用于诊断泌尿生殖感染性疾病的dna芯片的制作方法
【专利摘要】本发明涉及包含用于诊断泌尿生殖感染性疾病之寡核苷酸探针的DNA芯片，并且更特别地涉及用于诊断泌尿生殖感染性疾病的具有针对泌尿生殖感染性疾病之14种病原生物的固定寡核苷酸探针的DNA芯片。根据本发明的用于诊断泌尿生殖感染性疾病的DNA芯片不仅具有出众的灵敏度、特异性和再现性，而且甚至涵盖多种临床标本的复杂感染以便能够快速和准确地分析是否有泌尿生殖感染性疾病之14种病原生物的感染，因此可以有价值地用于在治疗设施中对泌尿生殖感染性疾病进行初步诊断和治疗。
【专利说明】用于诊断泌尿生殖感染性疾病的DNA芯片
【技术领域】
[0001]本公开内容涉及用于诊断生殖泌尿感染的DNA芯片，并且更特别地涉及用于诊断生殖泌尿感染的DNA芯片，其上固定有用于检测14种生殖泌尿感染病原体的寡核苷酸探针。
【背景技术】
[0002]常规地，多种方法(包括通过涂片和染色的显微镜测试、细菌培养、抗生素易感性测试、抗原-抗体测试和免疫学测定)用于诊断感染性疾病。然而，这样的常规诊断方法具有局限性。常规方法对于相当多数量的特定细菌物种是不方便或者不相容的，且耗时、导致高成本和更多的人力，且单个测定仅分析有限数目的临床标本。此外，这样的方法大多通过单个测试仅对应于一种病原体，且包括非自动化的结果读取过程，这阻碍用于临床使用的应用。所述方法需要活细菌作为目标样品，因此在对所述细菌进行测试之前应当保持细菌的活力，这需要在样品处理和运输中仔细地操作，并因此提高了成本。
[0003]为解决这些缺点，近年来已经针对感染性疾病诊断实行了分子遗传学分析，并已经迅速替代了常规的方法。特别地，通过使用DNA微阵列或者DNA芯片对多个样品的自动化测定进行基因分析的感染诊断吸引了更多的关注，其提供了比常规感染诊断方法更多的优势，并且已经越来越多地用作对常规方法的辅助或者替代测定方法。遗传学诊断方法可以通过DNA和RNA测序测定来准确地鉴定目标细菌的主要类型和亚型，并且还可适合于死细菌，因此消除了对困难的样品制备和运输过程的任何需要。遗传学诊断方法包括通过聚合酶链反应(PCR )的目标基因扩增，并因此可以以高灵敏度诊断甚至痕量的样品。遗传学诊断方法还具有高特异性和高再现性。多数遗传学诊断方法在24小时内迅速提供准确的结果，并需要更少的人力和更低的成本。此外，使用DNA芯片的遗传学诊断使得多个样品的高通量分析成为可能。
[0004]多重PCR方法(其中在单个测试管中进行多个聚合酶链反应)已被开发并广泛地用于诊断细菌感染(McNulty et al.，Sex.Transm.1nfec.,80:207,2004)。
[0005]生殖泌尿感染性疾病是最常见的细菌感染性疾病之一(第二最常见，仅次于呼吸道感染)，且每年约7800万至3.3亿人被诊断为患有生殖泌尿感染的新患者(Lee et al.,J.Microbiol.,45:453，2007)。这些感染性疾病中的一些为性病，其在韩国在法律上指定为应全国性法定传染病(类别III)，其可能间歇地流行，因此需要持续的发病率监测和针对它们的预防性措施。特别地，性病处于哨点监测之下。过去，该疾病是指通过性或者性接触作为媒介的特定疾病。然而，因为发现很多种疾病通过性或者性接触作为媒介，所以具有普遍含义的通称“性传播疾病(4?碎勺省晷， sexually transmitted disease, STD)”已经用来代替具有局限含义的术语“性病”。
[0006]STD是通称，是指任何通过性或者性接触作为媒介的疾病。