专利名称：一种降解煤化工废水中苯酚的方法
技术领域：
本发明涉及一种降解煤化工废水中苯酚的方法，尤其是涉及一种利用驯化后的枯草芽孢杆菌降解煤化工废水中苯酚的方法。
背景技术：
在全球对替代化工原料和替能源的需求越发迫切的背景下，中国的煤化工行业以其领先的产业化进度成为中国能源结构的重要组成部分，国家对于煤化工企业也给予了越来越多的重视。目前，甲醇、二甲醚、丙烯等是煤化工产业链中主要的化学品。然而，在煤制甲醇、煤制二甲醚、煤制烯烃等过程产排的废水中，因含有苯酚的存在，极大地影响了煤化工废水的处理处置效果。酚类化合物是一种原型质毒物，对生物个体具有毒害作用。它通过皮肤及粘膜的接触而吸入或经口腔浸入生物体内，与细胞内原浆中的蛋白质接触后，形成不溶性蛋白质而使细胞失去活性，尤其对神经系统有较大的亲和力，使神经系统发生病变。目前国内外处理含酚废水的常用方法主要有物理法、化学法和生物法。当废水中的苯酚含量在5 500mg/L时，适于用生物法处理。研究表明，酵母菌、根瘤菌、醋酸钙不动杆菌、假单胞菌、真养产碱菌和反硝化菌对废水中苯酚有一定的降解效果。本方法利用驯化后的枯草芽孢杆菌降解处理煤化工废水中的苯酚，具有经济、高效的优点，更重要的是枯草芽孢杆菌为非致病菌，所以可达到无害化、无二次污染降解煤化工废水中苯酚的效果。目前还没有一种利用驯化后的枯草芽孢杆菌降解煤化工废水中苯酚的方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种投入低、操作简单的方法、且对环境不会造成二次污染的降解煤化工废水中苯酚的方法。本发明通过如下方式实现
一种降解煤化工废水中苯酚的方法，其特征在于该方法包括如下步骤
a.种子制备从枯草芽孢杆菌保存管中挑取一环接入富集培养基中，菌株经活化和扩大培养后，按质量百分比为广5%的接种量接种于富集培养基中，在温度为2(T40°C下好氧培养24 72h，可得用于驯化的降解菌；
b.降解菌的驯化取上述步骤a制得的种子按质量百分比广5%的接种量接入含 100mg/L苯酚的基础选择培养基中，在温度为2(T40°C，搅拌速率为10(Tl30r/min下好氧培养24 72h后，取培养后的培养液按质量百分比f 5%的接种量再接种于含200mg/L苯酚的基础选择培养基中，与上述相同条件下培养24 72h，以此类推，即取前一步骤培养后的培养液按质量百分比广5%的接种量接种于苯酚含量比前一步骤高100mg/L的基础选择培养基中，与上述相同条件下培养24 72h，最后一次是取前一步骤接种培养后的培养液，按质量百分比广5%的接种量接种于含1000mg/L苯酚的基础选择培养基中，与上述相同条件下培养c.单菌落的分离选择上述步骤b浊度最大的培养液，稀释后涂布于含300mg/L苯酚的基础选择固体培养基琼脂平板，在温度为2(T40°C下培养24 72h，长出的单菌落在平板上划线纯化2次，得到形态不同的单菌落菌株；
d.降解苯酚种子扩大培养取上述步骤c制得的不同形态单菌落菌株，分别接入到含 300mg/L苯酚的富集培养基中，在温度为2(T40°C，搅拌速率为10(Tl30r/min下好氧培养 24 72h，可得用于降解苯酚的种子；
e.苯酚降解菌的选择将上述步骤d制得的降解苯酚的种子，按质量百分比广5%的接种量分别接入添加O、100、200、……、900、1000mg/L苯酚的煤化工废水中，在温度为 2(T40°C，搅拌速率10(Tl30r/min下好氧培养24 72h后对苯酚浓度进行测定，选出使含量为O 200mg/L煤化工废水中的苯酹能完全降解的菌株；
f.将上述步骤e选出的苯酚降解菌，接入富集培养基经扩大培养后，按质量百分比 Γ5%的接种量接入煤化工废水中，在温度为2(T40°C，搅拌速率10(Tl30r/min下好氧培养 24 72h，即可降解煤化工废水中的苯酚；
所述富集培养基，基础选择培养基，基础选择固体培养基制备方法分别是
O富集培养基的制备将下述重量的原料混合而成即可制得富集培养基蛋白胨 5. 0g，牛肉浸出汁 3. 0g, NaCl 5. 0g, MnSO4 · H2O O. OlgjjC IOOOmL ；
