardi et al.，Nature Genetics，19，225-232，July，1998)。本发明中应用该反应，并且通过加入单链结合蛋白，可以预计促进合成互补链的所需效果。例如，T4基因32作为Vent(Exo-)DNA聚合酶单链结合蛋白是有效的。
由于DNA聚合酶没有3’-5’核酸外切酶活性，互补链的合成不能在模板5’-末端停止，导致产生一碱基的突出，这是已知的现象。本发明该现象并不是优选的，因为当互补链的合成到达末端时，3’-末端导致启动下一互补链的合成。然而，通过DNA聚合酶的高几率添加碱基“A”到3’-末端，选择序列以使从3’-末端的合成从“A”开始，如果通过dATP添加错误的额外碱基，也不会产生问题。此外，在互补链合成的期间甚至3’-末端被突出，利用3’→5’核酸外切酶的活性消化突出使其成为钝末端。例如，因为Vent DNA聚合酶有这样的活性，该酶可与(Exo-)DNA聚合酶混合使用以解决所述的问题。
本发明合成或扩增核酸所必需的各种试剂可被预先包装，并以试剂盒的形式提供，具体地，本发明所提供的试剂盒包含作为合成互补链合成的引物和用于置换反应的外引物所必需的各种寡核苷酸，用于互补链合成的底物dNTP，用于实现链置换型互补链合成的DNA聚合酶，为酶反应提供合适条件的缓冲液，和用于检测合成反应产物所必需的介质。具体地，本发明优选的模式中，反应期间无需加入的试剂，并由此对于移入反应容器后一个反应所必需供给的试剂，其中仅通过加入样品就可启动该反应。通过利用发光信号或荧光信号可在容器内检测反应产物的系统。反应后不必打开和关闭容器。这对于预防污染是非常可取的。
本发明合成具有互补核苷酸序列交替地连接在单链内的核酸。该核酸具有例如下面的用途第一特征是利用一分子中具有互补序列的特定结构带来的优势，该特征预计有利于检测，即有已知用于检测核酸的系统，其中其变化的信号取决于与互补核苷酸序列碱基配对。例如，通过结合使用双链特异性嵌入剂作为如上所述的检测试剂的方法，充分利用本发明合成产物特征的检测系统可得以实现。如果本发明合成反应的产物在所述检测系统发生一次热变性，并且返回到原始温度，分子内退火优先发生，并因此容许互补序列之间快速碱基配对。如果存在非特异性产物，分子中它们没有互补序列从而使通过热变性分离成2或更多的分子后，它们不能立刻就返回到原始双链。通过在检测前提供的热变性步骤，伴随非特异反应的干扰得以降低。如果所用的DNA聚合酶不抗热，热变性步骤有反应终止的意思，并因此有利于控制反应温度。
第二特征是常常形成能碱基配对的环。能碱基配对的环的结构在图4中显示。如图4中看到的该环由核苷酸序列F2c(X2c)和插入F2c-F1c(X1c)之间的核苷酸序列构成，F2c(X2c)可进行引物退火。F2c-F1c间序列(或更普遍的形式X2c-X1c间)是源于模板的核苷酸衍生序列。因此，如果具有互补核苷酸序列的探针与该区杂交，模板的特异性检测是可行的。此外，该区常常可碱基配对，因此，热变性不必先于杂交进行。组成本发明扩增反应产物中的环的核苷酸可能有任意的长度。因此，如果希望与探针杂交，通过引物要被退火的区和通过探针要被杂交的区分别设计以阻止它们的竞争，其中可能得到理想反应条件。
根据本发明优选的模式，在单链核酸中供给大量能碱基配对的环。这意味着大量的探针可与一分子核酸杂交以容许高灵敏度的检测。因此不仅可能实现改进灵敏度还可能实现基于特殊反应原理例如聚集作用来检测核酸的方法。例如，将固定在精细颗粒例如聚苯乙烯乳胶上的探针加入到本发明反应产物中，观察乳胶颗粒的聚集作用为产物与探针杂交。聚集作用的强度通过光学测定就可进行高灵敏度和定量观察。或者还可通过裸眼观察聚集作用，所以还可建立不用光学的测定装置的反应系统。
此外，本发明反应产物容许许多要结合的标记，其中每核酸分子能进行层析检测。在免疫测定领域里，实际所应用是利用可见的检测标记使用层析介质的分析方法(免疫层析)。该方法基于分析物夹在固定在层析介质上的抗体和标记抗体间的原理，未反应的标记成分被洗脱。本发明的反应产物使该原理应用到核酸分析上。也就是，制备针对环部分的标记探针并固定在层析介质上为捕获准备捕获探针，以容许在层析介质里进行分析。序列与环部分互补的捕获探针得以利用，由于本发明的反应产物具有大量的环，产物与大量标记的探针结合以给出肉眼可识别信号。
本发明反应产物常常能供给碱基配对的环区，能拓宽其它各种检测系统。例如，利用表面胞质基因组使用固定探针检测该环部分的系统是可行的。此外，如果用双链特异嵌入物标记该环部分的探针，就可进行更灵敏的荧光分析。或积极利用本发明合成核酸的能力在3’-和5’-侧以形成能碱基配对的环。例如，设计一个环使其在正常型和不正常型间有共同的核苷酸序列，而设计其它环使其在其中产生差异。通过探针证实共同部分存在基因，而在其它区证实有不正常存在时，有可能组成特征分析系统。因为本发明合成核酸的反应也能等温的进行，值得一提的优点是，通过一般荧光光度计可进行实时(real-time)分析。直到此时，同一链中要退火的核酸的结构是已知的。然而，通过本发明获得的具有核苷酸序列交替地连接在单链里的核酸是新的，因为它包含大量的能与其它碱基配对的环。
另一方面，通过本发明反应产物所给的大量的环自身能被用作探针，例如，在DNA芯片里，探针在有限的区域内高密度堆积，而该技术中可固定在某区域寡核苷酸数量有限，因此通过利用本发明产物大量能退火的探针可被高密度固定，即本发明的反应产物在DNA芯片上可用作固定的探针，扩增后反应产物可通过本领域已知的任何技术得以固定，或用固定的寡核苷酸作为本发明扩增反应的寡核苷酸，导致生成固定反应产物。因此通过使用固定的探针，大量样品DNA在有限的区域内得以杂交，结果预计可得到高信号。
附图简述图1是本发明优选的模式中反应原理(1)-(4)部分的图解。
图2是本发明优选的模式中反应原理(5)-(7)部分的图解。
