专利名称：含咖啡碱废水的无害化处理方法及所用菌的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域。具体的说，本发明涉及ー种利用细菌降解咖啡碱进行含咖啡因废水的无害化处理方法。
背景技术：
茶多酚是从茶叶中提取的重要生理活性成分，具有抗氧化、抗辐射、抗突变、抗肿瘤、抗衰老等诸多功能，在功能食品和医药领域具有良好的应用前景，因此，茶多酚提取和纯化产业发展非常迅猛，到2011年，全国茶多酚生产企业超过60家，规模在100吨以上的企业有10余家，年产量4000吨以上。茶多酚常采用萃取、浄化、提纯和干燥等エ艺制备而成，其中提纯エ序是影响产品质量最重要的エ序。茶多酚的提纯エ序主要目的是去除咖啡碱等杂质。从茶多酚中脱除咖啡因等杂质的主要方法有有机溶剂(如氯仿等)萃取、金属离子沉淀(如Ca2+等)/酸转溶/こ酸こ酯萃取、逆流色谱和树脂吸附分离等几种方法，这些方法各有各的优缺点，但是所有的方法都会产生一定数量的含茶多酚、咖啡碱、果胶、蛋白、氨基酸以及ー些胶状颗粒物的废水，其中茶多酚、果胶、蛋白、氨基酸和颗粒物对废水的化学耗氧量(C0D)、生物耗氧量(BOD)、悬浮物(SS)和色度等有重要影响，是茶多酚生产和精制企业废水无害化处理过程中的主要目标物。目前，较大規模的茶多酚生产和精制企业对废水处理已经相当重视，采取的方法一般为将生产过程中的废水收集入集水池，加入混凝剂或絮凝剂以去除茶多酚和胶状悬浮颗粒，之后依次进行微生物无氧发酵和需氧发酵以去除废水中的大部分有机物，最后通过生物滤池去除微生物并释放。咖啡碱，又名咖啡因，白色针状晶体，具有较强的中枢神经兴奋作用和利尿作用， 被广泛用于医药、食品、化妆品等领域。在茶叶及其片末副产品中，咖啡碱含量一般为 1-5%。在提取茶多酚或者茶多酚精制过程产生的废水中，均含有相当数量的咖啡碱，由于采用的エ艺不同，废水中咖啡因含量在每升几百毫克到上千毫克不等。咖啡碱在我国属于管制产品，其生产必须获得有关部门的严格审批。普通的茶多酚提取或者精制企业一般很难获得生产授权。因此，茶多酚生产企业对生产过程废水中所含的咖啡因一般不会采取回收措施。研究显示，即使是较低浓度的咖啡碱对水生动植物即具有明显的毒性，因此咖啡碱对水生环境具有很大的潜在破坏作用。由于咖啡碱对酸碱和普通氧化剂处理均表现出很强的抗性，普通的微生物一般也很难降解利用咖啡因，而且溶解在水中的咖啡因分散性好、不会像其它污染物一样对水体色度等产生视觉影响，因此，即使废水中含有较高浓度的咖啡因一般也很难在生物耗氧量、悬浮物和色度等的监测指标中得到反映，从而导致废水中残存的咖啡碱很容易被忽视。而且，目前也没有有效的含咖啡因废水的处理技术。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供ー种操作简单、条件温和、效果稳定的含咖啡碱废水的无害化处理方法及所用的恶臭假单胞菌，按照本发明的方法能利用生物发酵途径高效去除废水中的咖啡碱。
为了解决上述技术问题，本发明提供ー种恶臭假单胞菌，保藏名称为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) CT2025,保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期 2012 年 02 月 17 日，保藏号CGMCC NO. 5767。本发明还同时提供了上述恶臭假单胞菌的扩繁法将恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)CGMCC NO. 5767接种于扩繁液体培养基中，于28 30°C、130 150转/分钟条件下扩繁培养，当所得扩繁产物的在600纳米处的吸光度> 4时，停止扩繁培养。作为本发明的恶臭假单胞菌的扩繁法的改进扩繁液体培养基为每升扩繁液体培养基中含有5. 