2)基础选择培养基的制备将下述重量的原料混合而成即可制得基础选择培养基 K2HPO4 O. 5g, KH2PO4 O. 5g, NaCl O. 2g, NH4NO3 I. 0g, MgSO4 O. 2g, CaCl2 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. Olg,水 10OOmT,；
3)基础选择固体培养基的制备将下述重量的原料混合而成即可制得基础选择培养基=K2HPO4 0. 5g, KH2PO4 0. 5g, NaCl 0. 2g, NH4NO3 I. 0g, MgSO4 0. 2g, CaCl2 0. 2g, MnSO4 · H2O O.Olg，琼脂 20g，水 IOOOmL ；
所述步骤b的含100、200、……、900、1000mg/L苯酚的基础选择培养基是由基础选择培养基IOOOmL分别和100,200, ......、900、IOOOmg苯酚混合而成；
所述步骤c的含300mg/L苯酚的基础选择固体培养基是由基础选择培养基lOOOmL、苯酚300mg和琼脂20g混合而成；
所述步骤d的含300mg/L苯酚的富集培养基是由富集培养基IOOOmL和苯酚300mg混合而成；
所述步骤e的含0、100、200、……、900、1000mg/L苯酚的煤化工废水的制备是按照每 IOOOmL煤化工废水中分别加入0、100、200、……、900、IOOOmg苯酚混合而成；
所述煤化工废水是源自煤制甲醇、煤制二甲醚、煤制烯烃过程产生的废水，其苯酚含量为 20 160mg/L。本发明有如下效果
I)降解工艺独特本发明提供的一种降解煤化工废水中苯酚的方法，包括种子制备、降解菌驯化、降解菌选择，然后将选出的苯酚降解菌，经扩大培养后，按一定比例接入煤化工废水中，在温度为2(T40°C，搅拌速率10(Tl30r/min下好氧培养24 72h，即可降解煤化工废水中的苯酚。2 )完全降解了煤化工废水中的苯酚由于煤制甲醇、煤制二甲醚、煤制烯烃过程产生的废水，其苯酚含量在2(Tl60mg/L之间。所以，利用本发明提供的方法，可以完全降解煤制甲醇、煤制二甲醚、煤制烯烃过程产生废水中的苯酚。3)对环境无害本发明所使用的枯草芽孢杆菌为非致病菌，不同于其它微生物，而且能将煤化工废水中的苯酚最终转化为二氧化碳和水，不会对环境造成二次污染。
具体实施例方式实施例I :
一种降解煤化工废水中苯酚的方法，该方法包括如下步骤
a.种子制备从枯草芽孢杆菌保存管中挑取一环，接入富集培养基中，菌株经活化和扩大培养后，按质量百分比为5%的接种量接种于富集培养基中，在温度为40°C下好氧培养 24h，可得用于驯化的降解菌；
b.降解菌的驯化取上述步骤a制得的种子按质量百分比5%的接种量接入含IOOmg/ L苯酚的基础选择培养基中，在温度为40°C，搅拌速率为130r/min下好氧培养24h后，取培养后的培养液按质量百分比5%的接种量再接种于含200mg/L苯酚的基础选择培养基中， 与上述相同条件下培养24h，以此类推，即取前一步骤培养后的培养液按质量百分比5%的接种量接种于苯酚含量比前一步骤高100mg/L的基础选择培养基中，与上述相同条件下培养24h，最后一次是取前一步骤接种培养后的培养液，按质量百分比5%的接种量接种于含 1000mg/L苯酹的基础选择培养基中，与上述相同条件下培养24h ；
c.单菌落的分离选择上述步骤b浊度最大的培养液，稀释后涂布于含300mg/L苯酚的基础选择固体培养基琼脂平板，在温度为40°C下培养24h，长出的单菌落在平板上划线纯化2次，得到形态不同的单菌落菌株；
d.降解苯酚种子扩大培养取上述步骤c制得的不同形态单菌落菌株，分别接入到含 300mg/L苯酚的富集培养基，在温度为40°C，搅拌速率为130r/min下好氧培养24h，可得用于降解苯酚的种子；
e.苯酚降解菌的选择将上述步骤d制得的降解苯酚的种子，按质量百分比5%的接种量分别接入添加O、100、200、……、900、1000mg/L苯酚的煤化工废水中，在温度为40°C，搅拌速率130r/min下好氧培养24h后对苯酚浓度进行测定，选出使含量为O 200mg/L煤化工废水中的苯酹能完全降解的菌株；
