专利名称：蜡状芽孢杆菌ds1在降解皂素废水有机污染物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域,尤其涉及一种腊状芽孢杆菌(feci77w5· (Sferew1S)DSl在降解皂素废水有机污染物中的应用。
背景技术：
皂素(如薯蓣皂素)生产废水具有废水量小、色度大、有机物浓度高、酸度大、温度高等特点，可生化性差，是一种非常难处理的废水。根据《皂素工业水污染物排放标准》(GB20425-2006)中具体规定，自2009年起COD排放量应低于300mg/L。目前皂素水解原液COD浓度达到左右20000-40000mg/L，综合废水COD浓度约为4000-12000mg/L。若直接排入水体，会导致水体的有机污染物浓度大幅度增 力口，由此引起江河湖泊严重污染，不仅直接影响了人们的生存环境，也造成了国民经济的巨大损失。皂素废水中含有大量有机污染物，其中部分毒性醛、酮、酚类物质对污水处理系统里污泥中的微生物具有抑制作用，一般微生物不能正常生长。同时，皂素废水中硫酸根浓度高，约为8000mg/L左右，在高盐度废水的生物处理系统中，由于盐度的变化往往会破坏微生物的细胞膜和菌体内的酶，致使污泥活性下降。同时，微生物对环境具有一定的适应能力，在一定盐度范围内微生物通过自身的渗透调节机制平衡细胞内的渗透压或保护细胞内的原生质，调节自身新陈代谢以适用盐度的变化。活性污泥在含盐环境中经过一段时间驯化后，将具有一定的耐盐性。目前对皂素废水的处理多采用物理或化学的方法，现有技术中还没有微生物降解方法和用于降解皂素废水有机污染物的菌株的报导。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种蜡状芽孢杆菌DSl在降解皂素废水有机污染物中的应用。本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为
蜡状芽孢杆菌DSl在降解皂素废水有机污染物中的应用。上述方案中，挑取活化后的蜡状芽孢杆菌DSl单菌落，于LB液体培养基中培养过夜，按培养后的蜡状芽孢杆菌DSl :皂素废水的体积比为O. 5-2 :100接种，30-35°C、pH值为6-8的条件下恒温培养，反应48-72小时。上述方案中，所述蜡状芽孢杆菌DSl保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010145。与现有技术相比，本发明取得的有益效果是蜡状芽孢杆菌DSl在高浓度硫酸根离子环境中具有较强的生长能力和良好的去除皂素废水中有机污染物的能力，该菌株能在72小时之内去除皂素废水中的COD 2550mg/L，去除效率达到60. 14%。本发明为降解皂素废水高浓度有机污染物提供了有用的菌源，拓宽了对蜡状芽孢杆菌功能方面的应用，具有较强的应用价值。
图1为蜡状芽孢杆菌DSl的PCR产物琼脂糖电泳图(左为Marker ;右为扩增产物)。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述，当然下述实施例不应理解为对本发明的限制。一、蜡状芽孢杆菌DSl的筛选·
(一)、材料准备1、实验废水和池底污泥取自湖北省十堰市某黄姜皂素生产厂生产排放废水的生化处理系统。2、培养基
筛选培养基3g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨，5g/L氯化钠，20g/L琼脂，pH6. 8。富集培养基(g/L) 30g/L磷酸氢二钾，100mg/L无水硫酸镁，10g/L磷酸二氢钾，10mg/L四水硫酸猛,5g/L硝酸铵，10mg/L七水硫酸亚铁，lg/L硫酸钠,5mg/L氯化|丐，冰箱保存。使用时，稀释10倍，加入10%葡萄糖，pH值7. O 7. 2。LB液体培养基蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化钠10. 0g/L，蒸馏水IOOOmL, ρΗ7· O。LB固体培养基蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化钠10.0g/L，蒸馏水IOOOmL,琼脂 15g/L (固)，ρΗ7· O。LB斜面培养基蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化钠10.0g/L，蒸馏水IOOOmL,琼脂 20g/L (固)，ρΗ7· O。3、实验仪器和设备
国华SHA-B恒温振荡器，
东器SPX生化培养箱，
立式压力蒸汽灭菌器，
