一种鸡脂肪分解代谢相关的CPT1B基因荧光定量RT-PCR试剂盒的制作方法

本实用新型涉及生物技术领域，尤其涉及一种鸡脂肪分解代谢相关的CPT1B基因荧光定量RT-PCR试剂盒。

背景技术：

目前，肉碱脂酰转移酶1(carnitine palmitoyl transferase 1，CPT1)是脂肪分解代谢的关键酶，更是脂肪酸β-氧化的限速酶。该酶催化脂酰辅酶A由细胞液运到线粒体内膜进行β-氧化，不仅为机体的运动提供能量，而且可以降低脂肪含量，减少脂肪沉积，甚至还可能影响体内脂肪的分布，与脂质代谢密切相关，最终影响畜禽肉质性状的形成。肉碱脂酰转移酶1B(carnitine palmitoyl transferase 1B，CPT1B)作为CPT1的一种重要同工酶—肌肉型肉碱脂酰转移酶1(MCPT1)，在调节体内脂肪酸的氧化过程中起着重要作用。肉鸡是动物蛋白的主要来源之一，肉鸡的体脂是肉鸡产业的主要关注点之一；研究CPT1B基因的表达调控对于了解肉鸡脂肪沉积规律和脂质代谢调控机理具有重要意义。

然而，现有的关于CPT1B基因的试剂盒很少，并且常见的试剂盒结构都较为简单，出于检测的需要，检测人员往往需要便捷地、快速地打开试剂盒，然后再取出试剂瓶，如果检测人员取出试剂瓶速度过慢，很有可能会影响检测结果，而且如果检测人员提前取出试剂瓶，也会对检测结果造成影响。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本实用新型的目的是公开一种鸡脂肪分解代谢相关的CPT1B基因荧光定量RT-PCR试剂盒，操作人员按压试剂瓶，试剂瓶底部的自锁式压簧装置受到反弹，试剂瓶受到反作用力向上弹起以突出试剂盒，进而便于检测人员便捷地、快速地取出试剂瓶。

本实用新型是通过以下技术方案实现的：一种用于鸡脂肪分解代谢相关的CPT1B基因荧光定量RT-PCR试剂盒，所述试剂盒包括盒体及固接于盒体侧面的针剂仓,所述盒体内部中层固接有垫板，在垫板上开设有大小不一的盛装孔，在盛装孔内放置有试剂瓶，且在垫板的下表面固接有向上弹起试剂瓶的自锁式压簧装置。

通过上述技术方案，当操作人员需要取试剂瓶时，检测人员根据需要向下按压试剂瓶，自锁式压簧装置受到向下的作用力打开，试剂瓶受到向上的反作用力向上弹起，进而突出试剂盒，最后检测人员根据需要取出试剂瓶，取用后，再次按压试剂瓶，以给自锁式压簧装置向下的作用力，使得自锁式压簧装置实现自锁，压簧装置位置固定。此外，对于取放试剂瓶时，关于试剂瓶是否已被使用过，可通过试剂瓶是否突出试剂盒判断；当检测人员需要针剂抽取试剂瓶内的试剂时，还可将针剂从针剂仓内直接取出，进而便于检测人员便捷、快速地取出试剂瓶。

进一步地，所述自锁式压簧装置包括固定板、支撑板及压簧，其中所述固定板的一端垂直固接于垫板底面，所述固定板的另一端通过连接件与支撑板卡接固定，所述支撑板的底部通过固定件与压簧的一端固接于一体，所述压簧的另一端插接于安装孔内，所述安装孔开设于盒体内底面。

通过上述技术方案，自锁式压簧装置是通过连接件使得固定板和支撑板处于卡接和分离的状态，进而实现自锁式压簧装置的自锁和打开的两个动作。

进一步地，所述连接件为突出于固定板侧面的半弧状突起、以及对应开设于支撑板端部的半弧状凹孔，所述半弧状突起与半弧状凹孔在过盈配合的条件下卡接于一体，其中所述半弧状突起是由热塑性弹性体制成。