f.将上述步骤e选出的苯酚降解菌，接入富集培养基经扩大培养后，按质量百分比5% 的接种量接入煤化工废水中，在温度为40°C，搅拌速率130r/min下好氧培养24h，即可降解煤化工废水中的苯酚。煤化工废水取自煤制甲醇过程生产的废水，用上述方法处理后，经4-氨基安替吡啉分光光度法测定，废水中未检测到苯酚的存在。实施例2:
a.种子制备从枯草芽孢杆菌保存管中挑取一环接入富集培养基中，菌株经活化和扩大培养后，按质量百分比为3%的接种量接种于富集培养基，在温度为30°C下好氧培养48h， 可得用于驯化的降解菌；
b.降解菌的驯化取上述步骤a制得的种子按质量百分比3%的接种量接入含IOOmg/ L苯酚的基础选择培养基中，在温度为30°C，搅拌速率为115r/min下好氧培养48h后，取培养后的培养液按质量百分比3%的接种量再接种于含200mg/L苯酚的基础选择培养基中，与上述相同条件下培养48h，以此类推，即取前一步骤培养后的培养液按质量百分比3%的接种量接种于苯酚含量比前一步骤高100mg/L的基础选择培养基中，与上述相同条件下培养48h。最后一次是取前一步骤接种培养后的培养液，按质量百分比3%的接种量接种于含 1000mg/L苯酹的基础选择培养基中，与上述相同条件下培养48h ；
c.单菌落的分离选择上述步骤b浊度最大的培养液，稀释后涂布于含300mg/L苯酚的基础选择固体培养基琼脂平板，在温度为30°C下培养48h，长出的单菌落在平板上划线纯化2次，得到形态不同的单菌落菌株；
d.降解苯酚种子扩大培养取上述步骤c制得的不同形态单菌落菌株，分别接入到含 300mg/L苯酚的富集培养基，在温度为30°C，搅拌速率为115r/min下好氧培养48h，可得用于降解苯酚的种子；
e.苯酚降解菌的选择将上述步骤d制得的降解苯酚的种子，按质量百分比3%的接种量分别接入添加0、100、200、……、900、1000mg/L苯酚的煤化工废水中，在温度为30°C，搅拌速率115r/min下好氧培养48h后对苯酚浓度进行测定，选出使含量为O 200mg/L煤化工废水中的苯酹能完全降解的菌株；
f.将上述步骤e选出的苯酚降解菌，接入富集培养基经扩大培养后，按质量百分比3% 的接种量接入煤化工废水中，在温度为30°C，搅拌速率115r/min下好氧培养48h，即可降解煤化工废水中的苯酚。煤化工废水取自煤制二甲醚过程生产的废水，用上述方法处理后，经4-氨基安替吡啉分光光度法测定，废水中未检测到苯酚的存在。实施例3
a.种子制备从枯草芽孢杆菌保存管中挑取一环接入富集培养基中，菌株经活化和扩大培养后，按质量百分比为1%的接种量接种于富集培养基，在温度为20°C下好氧培养72h， 可得用于驯化的降解菌；
b.降解菌的驯化取上述步骤a制得的种子按质量百分比1%的接种量接入含IOOmg/ L苯酚的基础选择培养基中，在温度为20°C，搅拌速率为100r/min下好氧培养72h后，取培养后的培养液按质量百分比1%的接种量再接种于含200mg/L苯酚的基础选择培养基中， 与上述相同条件下培养72h，以此类推，即取前一步骤培养后的培养液按质量百分比1%的接种量接种于苯酚含量比前一步骤高100mg/L的基础选择培养基中，与上述相同条件下培养72h。最后一次是取前一步骤接种培养后的培养液，按质量百分比1%的接种量接种于含 1000mg/L苯酚的基础选择培养基中，与上述相同条件下培养72h ；
c.单菌落的分离选择上述步骤b浊度最大的培养液，稀释后涂布于含300mg/L苯酚的基础选择固体培养基琼脂平板，在温度为20°C下培养72h，长出的单菌落在平板上划线纯化2次，得到形态不同的单菌落菌株；
d.降解苯酚种子扩大培养取上述步骤c制得的不同形态单菌落菌株，分别接入到含 300mg/L苯酚的富集培养基，在温度为20°C，搅拌速率为100r/min下好氧培养72h，可得用于降解苯酚的种子；
e.苯酚降解菌的选择将上述步骤d制得的降解苯酚的种子，按质量百分比1%的接种量分别接入添加0、100、200、……、900、1000mg/L苯酚的煤化工废水中，在温度为20°C，搅拌速率100r/min下好氧培养72h后对苯酚浓度进行测定，选出使含量为O 200mg/L煤化工废水中的苯酹能完全降解的菌株；