图3是本发明优选的模式中反应原理(8)-(10)部分的图解。
图4是通过本发明单链核酸所形成的环结构的图解。
图5是本发明基本的模式中(A)-(B)部分的图解。
图6是本发明基本的模式中(C)-(D)部分的图解。
图7是显示M13mp18靶核苷酸序列中组成寡核苷酸的每个核苷酸序列的位置关系。
图8是显示通过以M13mp18为模板合成本发明单链核酸的方法获得的产物琼脂糖电泳结果的照片。
泳道1XIV分子量标记泳道21 fmol M13mp18 dsDNA泳道3没有靶图9是显示限制酶消化产物的琼脂糖凝胶电泳结果的照片，其中所述产物通过本发明核酸合成反应在实施例1中得到的。
泳道1XIV分子量标记泳道2纯化产物的BamHI消化泳道3纯化产物的PvuII消化泳道4纯化产物的HindIII消化图10是显示产物琼脂糖凝胶电泳结果的照片，所述产物是在甜菜碱存在下以M13mp18为模板通过本发明合成单链核酸的方法获得的，0，0.5，1和2是指加入反应溶液中的甜菜碱的浓度(M)，N为阴性对照，-21是指模板DNA的浓度为10-21mol。
图11是显示从HVB衍生来的靶核苷酸序列中组成寡核苷酸的每个核苷酸序列的位置关系。
图12是显示通过本发明合成单链核酸的方法获得的产物琼脂糖凝胶电泳结果的照片，其中结合在M13mp18中的HBV-M13mp18为模板。
泳道1XIV分子量标记泳道21 fmol HBV-M13mp18 dsDNA泳道3没有靶图13是显示通过本发明合成单链核酸的方法获得的碱变性产物琼脂糖凝胶电泳结果的照片，泳道1来自λ-噬菌体的HindIII-消化片段泳道2实施例1中的反应产物泳道3实施例3中的反应产物图14是显示通过本发明合成单链核酸的方法获得的产物琼脂糖凝胶电泳结果的照片，其中靶M13mp18的浓度是变化的，上面和下面的照片分别显示反应1和3小时的结果。
泳道1M13mp18 dsDNA 1×10-15mol/管泳道2M13mp18 dsDNA 1×10-16mol/管泳道3M13mp18 dsDNA 1×10-17mol/管泳道4M13mp18 dsDNA 1×10-18mol/管泳道5M13mp18 dsDNA 1×10-19mol/管泳道6M13mp18 dsDNA 1×10-20mol/管泳道7M13mp18 dsDNA 1×10-21mol/管泳道8M13mp18 dsDNA 1×10-22mol/管泳道9没有靶泳道10XIV分子量标记图15是显示突变位置以及每一区相对于靶核苷酸序列(靶)的位置关系，突变中下划线的鸟嘌呤被腺嘌呤所替换。
图16是显示本发明扩增反应产物琼脂糖凝胶电泳结果的照片。
M100bp序列梯(New England Biolabs)N没有模板(纯化水)WT1 fmol野生型模板M13mp18
MT1 fmol突变模板M13mp18FM图17是显示编码靶mRNA的核苷酸序列中组成寡核苷酸的每个核苷酸序列的位置关系。
图18是显示以mRNA为模板通过本发明合成单链核酸的方法获得的产物琼脂糖凝胶电泳结果的照片。
实施本发明最好的模式实施例1 对M13mp18中的区域的扩增本发明合成具有互补链交替地连接到单链里的核酸的方法是利用M13mp18为模板尝试的，实验中用到四种引物即M13FA，M13RA，M13F3，和M13R3，M13F3和M13R3是置换分别以M13FA和M13RA为合成起点获得的第一条核酸的外引物。因为以M13FA(或M13RA)合成后外引物为互补链合成起点的引物。通过利用临近堆积现象将这些设计成退火至临近M13FA(或M13RA)的区。此外，将这些引物设置为高浓度使M13FA(或M13RA)的退火优先发生。
组成每个引物的核苷酸序列如序列表所示，引物的结构特征在下面概括。此外，针对靶核苷酸序列(靶)每个区的位置关系在图7中显示。
引物 5’-侧的区/3’-侧的区M13FA与通过M13FA合成的互补链中F1c区相同/与M13mp18中F2c区互补M13RA与通过M13RA合成的互补链中R1c区相同/与通过M13FA合成的互补链中R2c区互补M13F3与M13mp18中F2c区3’-侧临近的F3c互补M13R3通过M13FA合成的互补链中F2c区3’-侧临近的R3c互补通过所述引物，合成核酸，其中M13mp18中从F1c延伸到R1c的区，及其互补核苷酸序列是交替地通过含F2c的成环序列连接在单链里。通过这些引物合成本发明核酸的方法的反应溶液的组合在下面所示。
反应溶液组合(25μL中)20mM Tris-HCl pH8.810mM KCl10mM(NH4)2SO4
6mM MgSO40.1％ Triton X-1005％二甲基亚砜(DMSO)0.4mM dNTP引物800nM M13FA/SEQ ID NO1800nM M13RA/SEQ ID NO2200nM M13F3/SEQ ID NO3200nM M13R3/SEQ ID NO4靶M13mp18 dsDNA/SEQ ID NO5反应上述反应溶液在95℃加热5分钟，该靶变性成单链，将反应溶液转移到用冰预冷的水中，加入4U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLANDBiolabs)，混合物于65℃反应1小时，反应后，于80℃10分钟终止该反应，然后重新转到用冰预冷的水中。
反应的证实将1μl上样缓冲液加到5μl上面的反应溶液中，样品于80mV在2％琼脂糖凝胶(0.5％TBE)上电泳1小时。用XIV(100bp梯，Boehringer Mannheim)作为分子量标记，用SYBR Green I(Molecular Probes，Inc.)染色电泳后的凝胶以验证核酸。结果在图8中显示，各泳道分别相对于下面的样品。