0毫摩尔的氯化钾、I. 5毫摩尔的硫酸亚铁、I. 5毫摩尔的硫酸镁、0. 4毫摩尔的氯化钙、0. 3毫摩尔的磷酸氢ニ钠、0. 15微摩尔的硼酸、0. 05微摩尔的硫酸铜、0. 05微摩尔的硫酸锰、0. 05微摩尔的钥酸钠、0. 05微摩尔的硫酸锌、蔗糖10克、蛋白胨10克、咖啡碱2. 5 7. 5毫摩尔，其余为水；调节pH7. 0后， 高温灭菌。本发明还同时提供了一种含咖啡碱废水的无害化处理方法在每100吨的含咖啡碱废水中接种入0. 8 I. 2kg的恶臭假单胞菌(鲜重)，在以下任意一个废水处理的阶段介入应用在厌氧发酵之后的需氧处理阶段应用，在废水需氧处理结束后应用；上述恶臭假单胞菌为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) CGMCC NO. 5767。本发明所得的在600纳米处的吸光度> 4的扩繁产物(即包含扩繁液体培养基的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida))既可用于菌种保存,也用于含咖B非碱废水的处理。菌种保存的方法是，在菌液(即在600纳米处的吸光度> 4的扩繁产物)中加入相当于菌液体积20%的ニ甲基亚砜，置于零下20度 零下70度冰箱保存。在本发明含咖啡碱废水的无害化处理方法中，恶臭假单胞菌(鲜重)是指将上述菌液(即在600纳米处的吸光度> 4的扩繁产物)在2000-5000转/分钟的条件下离心 10-15分钟所收集的细菌沉淀。本发明适用于活性污泥法处理含咖啡碱废水，可在废水处理的三个阶段介入应用既可在混凝或絮凝后废水中应用，也可在厌氧发酵之后的需氧处理阶段应用，还可在常规废水需氧处理结束后应用(见图I)。作为介入阶段优化该菌在厌氧发酵后的需氧处理阶段介入，不仅咖啡碱降解彻底，而且可与原有废水处理工艺无缝衔接，基本无新增成本。 介入应用的方法为首次使用时(即首次投入菌时)，可根据需氧发酵曝气池的大小，按照I 千克细菌(鲜重)100吨废水的比例接种于常规的需氧曝气池中，常规曝气适应3-5天(即当恶臭假单胞菌接入后，对废水进行常规的曝气增氧发酵3-5天，常温(一般为15-30°C ) 即可)，以利该菌定植于污泥中。之后再次处理废水时，可按照常规的污水需氧处理方法进行含咖啡碱废水的无害化处理，即，废水在需氧曝气池(罐)中的处理时间为48 160小时，处理温度控制在15-30°C。当废水中的咖啡碱浓度低于500毫克/升时，在需氧曝气池 (罐)中的处理时间为48小时；当废水中的咖啡碱浓度为500-1500毫克/升时，在需氧曝气池(罐)中的处理时间为96小吋；当废水中的咖啡碱浓度超过1500毫克/升时，在需氧曝气池(罐)中的处理时间为96 160小吋。因此，当废水中咖啡碱浓度低于500毫克/升吋，每天可将相当于接入菌种量5万倍的废水中咖啡碱彻底降解；当废水中咖啡碱浓度在500-1500毫克/升时，每天可将相当于接入菌种量的2. 5万倍的废水中咖啡碱彻底降解；当废水中咖啡碱浓度超过1500毫克/升时，可将相当于介入菌种量的I. 5-2. 5万倍废水中的咖啡碱彻底降解。废水处理时最适温度应控制在15-30°C。本发明的主要特点是1)利用从茶园土壤分离的恶臭假单胞菌可高效分解咖啡碱的特点，进行了普通化学氧化和微生物发酵很难去除的咖啡碱的生物降解和无害化处理；2)与常规的茶多酚生产精制废水处理工艺衔接良好，几乎无额外投入；3)可在原有废水处理工艺中的需氧发酵阶段介入，咖啡碱去除彻底。4)、本发明的方法适用于去除茶多酚提取或茶多酚精制过程中产生的含咖啡因废水中的咖啡因。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进ー步详细说明。图I是本发明的茶多酚生产和精制过程产生的废水常规活性污泥法处理及其咖啡碱分解菌(即恶臭假单胞菌)介入阶段示意图；图中实线箭头代表必须エ序，虚线箭头代表可选エ序；三角形表示三种可选的咖啡碱分解菌介入阶段，作为优选，在需氧发酵阶段介入，不仅咖啡碱降解彻底，与原有エ 序无缝衔接，而且几乎无额外投入。