引起STD的病原体细菌包括:淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)(其引起男性中的尿道炎、前列腺炎或者附睾炎，以及女性中的子宫颈炎、阴道炎或者盆腔炎性疾病)；沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis);解服服原体(Ureaplasma urealyticum);生殖支原体(Mycoplasma genitalium);人型支原体(Mycoplasma hominis);阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis);单纯疱疫病毒(Herpes simplex virus);苍白密螺旋体(Treponemapallidum)、单纯疱疫病毒和杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)(其引起外生殖器溃疡);以及人乳头瘤病毒(?,音平吾呌叫司厶 ,human papilloma virus,HPV)(其引起外生殖器疣、子宫颈癌、肛门癌或者阴茎癌)。除了引起STD的这些细菌，不引起STD但引起STD样症状(如阴道炎)并因此需要鉴定/检测的那些细菌有大肠杆菌(Escherichiacoli)、阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis)和真菌白色念珠菌(Candida albicans)。
[0007]据报道，在美国每年1500人新感染STD，且6500万或者更多人感染病毒性STD。尽管如此高的发病率，但多数生殖泌尿感染仍未被识别和未被治疗，因为它们是无症状的，但是可能发展到引起并发症(如前列腺炎、附睾炎、免疫缺陷和癌症)。特别地，对于多数病毒性STD还未发现有效的治疗。因此，STD的准确诊断和预防是最重要的。此外，发现和治疗无症状患者并预防感染的扩散也是重要的(Campbell-Walsh Urology, 2007)。
[0008]对此，作为辛勤工作以开发同时检测多个、引起高流行性生殖泌尿感染之细菌的结果，本公开内容的发明人开发了具有可与14种生殖泌尿感染病原体杂交之固定寡核苷酸探针的DNA芯片，其可以准确和迅速地分析所述14种生殖泌尿感染病原体的感染，包括在多个样品中的多种感染，因此完成了本公开内容。
[0009]发明概述 [0010]本发明的目的是提供用于通过检测引起生殖泌尿感染的细菌来诊断生殖泌尿感染的DNA芯片。
[0011]为了实现上述目的，本发明提供了用于诊断生殖泌尿感染的DNA芯片，其上固定有具有SEQ ID N0.1至14之核苷酸序列的寡核苷酸探针。
[0012]本发明还提供用于诊断生殖泌尿感染的试剂盒，其包含用于诊断生殖泌尿感染的DNA芯片、用于扩增生殖泌尿感染病原体和用作内对照之β -珠蛋白的DNA的引物组、以及作为具有与位置标记物互补之核苷酸序列的寡聚体的抗PM。
[0013]附图简述
[0014]图1为(a)根据本公开内容的一个实施方案的用于筛选检测目标病原细菌之探针的DNA芯片的示意图，以及(b)来自目标病原细菌之PCR产物的荧光扫描的结果；
[0015]图2示出T-接头增强了荧光信号强度的稳定性；
[0016]图3为根据本公开内容的一个实施方案的DNA芯片的顶视示意图和在DNA芯片上探针的固定模式；
[0017]图4举例说明了从患有多重感染(GV、UU、HSV2和TV)之患者提取的病原体的基因的多重PCR之PCR产物的电泳结果；
[0018]图5为杂交后DNA芯片的荧光扫描图像；
[0019]图6为用于检测引起生殖泌尿感染之病原体的全部测定过程的示意图，包括多重PCR、DNA芯片杂交和荧光扫描；
[0020]图7为O-1O7个拷贝的GV参考的荧光扫描图像以及其用于鉴定最小检测限(萄全毛晉培 月I，minimum detection limit)之SV的曲线图；
[0021]图8举例说明了基于PCR的检测和使用根据本公开内容的一个实施方案的DNA芯片的检测在灵敏度和特异性方面的比较；以及
[0022]图9举例说明了已知探针和根据本公开内容的一个实施方案的探针之间灵敏度的比较。
[0023]发明详述和优选的实施方式
[0024]根据本公开内容的一个方面，提供了用于诊断生殖泌尿感染的DNA芯片，在其上固定有具有SEQ ID N0.1至14之核苷酸序列的寡核苷酸探针。