1.XIV分子量标记2.1 fmol M13mp18 dsDNA3.没有靶泳道3中，除了未反应的引物被染色得到证实外，没有带被证实。泳道2中存在靶，证实产物为低分子量的梯状带，在高分子量处染色为不清晰的成片条带，并且带很难在胶中电泳。低分子量带中，290bp和450bp附近的带与本发明合成反应中所期望的产物一致，即双链SEQ ID NO11和12(相当于图2-(7)和2-(10)中所示形成的双链)与单链SEQ ID NO13(相当于图3-(9)长单链)。因此证实反应按照预计的进行。因为该反应基本上是连续反应以允许变化反应产物的分子量，进一步因为该产物具有部分单链和双链复合的复杂结构，所以预计会导致在高分子量处产生不清晰成片条带模式和未被电泳的带的结果。
实施例2 通过限制酶的消化证实反应产物为了阐清具有互补核苷酸序列交替地连接在单链内的本发明实施例1获得的核酸结构，用限制酶消化产物。如果通过消化能生成理论上的片段，同时不存在(disappear)如实施例1中观察到的高分子量处产生不清晰成片条带模式和未被电泳的带，就可预计任何这些产物为本发明具有互补序列交替地连接在单链内的核酸。
实施例1中8管反应溶液(200μl)通过用酚处理及乙醇的沉淀作用得以沉积和纯化，回收产生的沉淀并重新溶于200μl TE缓冲液中，分别用限制酶BamHI，PvuII，和HindIII于37℃消化10μl等分试样2小时，消化物于80mV在2％琼脂糖凝胶(0.5％TBE)上电泳1小时。用Super Ladder-Low(100bp梯)(Gensura Laboratories，Inc.)作为分子量标记，用SYBR Green I(Molecular Probes，Inc.)染色电泳后的凝胶以验证核酸。结果在图9中显示，各泳道分别相对于下面的样品。
1XIV分子量标记2纯化产物的BamHI消化3纯化产物的PvuII消化4纯化产物的HindIII消化预计组成相关短扩增产物的核苷酸序列是那些SEQ ID NO13，14，15和16，从这些核苷酸序列，预计用限制酶消化的各片段的大小如表1所示，表中“L”是指由于L是含环的片段(单链)因此没有确定电泳位置。
表1.本发明扩增产物限制酶消化后的片段序列编号 BamHI PvuII HindIII13 177+L 56+L 147+L14 15+101+L- 142+L15 171+101+L 56+L 147+161+L16 11+101+230+L237+L 142+170+L总计 101,177,230 56,237142,147,161,170(11，15；未证实)因为消化前几乎所有的带被转化为所需的带，这就证实目标反应产物得到了扩增，此外还显示没有或很少有非特异性产物。
实施例3添加甜菜碱对扩增反应的促进作用进行检测添加到反应溶液中的甜菜碱(N，N，N-三甲基甘氨酸，Sigma)对核酸扩增反应影响的实验。与实施例1相似，在存在各种浓度甜菜碱的情况下，用M13mp18为模板进行合成本发明具有互补链交替地连接在单链内的核酸。该实验所用的引物与实施例1中的相同，模板DNA的量为10-21mol(M13mp18)，水作为阴性对照。向反应溶液中添加浓度为0，0.5，1和2M甜菜碱，反应溶液的组合如下所示。
反应溶液的组成(25μL中)20mM Tris-HCl pH8.84mM MgSO40.4mM dNTPs10mM KCl10mM(NH4)2SO40.1％Triton X-100引物800nM M13FA/SEQ ID NO1800nM M13RA/SEQ ID NO2200nM M13F3/SEQ ID NO3200nM M13R3/SEQ ID NO4靶M13mp18 dsDNA/SEQ ID NO5聚合酶，反应条件，及反应后的电泳条件与实施例1中所述相同。
结果在图10中显示，反应中甜菜碱的浓度为0.5或1.0M，扩增产物的量得到增加。而且，如果其浓度增加到2.0M，则观察不到扩增。由此所示合适浓度的甜菜碱促进扩增反应。扩增产物量降低的原因估计为当甜菜碱的浓度为2.0M时，Tm被降的太多。
实施例4 HBV基因序列的扩增尝试合成本发明核酸的方法，其中具有HBV基因的部分序列与其结合的M13mp18用作模板。实验中所用4种引物HB65FA(SEQ ID NO6)，HB65RA(SEQ ID NO7)，HBF3(SEQ ID NO8)和HBR3(SEQ ID NO9)。HBF3和HBR3是置换分别以HB65FA和HB65RA为合成起点获得的第一条核酸的外引物。因为以HB65FA(或HB65RA)合成后外引物为互补链合成起点的引物。通过利用临近堆积现象将这些设计成退火至临近HB65FA(或HB65RA)的区。此外，将这些引物设置为高浓度使HB65FA(或HB65RA)的退火优先发生。该实施例中靶序列(430bp)由结合在M13mp18中HBV衍生而来，在SEQ ID NO10中显示。
组成每个引物的核苷酸序列如序列表所示，每个引物的结构特征在下面概括。此外，针对靶核苷酸序列(靶)每个区的位置关系在图11中显示引物5’-侧的区/3’-侧的区HB65FA 与通过HB65FA合成的互补链中F1c区相同/与HBV-M13mp18中F2c区互补HB65RA 与通过HB65RA合成的互补链中R1c区相同/与通过HB65FA合成的互补链中R2c区互补HBF3与HBV-M13mp18中F2c区3’-侧临近的F3c互补HBR3通过HB65FA合成的互补链中F2c区3’-侧临近的R3c互补通过所述引物，合成核酸，其中具有部分HBV基因与其结合的M13mp18HBV-M13mp18)中从F1c延伸到R1c的区，及其互补核苷酸序列是交替地通过插入含F2c的成环序列交替地连接在单链里。除了上述所用引物，该反应在与实施例1中相同的条件下得以进行。反应溶液通过琼脂糖凝胶电泳分析，结果在图12中显示。各泳道分别相对于下面的样品。
1.XIV分子量标记2.1 fmol HBV-M13mp18 dsDNA.