具体实施例方式实施例I、恶臭假单胞菌(即咖啡因分解菌)的纯化和驯化从种植10年以上的茶园(位于浙江大学华家池校区茶树种质资源圃)土壤中采集根部表土层，去除枯枝落叶，将I克土壤加无菌水I升搅拌，取上清0. I毫升，接种于装有 20毫升以咖啡碱为唯一碳源和氮源的固体细菌分离培养基(5. 0毫摩尔/升氯化钾、I. 5毫摩尔/升硫酸亚铁、I. 5毫摩尔/升硫酸镁、0. 4毫摩尔/升氯化钙、0. 3毫摩尔/升磷酸氢 ニ钠、0. 15微摩尔/升硼酸、0. 05微摩尔/升硫酸铜、0. 05微摩尔/升硫酸锰、0. 05微摩尔 /升钥酸钠、0. 05微摩尔/升硫酸锌、咖啡碱25毫摩尔/升、琼脂12克/升，pH7. 0)的培养皿中；于28-30°C条件下倒置培养3天，挑取白色各单克隆细菌菌斑，分别接种入I毫升的以咖啡碱为唯一碳源和氮源的液体纯化培养基(100毫摩尔/升咖啡碱，不加琼脂，其余成分和酸度同固体细菌分离培养基)，于28-30°C、130-150转/分钟条件下振荡培养3天， 筛选可在该液体纯化培养基上正常生长的菌株。将获得的菌株按照2毫升菌液I升液体纯化培养基的比例进行接种，在上述相同条件下继代培养3天；如此连续继代10-15次(例如为15次)，获得驯化的咖啡碱分解菌(即，恶臭假单胞菌)。上述固体细菌分离培养基的制备方法如下将5. 0毫摩尔的氯化钾、I. 5毫摩尔的硫酸亚铁、I. 5毫摩尔的硫酸镁、0. 4毫摩尔的氯化钙、0. 3毫摩尔的磷酸氢ニ钠、0. 15微摩尔的硼酸、0. 05微摩尔的硫酸铜、0. 05微摩尔的硫酸锰、0. 05微摩尔的钥酸钠、0. 05微摩尔的硫酸锌、25毫摩尔的咖啡碱和12克琼脂用水定容至I升,然后用浓度为质量浓度4%的氢氧化钠调节PH至7. 0，于121°C灭菌20min，得固体细菌分离培养基。上述液体纯化培养基的制备方法如下将5. 0毫摩尔的氯化钾、I. 5毫摩尔的硫酸亚铁、I. 5毫摩尔的硫酸镁、0. 4毫摩尔的氯化钙、0. 3毫摩尔的磷酸氢ニ钠、0. 15微摩尔的硼酸、0. 05微摩尔的硫酸铜、0. 05微摩尔的硫酸锰、0. 05微摩尔的钥酸钠、0. 05微摩尔的硫酸锌、100毫摩尔的咖啡碱用水定容至I升,然后用质量浓度为4%的氢氧化钠调节pH至
7.0，于121°C灭菌20min，得液体纯化培养基。将获得驯化的咖啡碱分解菌进行保藏，保藏名称为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) CT2025,保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址 北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期2012年02月17 日，保藏号CGMCC NO. 5767。实施例2、咖啡碱分解菌扩繁取I升恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) CGMCC NO. 5767接种于250升的含咖啡碱的扩繁液体培养基(5. 0毫摩尔/升氯化钾、I. 5毫摩尔/升硫酸亚铁、I. 5毫摩尔/升硫酸镁、0. 4毫摩尔/升氯化钙、0. 3毫摩尔/升磷酸氢ニ钠、0. 15微摩尔/升硼酸、0. 05微摩尔/升硫酸铜、0. 05微摩尔/升硫酸锰、0. 05微摩尔/升钥酸钠、0. 05微摩尔/升硫酸锌、 蔗糖10克/升、蛋白胨10克/升、咖啡碱7. 5毫摩尔/升，pH7. 0)，于28-30°C、130-150转 /分钟条件下培养扩繁，当培养基在600纳米处的吸光度> 4时(扩繁时间约为2-4天)， 可用于含咖啡碱废水的处理。上述扩繁液体培养基的制备方法为将5. 