专利名称：一种用于地表水修复的固定化颗粒制备方法
技术领域：
本发明涉及细胞固定化生物制剂，具体地说是一种PVA-Na·Alg包埋固定化微生物工艺。
背景技术：
地表水污染问题是现代工农业高速发展的产物，在重化工业密集的工业城镇，这种现象尤为突出，由于污染导致的水质型缺水现象逐渐加剧，目前，我国1/3以上的河段受到污染，90％以上的城市水域污染严重，每年因地表水污染造成的直接经济损失超过4500亿元人民币，区域水环境的破坏导致环境容量持续下降，不仅严重制约了经济发展，还因水污染纠纷造成常发性社会不稳定事件，地表水治理和修复已经成为现实和迫切的环保课题。
污染地表水具有受污途径及分布地域广、流动性大、季节性强、污染物浓度低等特征，复杂的污染特性增加了传统修复技术实施的困难。传统微生物修复是利用游离菌的降解作用消减污染物、恢复环境清洁的技术，随着污染物趋向成分更复杂、易积累难降解和毒性影响更长期等特点，传统微生物修复技术的缺陷逐渐显现，如单位体积内有效降解菌浓度低、反应器启动慢、菌体易流失、与土著菌竞争处于弱势、抗毒性侵害能力差、对激烈的水力条件变化敏感等，因此，亟需开发更适合地表水修复的新型实用生物技术。
微生物固定化是指对完整细胞进行固定的特殊生物技术，可以避免人为破坏生物酶的活性和生化反应的稳定性，细胞的相对流动速率快，在稀释率高于微生物生长率的情况下，能够有效地解决污染环境修复问题；微生物经固定化后可以长期保持活性，且可重复利用；在载体与细胞之间建立的某种物理或化学联系，加强了细胞的稳定性，营造的固定化微环境对微生物细胞起保护作用，有利于屏蔽土著菌、噬菌体和毒性物质对细胞的侵害，对于有机污染物浓度较低、水力条件变化不显著的(缓流或静止)污染地表水，可根据污染特征方便地调解固定化颗粒孔隙大小、外形尺寸、机械性能、比重等物理性能，强化传质特性。因此，固定化微生物在修复地表水领域无疑具有光明的应用前景。
微生物固定化技术的关键是筛选适宜的载体材料和确定优化的固定化工艺条件。
PVA和Na·Alg是两种良好的固定化在载体材料，对很多微生物都具有较好的包埋效果，在食品、制药、环保、新能源开发及化学合成等领域得到了广泛应用；尽管如此，但传统的PVA和Na·Alg包埋固定方法依然存在较多缺陷和不足，如颗粒的扩散传质性能差、孔隙不均匀、Na·Alg自溶解、机械强度低、密度可控性差、抗温度变化和酸碱度变化能力弱等，一旦投入地表水修复使用，固定化颗粒极易破碎、菌体生理活性低、水力条件和外界因素改变对颗粒的冲击破坏力强，导致修复失败。此外，传统的某一种PVA、Na·Alg固定化方法常常对应单一菌种，缺乏广谱适应性，对混合菌的固定不利。
发明内容
为了解决上述问题，本发明通过系统的正交试验，将PVA和Na·Alg两种载体材料组合在一起形成混合凝胶液，并添加不同浓度的多种促进剂、改良剂、强化剂，改进了传统的PVA和Na·Alg包埋固定工艺，使固定化条件更加简化和温和，提高了固定化颗粒的多种技术指标(性能更加优良)，并可对混合菌进行联合共固定。将制得的固定化颗粒应用于地表水修复，144小时连续监测水体的COD值变化，结果表明按照该配方制得的固定化生物产品对以COD为主的污染地表水具有良好的修复效果，是一种可信赖的新型环保生物制剂。
本发明采用的技术方案(固定化颗粒制备方法)为向预先混合的PVA-Na·Alg凝胶液(用自来水浸润12-20h)里添加定量活性炭、沸石粉和酵母膏，按照20％的比例将培养16-20小时的混合菌种子液与凝胶液混匀，在40℃和pH自然条件下，通过直径为3mm的制粒器，按照每分钟20-30滴的流滴速度制取固定化颗粒，颗粒经24-29小时化学交联，然后在固定剂中加固20-24小时，最后以无菌水浸泡24h，冲洗净残留药液后，增殖培养，备用。具体操作步骤如下(1)菌体培养基[基础培养基]0.3％牛肉膏，1.0％蛋白胨，0.5％NaCl，1.5-2.0％琼脂，pH＝7.0-7.2；[种子培养基]1.25％葡萄糖，0.25％酵母膏，0.1％NH4NO3，0.02％MgSO4·7H2O，0.02％KCl，pH＝7.0-7.2；[增殖培养基]3.0％葡萄糖，0.4％酵母膏，0.1％牛肉膏，0.1％NH4NO3，0.02％MgSO4·7H2O，0.02％KCl，pH＝7.0-7.2。