f.将上述步骤e选出的苯酚降解菌，接入富集培养基经扩大培养后，按质量百分比1% 的接种量接入煤化工废水中，在温度为20°C，搅拌速率lOOr/min下好氧培养72h，即可降解煤化工废水中的苯酚。煤化工废水取自煤制烯烃过程生产的废水，用上述方法处理后，经4-氨基安替吡啉分光光度法测定，废水中未检测到苯酚的存在。上述富集培养基，基础选择培养基，基础选择固体培养基，含100、200、……、900、 1000mg/L苯酹的基础选择培养基,含300mg/L苯酹的基础选择固体培养基,含300mg/L苯酹的富集培养基，含0、100、200、……、900、1000mg/L苯酚的煤化工废水制备方法分别是
O富集培养基的制备将下述重量的原料混合而成即可制得富集培养基蛋白胨 5. Og，牛肉浸出汁 3. Og，NaCl 5. 0g, MnSO4 · H2O 0. 01g，水 IOOOmL ;
2)基础选择培养基的制备将下述重量的原料混合而成即可制得基础选择培养基 K2HPO4 0. 5g, KH2PO4 0. 5g, NaCl 0. 2g, NH4NO3 I. 0g, MgSO4 0. 2g, CaCl2 0. 2g, MnSO4 · H2O 0. Olg,水 10OOmT,；
3)基础选择固体培养基的制备将下述重量的原料混合而成即可制得基础选择培养基=K2HPO4 0. 5g, KH2PO4 0. 5g, NaCl 0. 2g, NH4NO3 I. 0g, MgSO4 0. 2g, CaCl2 0. 2g, MnSO4 · H2O
O.Olg，琼脂 20g，水 IOOOmL ；
上述含100、200、……、900、1000mg/L苯酚的基础选择培养基制备上述步骤b制备的
基础选择培养基IOOOmL分别和100、200、......、900、1000mg苯酚混合而成；
上述含300mg/L苯酚的基础选择固体培养基制备上述步骤b制备的基础选择培养基 IOOOmL和苯酚300mg、琼脂20g混合而成；
上述含300mg/L苯酚的富集培养基制备上述步骤a制备的富集培养基IOOOmL和苯酚 300mg混合而成；
上述含0、100、200、……、900、1000mg/L苯酚的煤化工废水制备是按照每IOOOmL煤化工废水中分别加入O、100、200、……、900、IOOOmg苯酚混合而成。本方法所述的菌株为枯草芽孢杆菌Subtilis (CGMCC I. 2172)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本方法所述的利用驯化后的枯草芽孢杆菌处理前后煤化工废水中苯酚浓度测定采用4-氨基安替吡啉分光光度法，具体步骤是取处理前后废水5mL，置于IOmL离心管中， 在10000r/min，4°C下离心5min。然后以4-氨基安替吡啉为指示剂，在紫外可见分光光度仪上测定吸光度值的变化，依据苯酚标准浓度-吸光度曲线，获得废水中苯酚的浓度。
权利要求
1.一种降解煤化工废水中苯酚的方法，其特征在于该方法包括如下步骤a.种子制备从枯草芽孢杆菌保存管中挑取一环接入富集培养基中，菌株经活化和扩大培养后，按质量百分比为广5%的接种量接种于富集培养基中，在温度为2(T40°C下好氧培养24 72h，可得用于驯化的降解菌；b.降解菌的驯化取上述步骤a制得的种子按质量百分比f5%的接种量接入含 100mg/L苯酚的基础选择培养基中，在温度为2(T40°C，搅拌速率为10(Tl30r/min下好氧培养24 72h后，取培养后的培养液按质量百分比f 5%的接种量再接种于含200mg/L苯酚的基础选择培养基中，与上述相同条件下培养24 72h，以此类推，即取前一步骤培养后的培养液按质量百分比广5%的接种量接种于苯酚含量比前一步骤高100mg/L的基础选择培养基中，与上述相同条件下培养24 72h，最后一次是取前一步骤接种培养后的培养液，按质量百分比f 5%的接种量接种于含1000mg/L苯酚的基础选择培养基中，与上述相同条件下培养 24"72h ；c.单菌落的分离选择上述步骤b浊度最大的培养液，稀释后涂布于含300mg/L苯酚的基础选择固体培养基琼脂平板，在温度为2(T40°C下培养24 72h，长出的单菌落在平板上划线纯化2次，得到形态不同的单菌落菌株；d.