0毫摩尔的氯化钾、I. 5毫摩尔的硫酸亚铁、I. 5毫摩尔的硫酸镁、0. 4毫摩尔的氯化钙、0. 3毫摩尔的磷酸氢ニ钠、0. 15微摩尔的硼酸、0. 05微摩尔的硫酸铜、0. 05微摩尔的硫酸锰、0. 05微摩尔的钥酸钠、0. 05微摩尔的硫酸锌、蔗糖10克、蛋白胨10克、咖啡碱7. 5毫摩尔用水定容至I升，然后用质量浓度为4%的氢氧化钠调节PH至7. 0，于121°C灭菌20min，得扩繁液体培养基。实施例3、一种含咖啡碱废水的无害化处理方法(即咖啡碱分解菌(恶臭假单胞菌)处理含咖啡碱废水)常规的茶多酚生产和精制过程产生的废水常规活性污泥法处理按照《多相催化氧化与周期循环活性污泥法(CASS)组合エ艺处理茶多酚精制生产废水》(张波，肖乾芬，夏四清.净水技术，2011，30 (2) 33-36)进行。将扩繁后的细菌菌液(实施例2所得物)在2000-2500转/分钟条件下离心15 分钟，收集细菌沉淀，作为恶臭假单胞菌(鲜重)。将0. I千克恶臭假单胞菌(鲜重)接种于体积为10吨的需氧曝气池(罐)中，通入厌氧发酵后的废水后，进行常规曝气适应定植 3天，即当恶臭假单胞菌接入后，对废水进行常规的曝气增氧发酵3天，常温即可，以利该菌定植于污泥中。之后再次处理废水时，可按照常规的污水需氧处理方法进行含咖啡碱废水的无害化处理，即，废水在需氧曝气池(罐)中的处理时间为48 160小时，处理温度控制在15-30 0C o具体如下当事先检测到厌氧发酵后的废水中的咖啡碱浓度低于500毫克/升时，在需氧曝气池(罐)中的处理时间为48小吋，处理后的废水经检测咖啡碱浓度< I毫克/升，即，每天可将5吨废水中咖啡碱彻底降解；当事先检测到厌氧发酵后的废水中的咖啡碱浓度为500-1500毫克/升时，在需氧曝气池(罐)中的处理时间为96小时，处理后的废水经检测咖啡碱浓度< I毫克/升，SP， 每天可将2. 5吨废水中咖啡碱彻底降解；当事先检测到厌氧发酵后的废水中的咖啡碱浓度超过1500毫克/升时，在需氧曝气池(罐)中的处理时间为96 160小时，处理后的废水经检测咖啡碱浓度彡I毫克/升， 即，每天可将I. 5-2. 5吨废水中咖啡碱彻底降解。实施例4、一种含咖啡碱废水的无害化处理方法(即咖啡碱分解菌处理含咖啡碱废水)将扩繁后的细菌菌液(实施例2所得物)在3000-3500转/分钟条件下离心12 分钟，收集细菌沉淀，作为恶臭假单胞菌(鲜重)。将0. 5千克恶臭假单胞菌(鲜重)接种于体积为50吨的需氧曝气池(罐)中，通入厌氧发酵后的废水后，进行常规曝气适应定植 4天，即当恶臭假单胞菌接入后，对废水进行常规的曝气增氧发酵4天，常温即可，以利该菌定植于污泥中。之后再次处理废水时，可按照常规的污水需氧处理方法进行含咖啡碱废水的无害化处理，即，废水在需氧曝气池(罐)中的处理时间为48 160小时，处理温度控制在15-30 0C o具体如下当事先检测到厌氧发酵后的废水中的咖啡碱浓度低于500毫克/升时，在需氧曝气池(罐)中的处理时间为48小吋，处理后的废水经检测咖啡碱浓度< I毫克/升，即，每天可将25吨废水中咖啡碱彻底降解；当事先检测到厌氧发酵后的废水中的咖啡碱浓度为500-1500毫克/升时，在需氧曝气池(罐)中的处理时间为96小时，处理后的废水经检测咖啡碱浓度< I毫克/升，SP， 每天可将12. 5吨废水中咖啡碱彻底降解；当事先检测到厌氧发酵后的废水中的咖啡碱浓度超过1500毫克/升时，在需氧曝气池(罐)中的处理时间为96 160小时，处理后的废水经检测咖啡碱浓度彡I毫克/升， 即，每天可将7. 5-12. 5吨废水中咖啡碱彻底降解。实施例5、一种含咖啡碱废水的无害化处理方法(即咖啡碱分解菌处理含咖啡碱废水)将扩繁后的细菌菌液(实施例2所得物)在4500-5000转/分钟条件下离心10 分钟，收集细菌沉淀，作为恶臭假单胞菌(鲜重)。