3.没有靶与实施例1相似，在靶存在的情况下仅证实产物为低分子量的梯状带，在高分子量处染色为不清晰的成片条带和很难在胶中电泳的带(泳道2中)低分子量带中，310bp和480bp附近的带与本发明合成反应中所期望的产物一致，即双链SEQ ID NO17和18。因此证实反应按照预计的进行。如实施例1中所述的结果，预计本发明合成产物的特征结构导致在高分子量处产生不清晰成片条带模式和未被电泳的带。从该实验中，证实甚至在用不同序列(靶)来扩增，本发明能得以利用。
实施例5证实合成反应产物的大小为了证实本发明合成的核酸结构通过碱变性条件下电泳分析其长度，在实施例1或4中靶存在下向5μl每个反应溶液中加入1μl上样缓冲液，样品于50mA在0.7％琼脂糖凝胶(50mM NaOH，1mM EDTA)上电泳14小时。用的HindIII-消化的λ-噬菌体片段作为分子量标记，电泳后的凝胶用1M Tris，pH8中和并用SYBR Green I(Molecular Probes，Inc.)染色以验证核酸。结果在图13中显示，各泳道分别相对于下面的样品。
1来自λ-噬菌体的HindIII-消化片段2实施例1中的反应产物3实施例4中的反应产物当碱变性条件下电泳反应产物，可以证实单链状态中的大小。证实实施例1(泳道2)和实施例4(泳道3)主要产物的大小在2 kbase之内，而且，通过该分析显示出本发明产物在可分析证实的范围内已被延伸到至少不小于6kbase的大小。另外，未变性条件下实施例1和实施例4中未被电泳的带在变性状态下被分离成单个更小的单链。
实施例6 对扩增M-13mp13中的区域的反应中依赖于靶浓度的扩增的证实可观察浓度变化的靶对合成本发明核酸的影响。除了作为靶的M13mp18 dsDNA的量为0-1 fmol和反应时间为1或3小时外在与实施例1相同的条件下本发明合成核酸的方法得以实施。与实施例1相似，样品在2％琼脂糖凝胶(0.5％TBE)上电泳，用SYBR Green I(Molecular Probes，Inc.)染色以验证核酸。用XIV(100bp梯，Boehringer Mannheim)作为分子量标记，结果在图14中(上面反应1小时，下面反应3小时)显示，各泳道分别相对于下面的样品1.M13mp18 dsDNA 1×10-15mol/管。
2.M13mp18 dsDNA 1×10-16mol/管。
3.M13mp18 dsDNA 1×10-17mol/管。
4.M13mp18 dsDNA 1×10-18mol/管。
5.M13mp18 dsDNA 1×10-19mol/管。
6.M13mp18 dsDNA 1×10-20mol/管。
7.M13mp18 dsDNA 1×10-21mol/管。
8.M13mp18 dsDNA 1×10-22mol/管。
9.没有靶。
10.XIV分子量标记。
各泳道中共同带在电泳图里较低部分显示，为未反应的染过色的引物。不考虑反应时间，在缺少靶时则不能观察到扩增产物。染色模式取决于靶的浓度，仅在靶存在下才能获得扩增产物的染色模式。此外，增加反应时间时能证实扩增产物的浓度较低。
实施例7 点突变的检测(1)M13mp18FM(突变型)的制备所用靶DNA为M13mp18(野生型)和M13mp18FM(突变型)，为了制备突变型M13mp18FM，用LA PCRTM体外诱变试剂盒(酒宝造)替换一核苷酸得到突变。此后，通过测序证实该序列。F1区的序列如下所示野生型CCGGGGATCCTCTAGAGTCG(SEQ ID NO19)突变型CCGGGGATCCTCTAGAGTCA(SEQ ID NO20)(2)引物设计野生型和突变型所用FA引物分别在F1c区5’-末端提供不同的核苷酸序列，突变的位置和针对靶核苷酸序列(靶)的每区位置关系在图15中显示。
(3)扩增反应如下所示通过利用M13mp18(野生型)和M13mp18FM(突变型)为模板应用结合特异性引物进行检测特异性模板扩增反应是否发生的实验。
野生型扩增所用引物FAd4，RAd4，F3，R3突变型扩增所用引物FAMd4，RAd4，F3，R3每个引物核苷酸序列如下FAd4CGACTCTAGAGGATCCCCGGTTTTTGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT(SEQ ID NO21)FAMd4TGACTCTAGAGGATCCCCGGTTTTTGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT(SEQ ID NO22)RAd4CGTCGTGACTGGGAAAACCCTTTTTGTGCGGGCCTCTTCGCTATTAC(SEQ ID NO23)F3ACTTTATGCTTCCGGCTCGTA(SEQ ID NO24)R3GTTGGGAAGGGCGATCG(SEQ ID NO25)(4)检测M13mp18中点突变反应溶液组合如下终浓度D2W 3.75μL10X Thermo pol buffer(NEB)2.5μL20mM Tris-HCl pH8.810mM KCl10mM(NH4)2SO46mM MgSO40.1％TritonX-1002.5mM dNTP4μL 400μM100mM MgSO40.5μL4M Betaine6.25μL 1MM13FAd4引物(10pmol/μL)或M13FAMd4引物(10pmol/μL) 2μL 800nMM13RAd4引物(10pmol/μL) 2μL 800nMM13F3引物(10pmol/μL) 0.5μL200nMM13R3引物(10pmol/μL) 0.5μL200nM总量22μL将1 fmol(2μl)靶M13mp18或M13mp18FM加入到反应溶液中于95℃加热5分钟，其中所述靶变性成单链。将反应溶液转移到用冰预冷的水中，加入1μl(8U)Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND BioLabs)于68℃或68.5℃反应1小时，反应后，于80℃10分钟终止该反应，反应溶液重新转到用冰预冷的水中。
如图16所示，当对于野生型FAd4被用作FA引物时，仅在野生型模板情况下观察到有效扩增。另一方面，当对于突变型FAMd4被用作FA引物，仅在野生型模板情况下观察到有效扩增。
从上述结果显示通过利用本发明扩增反应，可有效地检测点突变。
实施例8 以mRNA为靶的扩增反应通过利用以mRNA为靶核酸合成本发明核酸的方法得以尝试。为制备靶mRNA，将表达前列腺特异抗原(PSA)的前列腺癌细胞系LNCaP细胞(ATCC No.CRL-1740)与非表达细胞慢性骨髓白血病细胞系K562细胞(ATCC No.CCL-243)在1∶106到100∶106范围混合，接着通过利用来自Qiagen(Germany)的RNeasy Mini试剂盒，提取总RNA，实验中所用4种引物即PSAFA，PSARA，PSAF3和PSAR3。PSAF3和PSAR3是替换分别以PSAFA和PSARA为合成起点获得的第一核酸的外引物。此外，将这些引物的浓度设置高使PSAFA(或PSARA)的退火优先发生。组成各个引物的核苷酸序列如下，引物PSAFATGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG(SEQ ID NO26)PSARATGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG(SEQ ID NO27)PSAF3TGCTTGTGGCCTCTCGTG(SEQ ID NO28)PSAR3GGGTGTGGGAAGCTGTG(SEQ ID NO29)引物的结构特征在下面概括。此外，针对编码对于靶mRNA的DNA核苷酸序列每个引物的位置关系和限制酶Sau3AI识别位点在图17中显示。