通过上述技术方案，当需要取出试剂瓶时，向下按压试剂瓶，试剂瓶对自锁式压簧装置施加向下的作用力，使得半弧状突起与半弧状凹孔错开，进而使得压簧产生向上的作用力，推动支撑板及试剂瓶向上弹出，以便检测人员快捷使用；当放置试剂瓶时，向下按压试剂瓶，当支撑板上的半弧状突起与半弧状凹孔相对卡入时，可将支撑板与固定板连接于一体，进而实现自锁式压簧装置的自锁；此外热塑性弹性体具有橡胶和塑料的双重性能，进而便于半弧状突起与半弧状凹孔的卡入和分离。

进一步地，所述固定件为固接于垫板底面的弧形板，所述弧形板的中部开设有供压簧末端缠结的通孔。

进一步地，所述盛装孔的边沿固接有便于试剂瓶向上滑出的海绵垫圈。

进一步地，所述盒体的顶端滑动连接有盒盖，所述盒盖的末端固接有便于握持的把手。

进一步地，所述试剂瓶包括盛装SYBR Green Master热启动荧光PCR混合物的试剂瓶A、盛装鸡FASN基因表达的特异性正反向引物的试剂瓶B、盛装鸡内参基因β-actin表达的特异性正反向引物的试剂瓶C、盛装dNTP的试剂瓶D、盛装灭菌DEPC水的试剂瓶E；

其中，鸡CPT1B基因正反向引物序列为：

F:5’—TGCTGCTTCCAATTCGACG—3’

R:5’—TGCAGCGCGATCTGAATG—3’；

以及鸡内参基因β-actin表达的特异性正反向引物序列为

F:5’—GTCCACCGCAAATGCTTCT—3’，

R:5’TGCGCATTTATGGGTTTTGTT—3’

进一步地，所述盛装孔的直径大小依次为盛装孔A<盛装孔B<盛装孔C<盛装孔D<盛装孔E。

与现有技术相比，具有以下有益效果：

1、CPT1B荧光定量RT-PCR试剂盒，准确性可靠、快速、特异性强、价格低廉，具有灵敏度高、自动化程度高，无污染、实时性好等优点。

2、肉碱脂酰转移酶1B(carnitine palmitoyl transferase 1B，CPT1B)作为CPT1的一种重要同工酶—肌肉型肉碱脂酰转移酶1(MCPT1)，在体内脂肪分解代谢过程中起着重要作用。肉鸡是动物蛋白的主要来源之一，肉鸡的体脂是肉鸡产业的主要关注点之一，研究CPT1B基因的表达调控对于了解肉鸡脂肪沉积规律和脂质代谢调控机理具有重要意义。

附图说明

图1是本实用新型的结构示意图；

图2是本实用新型中体现把手的结构示意图；

图3是本实用新型中体现试剂瓶的结构示意图；

图4是本实用新型中体现盛装孔的结构示意图；

图5是本实用新型的俯视图；

图6是图5中B-B的剖面视图；

图7是图6中A的放大图；

图8是本实用新型中体现半弧状突起和半弧状凹孔连接的结构示意图；

图9是本实用新型β-actin和CPT1B基因的溶解曲线图；

在图9中，前一个峰图为β-actin基因的溶解曲线，后一个峰图为CPT1B基因的溶解曲线；

图10是本实用新型CPT1B基因在隐性白羽鸡公母鸡不同组织中的差异表达量图；

在图10中，不同小写字母表示CPT1B在不同组织中表达差异显著(P＜0.01or P＜0.05)；*表示示CPT1B在公母鸡同一组织中表达量差异显著(P＜0.01or P＜0.05)。

图中，1、盒体；2、盒盖；21、盖体；22、滑槽；23、把手；3、针剂仓；4、试剂瓶；41、试剂瓶A；42、试剂瓶C；43、试剂瓶B；44、试剂瓶E；45、试剂瓶D；46、试剂瓶盖；5、垫板；51、盛装孔A；52、盛装孔C；53、盛装孔B；54、盛装孔E；55、盛装孔D；56、海绵垫圈；6、自锁式压簧装置；61、固定板；62、固定件；63、压簧；64、安装孔；65、支撑板；66、连接件；661、半弧状突起；662、半弧状凹孔；621、通孔。