将I千克恶臭假单胞菌(鲜重)接种于体积为100吨的需氧曝气池(罐)中，通入厌氧发酵后的废水后，进行常规曝气适应定植5 天，即当恶臭假单胞菌接入后，对废水进行常规的曝气增氧发酵5天，常温即可，以利该菌定植于污泥中。之后再次处理废水时，可按照常规的污水需氧处理方法进行含咖啡碱废水的无害化处理，即，废水在需氧曝气池(罐)中的处理时间为48 160小时，处理温度控制在15-30 0C o具体如下当事先检测到厌氧发酵后的废水中的咖啡碱浓度低于500毫克/升时，在需氧曝气池(罐)中的处理时间为48小吋，处理后的废水经检测咖啡碱浓度< I毫克/升，即，每天可将50吨废水中咖啡碱彻底降解；当事先检测到厌氧发酵后的废水中的咖啡碱浓度为500-1500毫克/升时，在需氧曝气池(罐)中的处理时间为96小时，处理后的废水经检测咖啡碱浓度< I毫克/升，SP， 每天可将25吨废水中咖啡碱彻底降解；当事先检测到厌氧发酵后的废水中的咖啡碱浓度超过1500毫克/升时，在需氧曝气池(罐)中的处理时间为96 160小时，处理后的废水经检测咖啡碱浓度彡I毫克/升， 即，每天可将15-25吨废水中咖啡碱彻底降解。注上述废水中咖啡碱浓度的检测方法依据GB/T 8312—2002进行。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.ー种恶臭假单胞菌，其特征是保藏名称为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) CT2025，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期2012年02月17日，保藏号CGMCC NO. 5767。
2.如权利要求I所述的恶臭假单胞菌的扩繁法，其特征是将恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida)CGMCC NO. 5767 接种于扩繁液体培养基中，于 28 30°C、130 150 转/分钟条件下扩繁培养，当所得扩繁产物的在600纳米处的吸光度> 4吋，停止扩繁培养。
3.根据权利要求2所述的恶臭假单胞菌的扩繁法，其特征是所述扩繁液体培养基为每升扩繁液体培养基中含有5. 0毫摩尔的氯化钾、I. 5毫摩尔的硫酸亚铁、I. 5毫摩尔的硫酸镁、0. 4毫摩尔的氯化钙、0. 3毫摩尔的磷酸氢ニ钠、0. 15微摩尔的硼酸、0. 05微摩尔的硫酸铜、0. 05微摩尔的硫酸锰、0. 05微摩尔的钥酸钠、0. 05微摩尔的硫酸锌、蔗糖10克、蛋白胨10克、咖啡碱2. 5 7. 5毫摩尔，其余为水；调节pH7. 0后， 高温灭菌。
4.一种含咖啡碱废水的无害化处理方法，其特征是在每100吨的含咖啡碱废水中接种入0. 8 I. 2kg的恶臭假单胞菌，在以下任意ー个废水处理的阶段介入应用在厌氧发酵之后的需氧处理阶段应用，在废水需氧处理结束后应用；所述恶臭假单胞菌为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) CGMCC NO. 5767。
全文摘要
本发明公开了一种恶臭假单胞菌，保藏名称为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)CT2025，保藏日期2012年02月17日，保藏号CGMCC NO.5767。本发明还同时公开了一种含咖啡碱废水的无害化处理方法在每100吨的含咖啡碱废水中接种入0.8～1.2kg的恶臭假单胞菌，在以下任意一个废水处理的阶段介入应用在厌氧发酵之后的需氧处理阶段应用，在废水需氧处理结束后应用。
文档编号C02F3/34GK102604865SQ20121006757
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月14日 优先权日2012年3月14日
发明者梁月荣, 甘泉, 范方媛, 董占波, 郑新强, 陆建良 申请人:浙江大学