引物 5’-侧的区/3’-侧的区PSAFA与通过PSAFA合成的互补链中F1c区相同/与靶核苷酸序列中F2c区互补PSARA与通过PSARA合成的互补链中R1c区相同/与通过PSAFA合成的互补链中R2c区互补PSAF3与靶核苷酸序列中F2c区3’-侧临近的F3c互补PSAR3通过PSAFA合成的互补链中F2c区3’-侧临近的R3c互补本发明合成核酸方法的反应溶液的组合如下反应溶液的组成(25μL中)20mM Tris-HCl pH8.84mM MgSO40.4mM dNTPs10mM KCl10mM (NH4)2SO40.1％ Triton X-1000.8M betaine5mM DTT
1600nM PSAFA & PSARA引物200nM PSAF3 & PSAR3引物8U Bst DNA聚合酶100U Rever Tra Ace(Toyobo Co.，Ltd.，Japan)5μg总RNA所用成分在冰上混合，该实验中以mRNA(单链)为靶序列，因此不必通过热变性获得单链的步骤。于65℃进行反应45分钟，于85℃5分钟终止该反应，反应后，5μl反应溶液在2％琼脂糖凝胶上电泳，用SYBR Green I染色。
结果在图18中显示，各泳道分别相对于下面的样品泳道 Bst RT LNCaP细胞数/106K562细胞数1 -+02 -+103 +-04 +-105 ++06 ++17 ++108泳道6中为Sau3AI消化1μL等份反应溶液9泳道7中为Sau3AI消化1μL等份反应溶液10分子量标记，100bp ladder(New England Biolabs)在缺少Bst DNA聚合酶或Rever Tra Ace时，不能得到扩增产物(泳道1-4)。所述两种酶都存在情况下，如果存在从LNCaP衍生的RNA，则能检测到扩增产物(泳道5-7)。能检测到从一个LNCaP细胞/一百万个K562细胞提取的RNA(泳道6)。当在位于靶内部的Sau3AI限制酶位点消化扩增产物时，该产物被消化成所估计大小的片段(泳道8和9)。
从上述结果中，证实在本发明合成核酸的方法中甚至以RNA为靶时可得到所需的反应产物。
工业应用根据本发明新寡核苷酸和利用所述寡核苷酸合成核酸的方法，提供了合成具有互补核苷酸序列交替地连接在单链里的核酸的方法，而不需要任何复杂的温度控制。基于本发明以寡核苷酸为引物合成的互补链以所述模板链3’-末端作为合成新互补链的起点，伴随有导致新引物退火的环的合成及以先合成的链为模板合成互补链反应产物，被再次通过从环开始的合成的互补链所替换并可碱基配对。由此得到的以自身为模板合成的核酸与已知的核酸合成方法例如SDA结合，有益于改进核酸的合成效率。
根据本发明进一步的优选模式，提供合成核酸的新方法，该方法可改进已知方法合成核酸的效率，不需要复杂的温度控制，而且预计可达到高效率扩增，并可获得高特异性，即将基于本发明的寡核苷酸用作模板链，和其互补链，其中具有互补核苷酸序列交替地连接在单链里的核酸可得以连续合成。理论上该反应可以继续到合成所必须的初始产物的耗尽。在继续合成从环开始合成的新核酸期间，从能退火为环的寡核苷酸的延伸进行链的置换为长单链核酸的延伸(即具有多对互补链连接在此的核酸)提供3’-OH。另一方面，长的单链核酸的3’-OH以自身为模板进行合成互补链的反应，由此得到延伸，从环开始的合成的新互补链被替换，该扩增反应步骤在等温条件下进行并维持高的特异性。
当两临近区按照所设计的设计时使本发明寡核苷酸可作为合成核酸反应的引物，这明显有助于特异性的保守，通过与非特异性误退火启动非特异性扩增反应的与e.g.PCR相比较，不管所需2引物的位置关系如何就可容易地对本发明所需高特异性作出解释，能利用该特异性高灵敏度及精确地检测SNPs。
本发明的特征在于通过组成简单的试剂就可容易地获得该反应，例如本发明寡核苷酸具有特定结构，但这是核苷酸序列选择的物质，是简单的寡核苷酸物质。此外，在优选的模型中，仅通过催化合成置换型的互补链反应的DNA聚合酶反应，可得以进行。而且，如果本发明以RNA为模板，利用DNA聚合酶例如Bca DNA聚合酶，既具有反转录酶活性又有链置换型DNA聚合酶活性使所有酶反应可通过单酶得以进行，通过简单酶实现高度扩增核酸的反应原理尚不清楚。甚至对于将本发明应用到已知的核酸合成反应例如SDA中对于它们的结合不必需要额外酶。并且该与基于本发明的寡核苷酸的简单结合可被用于各种反应系统中，因此本发明合成核酸的方法在费用方面也是有利的。
如上所述，本发明合成核酸的方法和其中的寡核苷酸提供了一种新的原理同时解决了许多问题例如操作(不必需要温度控制)，改进合成效率，经济化和高特异性。
序 列 表<110> 荣研化学株式会社(Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha)<120> 合成核酸的方法<130> E2-001PCT2<140><141><150> PCT/JP99/06213<151> 1999-11-08<160> 29<170> PatentIn Ver.2.0<210> 1<211> 52<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 1cgactctaga ggatccccgg gtactttttg ttgtgtggaa ttgtgagcgg at 52<210> 2<211> 51<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 2acaacgtcgt gactgggaaa accctttttg tgcgggcctc ttcgctatta c 51<210> 3<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 3actttatgct tccggctcgt a 21<210> 4<211> 17<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 4gttgggaagg gcgatcg17<210> 5<211> 600<212> DNA<213> 噬菌体M13mp18<400> 5gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 120cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 180tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg aattcgagct 240cggtacccgg ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc aagcttggca ctggccgtcg 300ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac 360atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac 420agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgct ttgcctggtt tccggcacca gaagcggtgc 480cggaaagctg gctggagtgc gatcttcctg aggccgatac ggtcgtcgtc ccctcaaact 540ggcagatgca cggttacgat gcgcccatct acaccaacgt aacctatccc attacggtca 600<210> 6<211> 63<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 6ctcttccaaa agtaaggcag gaaatgtgaa accagatcgt aatttggaag acccagcatc 60cag 