具体实施方式

下面结合附图对本实用新型做进一步的说明。

一种用于鸡脂肪分解代谢相关的CPT1B基因荧光定量RT-PCR试剂盒，如图1、图2及图3所示，包括盒体1，在盒体1的顶端滑动连接有盒盖2，沿盒体1的侧面固接有针剂仓3，以便于针剂取放使用；此外，盒盖2包括盖体21，在盒体1的顶端开设有便于盖体21滑出的滑槽22，在盒盖21的末端固接有便于握持的把手23。

如图1、图3及图4所示，在盒体1内部的中层固接有垫板5，垫板5的上表面开设有大小不一的盛装孔A51、盛装孔B53、盛装孔C52、盛装孔D55及盛装孔E54，其直径大小的顺序为盛装孔A51<盛装孔B53<盛装孔C52<盛装孔D55<盛装孔E54，进而通过孔径大小以区分各个盛装孔孔径的不同。

如图4和图5所示，将盛装孔A51、盛装孔B53、盛装孔C52、盛装孔D55及盛装孔E54的孔内依次放置试剂瓶A41、试剂瓶B43、试剂瓶C42、试剂瓶D45及试剂瓶E44，并在试剂瓶4与盛装孔之间形成的空隙内填充有海绵垫圈56，一方面防止试剂瓶4倾斜，另一方面便于将试剂瓶4从盛装孔内取出，进而便于操作人员使用。

如图5、图6及图7所示，在垫板5的下表面垂直固接有将试剂瓶4向上弹起的自锁式压簧装置6，其中自锁式压簧装置6包括一端垂直固接于垫板5底面的固定板61、通过连接件66与固定板61另一端连接的支撑板65，沿支撑板65的底面通过固定件连接有压簧63，且压簧63的另一端插接于安装孔64内，其中安装孔64开设于盒体1内底面。

如图7和图8所示，优选地，连接件66为突出于固定板61侧面的半弧状突起661、以及对应开设于支撑板65端部的半弧状凹孔662，且半弧状突起661与半弧状凹孔662在过盈配合的条件下卡接于一体；此外，半弧状突起661是由热塑性弹性体制成。

如图7和图8所示，固定件62为固接于支撑板65底面的弧形板，且在弧形板的中部开设有供压簧63末端缠结的通孔621，进而将压簧63的两端分别固定。

为了便于操作人员识别，在试剂瓶盖46的侧面可贴有识别标签，以便于试剂瓶4突出时，操作人员可根据标签获得试剂瓶4的具体信息。

本实用新型的使用过程：将试剂瓶A内盛装SYBR Green Master热启动荧光PCR混合物，试剂瓶B盛装鸡FASN基因表达的特异性正反向引物，试剂瓶C盛装鸡内参基因β-actin表达的特异性正反向引物；试剂瓶D盛装dNTP；试剂瓶E盛装灭菌DEPC水；本申请的试剂盒可适用于CPT1B基因在隐性白羽鸡公母鸡不同组织中差异表达量分析，具体表达分析方法如下：

隐性白羽鸡属于快大白羽肉鸡，是江苏省家禽科学研究所于1999年从法国SASSO公司引进公鸡800只，母鸡2800只，经过闭锁群体选育保存下来的。其羽毛的白色为隐性遗传。以生长速度快、产蛋多而著称，年产蛋量为200个左右，31w达产蛋高峰期，公母鸡体重分别为3,009±150和2,257±180克。具有繁殖力强，适应性广，我国大量从国外引进隐性白羽鸡，主要用于与国内地方鸡种进行配套，以三元杂交为主的方式生产优质黄羽肉鸡。配套利用优势明显等优点，受到国内外很多养殖户的青睐。

利用常用的Trizol裂解法，从217日龄(产蛋高峰期)的隐性白羽鸡公母鸡的下丘脑、肝脏、心脏、胸肌、腓肠肌、腹脂、锁骨下脂肪、皮下脂肪中提取总RNA，以提取的总RNA为模板，按照RT-PCR试剂盒(Takara,Dalian,China)说明书反转录合成cDNA第一链。