降解苯酚种子扩大培养取上述步骤c制得的不同形态单菌落菌株，分别接入到含 300mg/L苯酚的富集培养基中，在温度为2(T40°C，搅拌速率为10(Tl30r/min下好氧培养 24 72h，可得用于降解苯酚的种子；e.苯酚降解菌的选择将上述步骤d制得的降解苯酚的种子，按质量百分比广5%的接种量分别接入添加0、100、200、……、900、1000mg/L苯酚的煤化工废水中，在温度为 2(T40°C，搅拌速率10(Tl30r/min下好氧培养24 72h后对苯酚浓度进行测定，选出使含量为O 200mg/L煤化工废水中的苯酹能完全降解的菌株；f.将上述步骤e选出的苯酚降解菌，接入富集培养基经扩大培养后，按质量百分比 Γ5%的接种量接入煤化工废水中，在温度为2(T40°C，搅拌速率10(Tl30r/min下好氧培养 24 72h，即可降解煤化工废水中的苯酚。
2.如权利要求I所述的一种降解煤化工废水中苯酚的方法，其特征在于所述富集培养基，基础选择培养基，基础选择固体培养基制备方法分别是O富集培养基的制备将下述重量的原料混合而成即可制得富集培养基蛋白胨 5. 0g，牛肉浸出汁 3. 0g，NaCl 5. 0g, MnSO4 · H2O O. Olg，水 IOOOmL ;2)基础选择培养基的制备将下述重量的原料混合而成即可制得基础选择培养基 K2HPO4 0. 5g, KH2PO4 0. 5g, NaCl 0. 2g, NH4NO3 I. 0g, MgSO4 0. 2g, CaCl2 0. 2g, MnSO4 · H2O0.Olg,水 10OOmT,；3)基础选择固体培养基的制备将下述重量的原料混合而成即可制得基础选择培养基=K2HPO4 0. 5g, KH2PO4 0. 5g, NaCl 0. 2g, NH4NO3 I. 0g, MgSO4 0. 2g, CaCl2 0. 2g, MnSO4 · H2O O.Olg，琼脂 20g，水 IOOOmL ；如权利要求I所述的一种降解煤化工废水中苯酚的方法，其特征在于所述步骤b的含 100、200、……、900、1000mg/L苯酚的基础选择培养基是由基础选择培养基IOOOmL分别和 100、200、......、900、1000mg 苯酚混合而成。
3.如权利要求I所述的一种降解煤化工废水中苯酚的方法，其特征在于所述步骤c的含300mg/L苯酚的基础选择固体培养基是由基础选择培养基lOOOmL、苯酚300mg和琼脂 20g混合而成。
4.如权利要求I所述的一种降解煤化工废水中苯酚的方法，其特征在于所述步骤d 的含300mg/L苯酚的富集培养基是由富集培养基IOOOmL和苯酚300mg混合而成。
5.如权利要求I所述的一种降解煤化工废水中苯酚的方法，其特征在于所述步骤e 的含0、100、200、……、900、1000mg/L苯酚的煤化工废水的制备是按照每IOOOmL煤化工废水中分别加入O、100、200、……、900、IOOOmg苯酚混合而成。
6.如权利要求I所述的一种降解煤化工废水中苯酚的方法，其特征在于所述煤化工废水是源自煤制甲醇、煤制二甲醚、煤制烯烃过程产生的废水，其苯酚含量为2(Tl60mg/L。
全文摘要
本发明涉及一种降解煤化工废水中苯酚的方法，尤其是涉及一种利用驯化后的枯草芽孢杆菌降解煤化工废水中苯酚的方法，其特征在于该方法包括如下步骤a.种子制备、b.降解菌的驯化、c.单菌落的分离、d.降解苯酚种子扩大培养、e.苯酚降解菌的选择、f.将上述步骤e选出的苯酚降解菌，经扩大培养后，按1~5%的接种量接入煤化工废水中，在温度为20~40℃，搅拌速率100~130r/min下好氧培养24~72h，即可降解煤化工废水中的苯酚；与现有技术相比，本方法能够完全降解煤制甲醇、煤制二甲醚、煤制烯烃过程所产生的废水中的苯酚，同时不会对环境造成二次污染，且工艺独特。
文档编号C02F3/34GK102583782SQ201210083400
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月27日 优先权日2012年3月27日
发明者任佳, 刘海艳, 马玉龙 申请人:宁夏大学