63<210> 7<211> 43<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 7gtggattcgc actcctcccg ctgatcggga cctgcctcgt cgt 43<210> 8<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 8gccacctggg tgggaa 16<210> 9<211> 22<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 9ggcgagggag ttcttcttct ag 22<210> 10<211> 430<212> DNA<213> 乙型肝炎病毒<400> 10ctccttgaca ccgcctctgc tctgtatcgg gaggccttag agtctccgga acattgttca 60cctcaccata cagcactcag gcaagctatt ctgtgttggg gtgagttaat gaatctggcc 120acctgggtgg gaagtaattt ggaagaccca gcatccaggg aattagtagt cagctatgtc 180aatgttaata tgggcctaaa aatcagacaa ctattgtggt ttcacatttc ctgccttact 240tttggaagag aaactgtttt ggagtatttg gtatcttttg gagtgtggat tcgcactcct 300cccgcttaca gaccaccaaa tgcccctatc ttatcaacac ttccggaaac tactgttgtt 360agacgacgag gcaggtcccc tagaagaaga actccctcgc ctcgcagacg aaggtctcaa 420tcgccgcgtc430<210> 11<211> 293<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的序列<400> 11acaacgtcgt gactgggaaa accctttttg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg 60cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac 120gacgttgtaa aacgacggcc agtgccaagc ttgcatgcct gcaggtcgac tctagaggat 180ccccgggtac cgagctcgaa ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt 240tatccgctca caattccaca caacaaaaag tacccgggga tcctctagag tcg293<210> 12<211> 293<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的序列<400> 12cgactctaga ggatccccgg gtactttttg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 60cacacaggaa acagctatga ccatgattac gaattcgagc tcggtacccg gggatcctct 120agagtcgacc tgcaggcatg caagcttggc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg 180ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg 240gcgtaatagc gaagaggccc gcacaaaaag ggttttccca gtcacgacgt tgt293<210> 13<211> 459<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的序列<400> 13acaacgtcgt gactgggaaa accctttttg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg 60cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac 120gacgttgtaa aacgacggcc agtgccaagc ttgcatgcct gcaggtcgac tctagaggat 180ccccgggtac cgagctcgaa ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt 240tatccgctca caattccaca caacaaaaag tacccgggga tcctctagag tcgacctgca 300ggcatgcaag cttggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg 360ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag 420aggcccgcac aaaaagggtt ttcccagtca cgacgttgt459<210> 14<211> 458<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的序列<400> 14cgactctaga ggatccccgg gtactttttg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 60cacacaggaa acagctatga ccatgattac gaattcgagc tcggtacccg gggatcctct 120agagtcgacc tgcaggcatg caagcttggc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg 180ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg 240gcgtaatagc gaagaggccc gcacaaaaag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga 300cggccagtgc caagcttgca tgcctgcagg tcgactctag aggatccccg ggtaccgagc 360tcgaattcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt 420ccacacaaca aaaagtaccc ggggatcctc tagagtcg 458<210> 15<211> 790<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的序列<400> 15acaacgtcgt gactgggaaa accctttttg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg 60cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac 120gacgttgtaa aacgacggcc agtgccaagc ttgcatgcct gcaggtcgac tctagaggat 180ccccgggtac cgagctcgaa ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt 240tatccgctca caattccaca caacaaaaag tacccgggga tcctctagag tcgacctgca 300ggcatgcaag cttggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg 360ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag 420aggcccgcac aaaaagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgccaag 480cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagagga tccccgggta ctttttgttg tgtggaattg 540tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgaa ttcgagctcg 600gtacccgggg atcctctaga gtcgacctgc aggcatgcaa gcttggcact ggccgtcgtt 660ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat 720ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca caaaaagggt tttcccagtc 780acgacgttgt790<210> 16<211> 789<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的序列<400> 16cgactctaga ggatccccgg gtactttttg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 60cacacaggaa acagctatga ccatgattac gaattcgagc tcggtacccg gggatcctct 120agagtcgacc tgcaggcatg caagcttggc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg 180ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg 240gcgtaatagc gaagaggccc gcacaaaaag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga 300cggccagtgc caagcttgca tgcctgcagg tcgactctag aggatccccg ggtaccgagc 360tcgaattcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt 420ccacacaaca aaaagtaccc ggggatcctc tagagtcgac ctgcaggcat gcaagcttgg 480cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tttttgtgcg ggcctcttcg 540ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca 600gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg ccaagcttgc atgcctgcag 660gtcgactcta gaggatcccc gggtaccgag ctcgaattcg taatcatggt catagctgtt 720tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac aaaaagtacc cggggatcct 780ctagagtcg 789<210> 17<211> 310<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的序列<400> 17gtggattcgc actcctcccg ctgatcggga cctgcctcgt cgtctaacaa cagtagtttc 60cggaagtgtt gataagatag gggcatttgg tggtctgtaa gcgggaggag tgcgaatcca 120cactccaaaa gataccaaat actccaaaac agtttctctt ccaaaagtaa ggcaggaaat 180gtgaaaccac aatagttgtc tgatttttag gcccatatta acattgacat agctgactac 240taattccctg gatgctgggt cttccaaatt acgatctggt ttcacatttc ctgccttact 300tttggaagag310<210> 18<211> 465<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的序列<400> 18gtggattcgc actcctcccg ctgatcggga cctgcctcgt cgtctaacaa cagtagtttc 60cggaagtgtt gataagatag gggcatttgg tggtctgtaa gcgggaggag tgcgaatcca 120cactccaaaa gataccaaat actccaaaac agtttctctt ccaaaagtaa ggcaggaaat 180gtgaaaccac aatagttgtc tgatttttag gcccatatta acattgacat agctgactac 240taattccctg gatgctgggt cttccaaatt acgatctggt ttcacatttc ctgccttact 300tttggaagag aaactgtttt ggagtatttg gtatcttttg gagtgtggat tcgcactcct 360cccgcttaca gaccaccaaa tgcccctatc ttatcaacac ttccggaaac tactgttgtt 420agacgacgag gcaggtcccg atcagcggga ggagtgcgaa tccac 465<210> 19<211> 20<212> DNA<213> M13mp18<400> 19ccggggatcc tctagagtcg 20<210> 20<211> 20<212> DNA<213> M13mp18突变体<400> 20ccggggatcc tctagagtca 20<210> 21<211> 48<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 21cgactctaga ggatccccgg tttttgttgt gtggaattgt gagcggat48<210> 22<211> 48<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 22tgactctaga ggatccccgg tttttgttgt gtggaattgt gagcggat 48<210> 23<211> 47<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 23cgtcgtgact gggaaaaccc tttttgtgcg ggcctcttcg ctattac 47<210> 