(2)凝胶液配方(质量百分比，沸石粉可用硅藻土替代)[可行的配方]聚乙烯醇(PVA)9.2％-12％，海藻酸钠(Na·Alg)0.3％-0.6％，活性炭粉3％-5％，沸石粉(0.074mm含量大于70％)2％-5％，酵母膏0.05％-0.14％。以20％自来水浸润12-20小时。使用前于111℃下湿热灭菌30min，冷却到35℃-45℃，备用。
聚乙烯醇(PVA)9.8％-11％，海藻酸钠(Na·Alg)0.45％-0.55％，活性炭粉3.5％-4.5％，沸石粉(0.074mm含量大于70％)3％-4.5％，酵母膏0.08％-0.12％。以20％自来水浸润12-20小时。使用前于111℃下湿热灭菌30min，无菌条件下冷却到38℃-42℃左右，备用。
聚乙烯醇(PVA)10.3％-10.8％，海藻酸钠(Na·Alg)0.48％-0.52％，活性炭粉3.8％-4.2％，沸石粉(0.074mm含量大于70％)3.4％-4.0％，酵母膏0.09％-0.11％。以20％自来水浸润12-20小时。使用前于111℃下湿热灭菌30min，无菌条件下冷却到39℃-41℃左右，备用。
聚乙烯醇(PVA)10.5％，海藻酸钠(Na·Alg)0.5％，活性炭粉4％，沸石粉(0.074mm含量大于70％)4.1％，酵母膏0.1％。以20％自来水浸润12-20小时。使用前于111℃下湿热灭菌30min，无菌条件下冷却到40℃左右，备用。
(3)交联剂配方(质量百分比)[可行的配方]一次交联剂8.55％-9.85％的五硼酸铵水溶液，pH＝5.5-7.0；二次交联剂1.5％-3.2％的AlCl3和0.8％-1.8％FeCl3混合水溶液，pH＝2.0-3.0。
一次交联剂8.85％-9.45％的五硼酸铵水溶液，pH＝5.8-6.6；二次交联剂1.8％-3.0％的AlCl3和1.0％-1.6％FeCl3混合水溶液，pH＝2.2-2.8。
一次交联剂9.05％-9.25％的五硼酸铵水溶液，pH＝6.0-6.4；二次交联剂2.0％-2.6％的AlCl3和1.1％-1.3％FeCl3混合水溶液，pH＝2.4-2.6。
一交联剂9.12％的五硼酸铵水溶液，pH＝6.2；二次交联剂2.1％的AlCl3和1.2％FeCl3混合水溶液，pH＝2.5。
(4)加固剂配方[可行的配方]7.5％-9.5％的Na2SO4水溶液，pH自然。
7.9％-9.1％％的Na2SO4水溶液，pH自然。
8.3％-8.8％的Na2SO4水溶液，pH自然。
8.45％的Na2SO4水溶液，pH自然。
(5)增殖培养将制备的固定化颗粒在无菌条件下按照25％的质量浓度加入到增殖培养基中，控制温度28-30℃，摇床转速145rpm-155rpm，培养时间24小时，之后更换培养基，共3次培养，备用。
本发明具有如下优点1、通过优化PIV-Na·Alg凝胶液配方各组分的含量，并利用两次交联和后续加固等技术措施，制备的固定化颗粒微观结构均匀，孔隙率超过92％，扩散传质性能优异，为微生物提供了良好的生活环境。
2、通过向凝胶液中添加活性炭、矿物粉末等辅助材料，使得固定化颗粒机械强度大为提高，平均强度31.5Kg/cm2，颗粒弹性优良，增殖后体积增加8％，颗粒外形完好，不破碎。
3、可用于芽孢杆菌属、微球菌属、黄杆菌属、微杆菌属等多菌种的共固定，每种细菌活性不降低。