光学显微镜-----Olympus有限公司，
pH 计等-----sarporiusPD-10,
超净工作台，
PTC200 型 PCR 仪，
电泳仪及电泳槽，
UVP凝胶紫外观测仪。(二 )、菌株的筛选分离与纯化1.筛选分离
1)称取2克黄姜皂素生产厂废水处理系统中酸化池尾区的池底污泥样品，加入事先灭菌好的装有IOOmL无菌水的250mL的三角瓶内，30°C恒温振荡200rpm，将菌胶团打碎，得泥水混合物，备用；
2)将泥水混合物转入装有IOOmL筛选培养基的500mL锥形瓶中，30°C恒温静置培养至培养基浑浊，得到菌悬液A ;
3)取5 mL菌悬液A于装100 mL新鲜的筛选培养基的250 mL锥形瓶中培养一周；将培养一周后的菌悬液取5 mL于装100 mL新鲜的筛选培养基的250 mL锥形瓶中培养一周，重复操作5-6次，最后得到的菌悬液B ；
2.用无菌移液管吸取O. 5mL上述菌悬液B，稀释涂布于固体培养基上。37°C左右恒温培养3d，挑取在菌落特征上有明显差异的单菌，在LB固体培养基上反复划线培养三次直至获得单一菌株，并于LB斜面培养基上保存，得到一株菌株DSl，即蜡状芽孢杆菌DSl。二、蜡状芽孢杆菌DSl的鉴定1、对蜡状芽孢杆菌DSl的鉴定
对蜡状芽孢杆菌DSl进行了生理生化的鉴定、16S rRNA分子的鉴定并结合Biolog微生物自动分析系统，从分子水平确定蜡状芽孢杆菌DSl的种属。 16S rRNA序列分析主要按照以下步骤
1)细菌核DNA的提取
使用北京百泰克生物技术有限公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒，
2)16S rRNA基因的PCR扩增，
PCR 扩增引物参照 Weisburg 等人(Weisburg W G, Barns S M, Pelletier D A. 16Sribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J]. J. Bacteriol, 1991,173: 697 - 703)的方法合成。P1:正向引物 5 ’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3 ’
P2 :反向引物 5’ GGTTACCTTGTTACGACTT3’
在50mL反应体积中，加入ImL模板DNA (0.1mg), 0. 5mL Pl和P2 (终浓度为0. 5mM),ImLdNTP (每种 ΝΤΡ0. 2 禮)，0. 5mLTaq 聚合酶(2 U)和 5 mL 10XPCR 缓冲液。PCR 扩增条件为:94°C预变性5 min ;在94°C变性30s，61_65°C退火30s，72°C延伸lmin，循环30次;最后72 ° C终延伸10 min。3) PCR产物的回收
将PCR产物以1%琼脂糖凝胶进行电泳后，在紫外灯下切取含欲回收片段的凝胶，放入1.5mL离心管中加2倍体积TE，65°C水浴10分钟后加等体积水饱和酚抽提一次离心后取上层水相再用酚-氯仿-异戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍体积的lOmol/L乙酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀，离心，用浓度为70%乙醇洗沉淀一次，风干后溶于适量灭菌双蒸水。4) 16S rDNA的全序列测定和分析
PCR测序用正反向引物参照Hiraishi等人(Hiraishi A, Shin Y K, Ueda Y.Automated Sequencing of PCR-amplified 16S rDNA on ‘Hydrolink’ Gels[J]. J.Microbiol. Methods, 1994, 19: 145 — 154)方法合成。P-f CACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC ；
P-r GGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。加入ImL模板DNA (〈0· lmg)，PCR扩增 30 个循环(94 °C I min, 55 °C 30s, 72 。C 2min)。采用ABI PRISM测序试剂盒中染料终止剂终止反应。然后,在Applied Biosystem373 A DNA测序仪上测序。测得的16S rDNA序列采用BLAST软件与GenBank数据库比较分析，最终从分子水平上确定该菌的种属。
2、16S rRNA 序列测定