[0025]在所述DNA芯片中，具有SEQ ID N0.1至14之核苷酸序列的寡核苷酸探针可以与生殖泌尿感染病原体的DNA杂交。所述生殖泌尿感染病原体可选自:大肠杆菌(Escherichia coli, EC)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae, KP)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA)、|^肠球菌(Enterococcus faecalis, EF)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea, NG)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis, CT)、解服服原体(Ureaplasma urealyticum, UU)、人型支原体(Mycoplasma hominis, ΜΗ)、生殖支原体(Mycoplasma genitalium, MG)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis, TV)、白色念珠菌(Candida albicans, CA)、阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis, GV)、1 型单纯疱疫病毒(Herpes simpl ex virus-typel, HSVI)和 2 型单纯抱疫病毒(Herpes simplexvirus-type2, HSV2)。
[0026]DNA芯片还可以包含内对照(internal control)和位置标记物(positionmarker)。
[0027]本文中使用的术语“内对照(IC) ”是指固定在DNA芯片上以核实全部检验过程(包括杂交到DNA芯片上之前的聚合酶链反应(PCR))是否已经适当地进行的探针。在本公开内容的一个实施方案中，所述内对照可以是具有SEQ ID N0.15之核苷酸序列的寡核苷酸探针，其可与在人中检测到的管家基因珠蛋白杂交(不论是否有细菌感染)。
[0028]本文中使用的术语“位置标记物(PM) ”是指固定在DNA芯片上以核实杂交反应是否已经适当地发生的探针。杂交前，可将预定量的作为具有与位置标记物互补序列之寡聚体的Cy3-dUTP标记的抗PM添加至样品以鉴定是否杂交，然后其阳性信号表明杂交已经适当地发生。
[0029]在本公开内容的一个实施方案中，位置标记物可以是具有SEQ ID N0.16之核苷酸序列的寡核苷酸探针。
[0030]在本公开内容的一个实施方案中，为开发对生殖泌尿感染病原体具有提高的特异性的新探针，如下选择每种生殖泌尿感染病原体的目标位点:首先，探针序列选自每种病原体特异性的16S rRNA(对于真核生物白色念珠菌为18S rRNA)和23S rRNA基因，所述基因通常用于系统发生分析。当从这些序列中无可用的合适序列时，寻找和选择每种病原体特异性的基因用于探针序列。选择作为每种生殖泌尿感染病原体特异性的探针的目标位点及其GenBank登录号一起在表1中示出。
[0031]表1.生殖泌尿感染病原体的目标位点
【权利要求】
1.用于诊断生殖泌尿感染的DNA芯片，其上固定有具有SEQID N0.1至14之核苷酸序列的寡核苷酸探针。
2.权利要求1的DNA芯片，其中所述具有SEQID N0.1至14之核苷酸序列的寡核苷酸探针与生殖泌尿感染病原体的DNA杂交。
3.权利要求2的DNA芯片，其中所述生殖泌尿感染病原体选自:大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)> 幾肠球菌(Enterococcus faecalis)> 淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、解服服原体(Ureaplasma urealyticum)、人型支原体(Mycoplasma hominis)、生殖支原体(Mycoplasmagenitalium)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、白色念珠菌(Candida albicans)、阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis)、I 型单纯疱疫病毒(Herpes simplex virus-typel)和 2 型单纯疱疫病毒(Herpes simplex virus-type2)。