4、固定化颗粒对环境的耐性得到显著增强固定化细菌适应更低的环境温度，在15℃-35℃范围内均能保持较好的活性；固定化细菌对pH变化呈惰性，在pH＝5-8范围内，固定化细菌的活性没有发生明显改变；固定化细菌对重金属(Cu、P、Cr、Hg、As，浓度0.1mmol/L)毒性存在明显的耐受能力。
5、固定化颗粒中的Na·Alg不发生自溶解现象，连续使用180天增殖再生后，细菌活性恢复原始状态。
6、共固定细菌对以COD为主要指标的污染地表水具有明确的修复效果，在投粒比为8％-10％、修复时间为72小时的条件下，COD去除率最小为85.2％，最高达到94.7％，平均去除率超过90％。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1(1)混合菌斜面培养在四只牛肉蛋白胨基础培养基(0.3％牛肉膏，1.0％蛋白胨，0.5％NaCl，1.5-2.0％琼脂，pH＝7.0-7.2)的试管中分别接入芽孢杆菌、微球菌、黄杆菌和微杆菌，置28℃-30℃培养箱中培养2天。
(2)混合菌种子液制备分别用接种环在斜面培养基上接取2环菌苔，接入到液体种子培养基(1.25％葡萄糖，0.25％酵母膏，0.1％NH4NO3，0.02％MgSO4·7H2O，0.02％KCl，pH＝7.0-7.2)中，在摇床转速130rpm-140rpm、28℃-30℃条件下，培养16-20小时；将培养液混和，制得混合菌种子液。
(3)凝胶液配置按照总质量200g，称取9.8％PVA粉、0.45％Na·Alg、3.5％活性炭粉、3.0％沸石粉(0.074mm含量大于70％)、0.08％酵母膏，以40g自来水浸润18小时。于111℃下湿热灭菌30min，冷却到39℃。
(4)交联剂配置按照总质量600g，称取8.85％五硼酸铵，溶于91.15％蒸馏水，调节pH＝5.8，制得一次交联剂。
按照总质量600g，称取1.8％AlCl3和1.0％FeCl3，溶于97.2％蒸馏水，调节pH＝2.2，制得二次交联剂。
(5)加固剂制备按照总质量600g，称取7.9％Na2SO4水溶液，pH自然，制得加固剂。
(6)固定化颗粒制备按照20％的质量百分比，量取40ml混合菌种子液，与200g凝胶液混和，迅速搅拌5分钟，装入出口直径为3mm的玻璃制粒器，通过真空抽吸控制出口流滴速度为24滴/分钟，凝胶粒子滴入一次交联剂，制粒结束后，继续交联14小时，将粒子转移至二次交联剂中，再次交联11小时，然后将粒子转移至加固剂中，加固反应20小时，最后用无菌水冲洗，浸泡24小时，制得固定化颗粒。
经上述步骤制得的固定化颗粒机械强度达到26.5Kg/cm2。
(7)增殖培养将固定化颗粒接入增殖培养基(3.0％葡萄糖，0.4％酵母膏，0.1％牛肉膏，0.1％NH4NO3，0.02％MgSO4·7H2O，0.02％KCl，pH＝7.0-7.2)中，在摇床转速147rpm、29.5℃条件下，培养24小时；然后更换增殖培养基2次，每次重复增殖培养步骤。
(8)地表水修复效果固定化颗粒投粒比9％，自然流动条件，修复72小时，COD去除率达到78.5％。
实施例2与实施例1不同之处在于配凝胶液置时，按照总质量200g，称取10.8％PVA粉、0.52％Na·Alg、4.2％活性炭粉、4.0％沸石粉(0.074mm含量大于70％)、0.11％酵母膏，以40g自来水浸润20小时。于111℃下湿热灭菌25min，冷却到38℃。配置交联剂时，按照总质量600g，称取9.25％五硼酸铵，溶于90.75％蒸馏水，调节pH＝6.4，制得一次交联剂。按照总质量600g，称取2.6％AlCl3和1.3％FeCl3，溶于96.1％蒸馏水，调节pH＝2.6，制得二次交联剂。制备加固剂时，按照总质量600g，称取9.1％Na2SO4，制得加固剂。制备固定化颗粒时，通过真空抽吸控制出口流滴速度为26滴/分钟，一次交联12小时，二次交联17小时，加固反应23小时，无菌水浸泡23小时，制得固定化颗粒。