本发明采用对16SrRNA序列测定和分析的方法对细菌进行分子水平的鉴定。以细菌的核DNA为模板，以16S rRNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，得到长度为1436bp的扩增带(用I %琼脂糖凝胶电泳检测)，如图1所示。PCR产物经纯化后，测定其全序列，其序列见SEQ ID NO:1。三、菌落形态特征以及生理生化特性
蜡状芽孢杆菌DSl的菌落形态为菌落呈白色、不透明、圆形、扁平、表面粗糙、边缘不整齐，培养时间长，菌落表面呈毛玻璃状，并产生红色色素；需氧，革兰氏阳性芽孢杆菌。最适生长pH值6. 5 7. 5，最适生长温度25-35 V。 四、蜡状芽孢杆菌DSl为新的菌株
采用BLAST分析法对菌株DSl的16S rRNA基因序列与GenBank数据库比较分析发现，菌株DSl与蜡状芽孢杆菌心Cereus)的同源性高达100. 0%。综合菌株的生理生化以及分子鉴定结果，菌株DSl命名为蜡状芽孢杆菌{Bacillus Cereus) 查阅有关资料，尚无蜡状芽孢杆菌属有关降解皂素废水能力研究的报道。腊状芽孢杆菌(ifeci77i/5· (Sferew1S)DSl为新的菌株，已于2010年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号CCTCC M 2010145。本发明从湖北省十堰市某黄姜皂素生产厂排放废水的生化处理系统污泥中筛选分离出这一株细菌，并发现其有较好降解黄姜皂素废水中有机污染物的功能。这拓宽了人们对蜡状芽孢杆菌iBacillus Cereus)在其功能方面的应用研究思路，并为降解高浓度有机污染物黄姜皂素废水及其他皂素废水提供了有用的菌源和技术，具有较强的实际应用价值。五、蜡状芽孢杆菌DSl的应用
挑取活化后的蜡状芽孢杆菌(Bacillus Cereus) DSl单菌落，于LB液体培养基中培养过夜，按培养后的腊状芽孢杆菌(Bacillus Cereus) DSl :阜素废水(即实验废水,取自湖北省十堰市某黄姜皂素生产厂排放废水的生化处理系统)的体积比为O. 5-2 :100接种，30-35°C恒温培养，pH值为6-8，反应48-72小时。在本实施例中，具体的应用方法为用接种环挑取单菌落DS1，于50mL LB液体培养基中30°C震荡培养过夜。取ImL此菌液接种于9mL皂素废水(脱酸水初始COD 4700 mg/L左右、pHl.28)中；另取一支装有9mL皂素废水的试管，加入ImL LB液体培养基作为空白对t匕。调节水样pH值约为7. 0，置于35°C、150rpm振荡培养3d，测定水样的COD值，从而计算得到菌株对废水的COD去除效率。该菌株能在72小时之内去除皂素废水中的COD 2550mg/L，去除效率达到60. 14%。需要说明的是，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求
1.蜡状芽孢杆菌DSl在降解皂素废水有机污染物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，挑取活化后的蜡状芽孢杆菌DSl单菌落，于 LB液体培养基中培养过夜，按培养后的蜡状芽孢杆菌DSl :皂素废水的体积比为O. 5-2 :100 接种，30-35°C、pH值为6-8的条件下恒温培养，反应48-72小时。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述蜡状芽孢杆菌DSl保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010145。
全文摘要
本发明提供一种蜡状芽孢杆菌DS1在降解皂素废水有机污染物中的应用。所述蜡状芽孢杆菌DS1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM2010145。该蜡状芽孢杆菌DS1在高浓度硫酸根离子环境中具有较强的生长能力和良好的去除皂素废水中有机污染物的能力，该菌株能在72小时之内去除皂素废水中的COD2550mg/L，去除效率达到60.14%。本发明为降解皂素废水高浓度有机污染物提供了有用的菌源，拓宽了对蜡状芽孢杆菌功能方面的应用，具有较强的应用价值。
文档编号C02F101/30GK103011423SQ20121053801
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月13日 优先权日2012年12月13日
发明者郑丹, 鲍建国 申请人:中国地质大学(武汉)