4.权利要求1的DNA芯片，其还包含内对照和位置标记物。
5.权利要求4的DNA芯片，其中所述内对照是可与β-珠蛋白杂交的具有SEQIDN0.15之核苷酸序列的寡核苷酸探针。
6.权利要求4的DNA芯片，其中所述位 置标记物是具有SEQID N0.16之核苷酸序列的寡核苷酸探针。
7.权利要求1的DNA芯片，其中所述DNA芯片包含至少一个具有探针斑点集的部分，所述探针斑点集包含每种生殖泌尿感染病原体之每种基因的3个重复斑点，并且所述部分包含在其中间的用于内对照和位置标记物的重复斑点。
8.权利要求1的DNA芯片，其中所述寡核苷酸探针在其5’末端包含用于固定在所述DNA芯片之基底上的T-接头。
9.用于诊断生殖泌尿感染的试剂盒，所述试剂盒包含: 权利要求1至8中任一项的DNA芯片； 引物组，其用于扩增生殖泌尿感染病原体和用作内对照的β_珠蛋白的DNA ;以及 作为寡聚体的抗PM，所述寡聚体具有与位置标记物互补的核苷酸序列。
10.权利要求9的试剂盒，其中所述引物组选自:用于扩增粪肠球菌之DNA的具有SEQID N0.17和18之核苷酸序列的引物组、用于扩增白色念珠菌之DNA的具有SEQ ID N0.19和20之核苷酸序列的引物组、用于扩增人型支原体之DNA的具有SEQ ID N0.21和22之核苷酸序列的引物组、用于扩增阴道加德纳菌之DNA的具有SEQ ID N0.23和24之核苷酸序列的引物组、用于扩增沙眼衣原体之DNA的具有SEQ ID N0.25和26之核苷酸序列的引物组、用于扩增珠蛋白之DNA的具有SEQ ID N0.27和28之核苷酸序列的引物组、用于扩增β -珠蛋白之DNA的具有SEQ ID N0.29和30之核苷酸序列的引物组、用于扩增大肠杆菌之DNA的具有SEQ ID N0.31和32之核苷酸序列的引物组、用于扩增金黄色葡萄球菌之DNA的具有SEQ ID N0.33和34之核苷酸序列的引物组、用于扩增生殖支原体之DNA的具有SEQ ID N0.35和36之核苷酸序列的引物组、用于扩增I型单纯疱疹病毒之DNA的具有SEQ ID N0.37和38之核苷酸序列的引物组、用于扩增I型单纯疱疹病毒之DNA的具有SEQID N0.39和40之核苷酸序列的引物组、用于扩增阴道毛滴虫之DNA的具有SEQ ID N0.41和42之核苷酸序列的引物组、用于扩增阴道毛滴虫之DNA的具有SEQ ID N0.43和44之核苷酸序列的引物组、用于扩增淋病奈瑟菌之DNA的具有SEQ ID N0.45和46之核苷酸序列的引物组、用于扩增解脲脲原体之DNA的具有SEQ ID N0.47和48之核苷酸序列的引物组、用于扩增肺炎克雷伯菌之DNA的具有SEQ ID N0.49和50之核苷酸序列的引物组、用于扩增2型单纯疱疹病毒之DNA的具有SEQ ID N0.51和52之核苷酸序列的引物组、以及用于扩增2型单纯疱疹病毒之DNA的具有SEQ ID N0.53和54之核苷酸序列的引物组。
11.权利要求9的试剂盒，其中所述引物组还在其5’末端包含用于检测所扩增的与所述DNA芯片互补结合之DNA的标签元件。
12.权利要求11的试剂盒，其中所述标签元件选自:Cy5、Cy3、FAM、TAMRA、AlexaFluor和 Texas Red。
【文档编号】F25B33/00GK103958988SQ201180075006
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2011年11月29日 优先权日:2011年9月23日
【发明者】朴铉圭, 郑霓琳, 郑源英, 朴基洙, 郑哲熙, 申星澈, 赵大衍, 黄相畯, 朴孝元 申请人:韩国科学技术院, 莱博基因有限公司