经上述步骤制得的固定化颗粒机械强度达到31.9Kg/cm2。
固定化颗粒在摇床转速149rpm、28.5℃条件下增殖培养24小时(重复2次)，用于地表水修复，固定化颗粒投粒比11％，自然流动条件，修复72小时，COD去除率达到86.5％。
实施例3与实施例1不同之处在于配凝胶液置时，按照总质量200g，称取10.3％PVA粉、0.48％Na.Alg、3.8％活性炭粉、3.4％沸石粉(0.074mm含量大于70％)、0.10％酵母膏，以40g自来水浸润22小时。于111℃下湿热灭菌28min，冷却到41℃。配置交联剂时，按照总质量600g，称取9.05％五硼酸铵，溶于90.95％蒸馏水，调节pH＝6.0，制得一次交联剂。按照总质量600g，称取2.0％AlCl3和1.1％FeCl3，溶于96.9％蒸馏水，调节pH＝2.4，制得二次交联剂。制备加固剂时，按照总质量600g，称取8.3％Na2SO4，制得加固剂。制备固定化颗粒时，通过真空抽吸控制出口流滴速度为29滴/分钟，一次交联15小时，二次交联13小时，加固反应22小时，无菌水浸泡22小时，制得固定化颗粒。
经上述步骤制得的固定化颗粒机械强度达到33.2Kg/cm2。
固定化颗粒在摇床转速150rpm、30℃条件下增殖培养24小时(重复2次)，用于地表水修复，固定化颗粒投粒比10％，自然流动条件，修复72小时，COD去除率达到87.1％。
实施例4与实施例1不同之处在于以3.1％硅藻土代替沸石粉，制得固定化颗粒。
经上述步骤制得的固定化颗粒机械强度达到32.6Kg/cm2。
固定化颗粒在摇床转速145rpm、28℃条件下增殖培养24小时(重复2次)，用于地表水修复，修复72小时，COD去除率达到92.6％。
实施例5与实施例1不同之处在于以1.2％吐温80代替酵母膏，制得固定化颗粒。
经上述步骤制得的固定化颗粒机械强度达到27.2Kg/cm2。
用于地表水修复，COD去除率达到82.6％。
实施例6与实施例1不同之处在于配凝胶液置时，按照总质量200g，称取10.5％PVA粉、0.5％Na·Alg、4％活性炭粉、4.1％沸石粉(0.074mm含量大于70％)，以40g自来水浸润22小时。配置交联剂时，按照总质量600g，称取9.12％五硼酸铵，溶于90.88％蒸馏水，调节pH＝6.2，制得一次交联剂。按照总质量600g，称取2.1％AlCl3和1.2％FeCl3，溶于96.7％蒸馏水，调节pH＝2.5，制得二次交联剂。制备加固剂时，按照总质量600g，称取8.45％Na2SO4，制得加固剂。制备固定化颗粒时，通过真空抽吸控制出口流滴速度为22滴/分钟，一次交联16小时，二次交联10小时，加固反应24小时，制得固定化颗粒。
经上述步骤制得的固定化颗粒机械强度达到36.1Kg/cm2。
固定化颗粒在摇床转速152rpm、28.2℃条件下增殖培养24小时(重复2次)，用于地表水修复，COD去除率达到92.3％。
权利要求
1.一种用于地表水修复的固定化颗粒制备方法，其特征在于1)向预先混合的PVA-Na·Alg凝胶液里添加活性炭、沸石粉或硅藻土，并添加酵母膏，它们的质量百分组成为聚乙烯醇9.2％-12％，海藻酸钠0.3％-0.6％，活性炭粉3％-5％，沸石粉或硅藻土2％-5％，酵母膏0.05％-0.14％，余量以水补足；2)向凝胶液中加入细菌种子液，混匀，制粒，凝胶粒子滴入(按照每分钟20-30滴的流滴速度)交联剂中，经化学交联，然后在质量浓度7.5％-9.5％的Na2SO4固定剂中加固，以无菌水水浸泡，冲洗，制得固定化颗粒；所述化学交联为二次，一次交联剂为质量浓度8.55％-9.85％的五硼酸铵水溶液，pH＝5.5-7.0；二次交联剂为质量浓度1.5％-3.2％的AlCl3和0.8％-1.8％FeCl3混合水溶液，pH＝2.0-3.0。