检测方法中CPT1B荧光定量RT-PCR条件的优化：

(1)引物设计：根据GenBank上登录的鸡CPT1B和β-actin基因mRNA序列，利用Primer5.0和oligo6.0设计一种采用荧光定量RT-PCR检测隐性白羽鸡CPT1B基因表达的特异性引物，经过引物筛选与条件优化，最终选择出符合荧光定量PCR反应特点的CPT1B基因特异性正反向引物F:5’—TGCTGCTTCCAATTCGACG—3’

R:5’—TGCAGCGCGATCTGAATG—3’；

以及作为内参基因的鸡β-actin基因特异性正反向引物F:5—GTCCACCGCAAATGCTTCTAA—3’，R:5’TGCGCATTTATGGGTTTTGTT—3’。

(2)组织RNA的抽提与纯化：从隐性白羽鸡组织中提取总RNA并纯化；

(3)cDNA第一链的合成：以步骤(2)中所提取的RNA为模板，反转录合成cDNA第一链；

(4)荧光定量real time PCR扩增反应：采用SYBR Green I燃料法，以上述(1)设计的CPT1B正反向引物和β-actin基因正反向引物和(3)合成的cDNA第一链为模板，在ABI7500fast荧光定量PCR仪上进行。即隐性白羽鸡各组织样本总RNA反转录成cDNA第一链后，分别利用CPT1B和β-actin基因各自优化好的条件进行real-time PCR反应，每个样品均做3个平行管，每次反应均设无模板对照(NTC)。

荧光定量PCR扩增体系配制如下

real time PCR扩增的反应条件设置如下：

CPT1B：95℃预变性20-30s,然后40个循环的95℃变性20-30s,退火55-60℃ 20-30s,最后95℃变性10-15s,60℃ 1min,95℃ 10-15s，连续测定样品的荧光强度以获取溶解曲线。

β-actin：95℃预变性20s,然后40个循环的95℃变性20-30s,退火56-59℃ 20-30s,最后95℃变性10-15s,60℃ 1min,95℃ 10-15s，连续测定样品的荧光强度以获取溶解曲线。

为检测反应的特异性，在real-time反应后，进行溶解曲线分析，以确定得到的产物为目的产物。扩增温度以0.5℃的增幅从60℃缓慢递增到95℃，连续测定样品的荧光强度以获取溶解曲线。结果显示如图9所示，β-actin和CPT1B基因均只有一个特异性峰，溶解温度分别为81℃和86℃。则设计的CPT1B引物有很好的特异性，可以进行CPT1B基因定量分析。

隐性白羽鸡CPT1B在不同组织中差异表达结果分析，具体分析如下：

隐性白羽鸡各组织样本经反转录成cDNA第一链后，分别利用CPT1B和β-actin基因基因各自优化好的条件进行real time PCR反应，每个样品均做3个平行管，每次反应均设无模板对照(NTC)。以β-actin基因为内参照，对CPT1B基因mRNA表达水平进行校正，并采用2-ΔΔCt法对数据进行处理，其中ΔCt＝(Ct目的基因-Ct内参基因)，以一种组织，比如肝脏ΔCt作为其他组织的参照，计算相对表达量ΔΔCt，ΔΔCt＝(ΔCt(组织)–ΔCt(肝脏)，以此来比较CPT1B基因相对表达量，结果见图10。

由图10可以看出，CPT1B基因表达在公母鸡同一组织表达量有一定的差异。母鸡CPT1B基因在腓肠肌中表达量显著高于公鸡，在其他组织中公母鸡CPT1BmRNA表达量无显著差异。同时，CPT1B mRNA基因表达具有一定的组织特异性，CPT1B在腓肠肌中表达量显著高于其他组织表达量，在其他组织中表达量差异不显著。说明隐性白羽鸡产蛋高峰期腓肠肌在脂质分解代谢过程中发挥重要作用。

以上所述实施方式仅表达了本实用新型的一种或多种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本实用新型专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本实用新型的保护范围。