24<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 24actttatgct tccggctcgt a 21<210> 25<211> 17<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 25gttgggaagg gcgatcg 17<210> 26<211> 44<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 26tgttcctgat gcagtgggca gctttagtct gcggcggtgt tctg 44<210> 27<211> 45<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 27tgctgggtcg gcacagcctg aagctgacct gaaatacctg gcctg 45<210> 28<211> 18<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 28tgcttgtggc ctctcgtg18<210> 29<211> 17<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工合成的引物序列<400> 29gggtgtggga agctgtg 1权利要求
1.合成在其一条链上具有交替连接之互补核苷酸序列的核酸的方法，所述方法包括a)提供一种核酸，其3′末端具有可与同一条链上的部分F1c退火的F1区，并且通过所述F1区与F1c的退火可形成包含了可进行碱基配对的F2c区在内的环；b)以与F1c退火的F1 3′末端为起点合成互补链；c)使在其3′末端包含与F2c区互补的F2序列的寡核苷酸退火并以该寡核苷酸为合成起点，通过聚合酶催化链置换型互补链合成反应而进行互补链合成，以置换步骤b)中所合成的互补链；d)使一种多核苷酸退火并以其3′末端为合成起点，通过聚合酶催化链置换型互补链合成反应而进行互补链合成，以置换步骤c)中所合成的互补链，其中所述多核苷酸在其3′末端包含一种与步骤c)中合成的互补链的任意区域互补的序列；
2.权利要求1的方法，其中步骤d)中所述合成起点为同一链上3′末端的可与R1c区退火的R1区，通过R1与R1c的退火可形成包含了可进行碱基配对的R2c区在内的环。
3.一种寡核苷酸，其至少由以下两个区域X2及X1c构成，且X1c连接至X2的5′侧，X2区具有与含特定核苷酸序列的核酸中任意X2c区互补的核苷酸序列；X1c区具有与含特定核苷酸序列的核酸中X2c区5′侧的X1c区基本相同的核苷酸序列。
4.权利要求1的方法，其中步骤a)所述的核酸是通过以下步骤产生的第二核酸i)使权利要求3所述寡核苷酸的F2区与作为模板的核酸中的F2c区退火，其中所述寡核苷酸中，X2区为F2区，X1c区为F1c区；ii)以所述寡核苷酸中的F2为起点合成具有与所述模板互补之核苷酸序列的第一核酸；iii)使步骤ii)中合成的第一核酸的任意区处于可进行碱基配对的状态；iv)使一种寡核苷酸退火并以该寡核苷酸为合成起点，合成第二核酸，并使该核酸3′末端的F1处于可进行碱基配对的状态，其中所述寡核苷酸具有与步骤iii)中的第一核酸中可进行碱基配对的区域互补的核苷酸序列。
5.权利要求4的方法，其中步骤iii)中可进行碱基配对的区域为R2c，且步骤iv)中的寡核苷酸为权利要求3所述的寡核苷酸，其中X2c区为R2c区，X1c区为R1c区。
6.权利要求4或5的方法，其中步骤iii)及iv)中可进行碱基配对的状态通过聚合酶催化链置换型互补链合成反应而产生，该反应的合成起点启用两种外引物一种是与模板中F2c的3′侧退火的外引物，另一种是与作为步骤iv)中第一核酸合成起点的区域的3′侧退火的外引物。
7.权利要求6的方法，所述反应中所用的每种寡核苷酸与其在模板中的互补区之间的解链温度在相同严谨条件下存在以下的关系(外引物/模板3′侧区)≤(F2c/F2及R2c/R2)≤(F1c/F1及R1c/R1)。
8.权利要求4-7中任一项的方法，其中所述作为模板的核酸为RNA，且步骤ii)中的互补链通过具有反转录酶活性的酶来合成。
9.扩增在其一条链上具有交替连接之互补核苷酸序列的核酸的方法，所述方法通过重复以下步骤完成A)提供一种模板，使其3′末端和5′末端具有由互补于相同链上每一末端区的核苷酸序列组成的区，当这些互补核苷酸序列退火时，形成可在两者之间进行碱基配对的环；B)以与同一链退火的上述模板的3′末端为合成起点合成互补链；C)使3′末端互补于3′末端侧的环内核苷酸序列的寡核苷酸与环部退火，并以该寡核苷酸为合成起点，通过聚合酶催化链置换型互补链合成反应而合成互补链，以置换步骤B)中合成的互补链，使其3′末端处于可进行碱基配对的状态；D)使步骤C)中具有能进行碱基配对的3′末端的链作为(A)中的新模板。
10.权利要求9的扩增方法，其中步骤C)中寡核苷酸的5′末端具有一段与作为步骤B)之合成起始点的3末端互补的核苷酸序列。
11.权利要求10的扩增方法，进一步包含这样的步骤以步骤C)中的寡核苷酸作为合成起始点合成的互补链用做步骤A)中的模板。
12.权利要求9的扩增方法，其中步骤A)的模板是通过权利要求5所述方法合成的。
13.权利要求1或9的方法，其中链置换型互补链合成反应是在解链温度调节剂的存在下实施的。
14.权利要求13的方法，其中解链温度调节剂为甜菜碱。
15.权利要求14的方法，其中允许反应溶液中甜菜碱的浓度为0.2-3.0M。
16.一种检测样品中靶核苷酸序列的方法，包括实施权利要求9-15中任一项所述的扩增方法并观察是否生成扩增产物。
17.权利要求16的方法，其中在扩增产物中加入包含与所述环互补的核苷酸序列的探针，进而观察两者之间的杂交。
18.权利要求17的方法，其中所述探针被标记在颗粒上，并观察通过杂交而发生的聚集反应。
19.权利要求16的方法，其中权利要求9-15中任一项所述的扩增方法在核酸检测试剂的存在下实施，并根据该检测试剂的信号变化来观察是否生成扩增产物。
20.用权利要求16所述方法检测靶核苷酸序列中的突变的方法，其中核苷酸序列中作为扩增对象的突变阻碍了组成该扩增方法的任一互补链的合成。
21.合成在其一条链上具有交替连接之互补核苷酸序列的核酸的试剂盒，其包括以下组分i)权利要求3所述的寡核苷酸，其中作为模板的核酸中F2c区域是X2c，位于F2c 5′端的F1c是X1c；ii)一种寡核苷酸，其包含互补于以i)的寡核苷酸为引物而合成的互补链中任意区域的核苷酸序列；iii)一种寡核苷酸，其具有与作为模板的核酸中F2c区3′侧的F3c区互补的核苷酸序列；iv)一种用于催化链置换型互补链合成反应的DNA聚合酶，和，v)一种核苷酸，其作为组分iv)的底物。
22.权利要求21的试剂盒，其中ii)的寡核苷酸为权利要求3所述的寡核苷酸，以i)的寡核苷酸为合成起点合成的互补链中任意R2c区为X2c，位于R2c 5′侧的R1c为X1c。
23.权利要求22所述的试剂盒，进一步包含以下组分vi)一种寡核苷酸，其具有与用i)的寡核苷酸作为起点合成的互补链中任意R2c区3′侧的R3c区互补的核苷酸序列。
24.一种用于检测靶核苷酸序列的试剂盒，其中在权利要求21-23中任一项所述试剂盒的基础上，还进一步包含用于检测核酸合成反应产物的检测试剂。
全文摘要
本发明涉及具有新结构的寡核苷酸和通过其用作引物合成核酸的方法。该寡核苷酸在引物的5’－侧所提供的核苷酸序列，基本上与以该引物为合成起点而合成的区域相同。本发明在单纯试剂的组成上实现了基于等温反应的核酸合成。此外，本发明根据该核酸合成的方法又提供了合成高特异性核酸的方法。
文档编号C12N15/10GK1420928SQ00818262
公开日2003年5月28日 申请日期2000年3月28日 优先权日1999年11月8日
发明者纳富继宣, 长谷哲 申请人:荣研化学株式会社