2.按照权利要求1所述的固定化颗粒的制备方法，其特征在于所述化学交联时间为24-29小时；在固定剂中加固20-24小时。
3.按照权利要求1所述的固定化颗粒的制备方法，其特征在于将制备的固定化颗粒在无菌条件下按照25％的质量浓度加入到增殖培养基中，控制温度28-30℃，摇床转速145rpm-155rpm，培养时间24小时，之后更换培养基，共3次培养，备用。
4.按照权利要求3所述的固定化颗粒的制备方法，其特征在于所述菌体为芽孢杆菌、微球菌、黄杆菌和/或微杆菌；增殖培养基为3.0％葡萄糖，0.4％酵母膏，0.1％牛肉膏，0.1％NH4NO3，0.02％MgSO4·7H2O，0.02％KCl，pH＝7.0-7.2。
5.按照权利要求1所述的固定化颗粒的制备方法，其特征在于步骤1)向预先混合用自来水浸润12-20h的PVA-Na·Alg凝胶液里添加活性炭、沸石粉或硅藻土，酵母膏，凝胶液的质量百分组成为聚乙烯醇9.8％-11％，海藻酸钠0.45％-0.55％，活性炭粉3.5％-4.5％，0.074mm含量大于70％的沸石粉或硅藻土3％-4.5％，酵母膏0.08％-0.12％，余量以水补足；使用前于111℃下湿热灭菌30min，无菌条件下冷却到35℃-45℃左右，备用；所述化学交联为二次，一次交联剂8.85％-9.45％的五硼酸铵水溶液，pH＝5.8-6.6；二次交联剂1.8％-3.0％的AlCl3和1.0％-1.6％FeCl3混合水溶液，pH＝2.2-2.8；固定剂质量含量为7.9％-9.1％％的Na2SO4。
6.按照权利要求5所述的固定化颗粒的制备方法，其特征在于凝胶液的质量百分组成为聚乙烯醇10.3％-10.8％，海藻酸钠0.48％-0.52％，活性炭粉3.8％-4.2％，0.074mm含量大于70％的沸石粉3.4％-4.0％，酵母膏0.09％-0.11％，余量以水补足所述化学交联为二次。一次交联剂9.05％-9.25％的五硼酸铵水溶液，pH＝6.0-6.4；二次交联剂2.0％-2.6％的AlCl3和1.1％-1.3％FeCl3混合水溶液，pH＝2.4-2.6；固定剂质量含量为8.3％-8.8％的Na2SO4。
7.按照权利要求5所述的固定化颗粒的制备方法，其特征在于凝胶液的质量百分组成为聚乙烯醇10.5％，海藻酸钠0.5％，活性炭粉4％，0.074mm含量大于70％的沸石粉4.1％，酵母膏0.1％；所述化学交联为二次，一交联剂9.12％的五硼酸铵水溶液，pH＝6.2；二次交联剂2.1％的AlCl3和1.2％FeCl3混合水溶液，pH＝2.5；固定剂质量含量为8.45％的Na2SO4。
全文摘要
本发明涉及细胞固定化微生物制剂，具体地说是一种用于地表水修复的固定化颗粒制备方法，1)向预先混合的PVA－Na·Alg凝胶液里添加活性炭、沸石粉或硅藻土，并添加酵母膏；2)向凝胶液中加入菌体种子液，制粒，凝胶粒子滴入交联剂化学交联，然后在固定剂中加固后，以无菌水水浸泡，冲洗，制得固定化颗粒。本发明优点为通过优化PIV－Na·Alg凝胶液配方各组分的含量制备的固定化颗粒微观结构均匀，孔隙率大于92％，扩散传质性能优异，为微生物提供了良好的生活环境；固定化颗粒机械强度高，长期使用不破碎，对外部环境具有显著的耐性，对以COD为主要指标的污染地表水具有明确的修复效果。
文档编号C02F3/34GK1740317SQ20041005032
公开日2006年3月1日 申请日期2004年8月27日 优先权日2004年8月27日
发明者李海波, 李培军, 鞠京丽, 张轶, 许华夏, 尹炜 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所