一株微小杆菌及其有效溶藻成分在控制蓝藻水华中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株微小杆菌及其有效溶藻成分3-苄-2,5-二酮哌嗪在控制蓝藻水华中的应用。从太湖水体中分离获得了一株具有显著溶藻活性的微小杆菌(Exiguobacterium?sp.)GLY-3109，保藏号为CGMCC?No.8980，并且从其代谢产物中分离纯化并鉴定出其有效溶藻成分3-苄-2,5-二酮哌嗪，该溶藻物质对铜绿微囊藻9110的半数致死量LD50为4.8μg/mL。可用于新型生物杀藻剂的研发和生产，最终应用于湖泊蓝藻水华的控制。
【专利说明】一株微小杆菌及其有效溶藻成分在控制蓝藻水华中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及环境微生物领域，特别涉及一株具有溶藻活性的微小杆菌(Exiguobacterium sp.) GLY-3109和分泌的有效溶藻成分3-节-2，5-二酮哌嗪及其在蓝藻水华控制中的应用。
【背景技术】
[0002]在海洋、湖泊和水库中，蓝藻可以形成水华和赤潮，从而影响和改变水的理化性质，并且能直接和间接引起食藻动物的大量死亡。特别是对于以湖泊水和水库水为水源的饮用水生产，藻类的危害更为严重。因此探索控制蓝藻生物量和抑制蓝藻水华发生的有效途径是非常必要的。
[0003]目前有一些水华治理方法，如物理法(机械除藻、电磁场除藻、超声除藻)，化学法(投入Cu2+杀藻)等。但这些方法或者成本很高难以推广，或者会对生态环境造成次生破坏，均不太理想。由于物理方法和化学方法存在上述缺陷，而生物方法因其环保、经济等潜在优点，受到越来越多的关注。针对蓝藻的溶藻细菌(algicidal bacteria)是一类可以直接(菌藻细胞接触)或者间接(分泌胞外物质)抑制灭杀蓝藻的细菌统称，它们是淡水生态环境系统的重要组成部分，对减少蓝藻的生物量，维持生态平衡具有重要作用。
[0004]因此，本领域的技术人员致力于筛选高效溶藻细菌或分离富集溶藻细菌代谢产生的高效溶藻活性物质，以开发微生物杀藻剂，用以安全和高效的控制蓝藻水华问题。
【发明内容】
[0005]鉴于现有技术中物理方法和化学方法处理成本太高或容易造成二次污染的缺陷，本发明所要解决的技术问题是寻找高效溶藻细菌及分离富集溶藻细菌代谢产生的高效溶藻活性物质，用以安全和高效的控制蓝藻水华问题。
[0006]为实现上述目的，本发明提供了一株具有溶藻活性的微小杆菌及其代谢产物在蓝藻水华控制中的应用。
[0007]本发明提供了一株具从太湖水体中分离获得的有溶藻活性的微小杆菌(Exiguobacterium sp.) GLY-3109,该菌的形态为杆状，1.1 ~1.2 μ mX 1.4 ~3.2 μ m,革兰氏阳性，以周生鞭毛运动。兼性厌氧。在营养琼脂上菌落平坦，淡橙色，色素不扩散。嗜碱，能在pH6.5~11.5生长。可以利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖和一些其他糖产酸，主要产物是乳酸、乙酸和甲酸。该菌株接触酶阳性，氧化酶阴性。可以还原硝酸盐，水解明胶、淀粉和酪素。最适生长温度37°C。经16srRNA基因序列分析和同源性比较，得知该菌株与GenBank中某微小杆菌菌株有99%的同源性，故鉴定为微小杆菌属细菌，命名微小杆菌GLY-3109菌株。
[0008]该菌种已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC N0.8980，保藏日期为2014年3月28日。保藏机构地址:北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，邮编:100101，电话:86-10-64807355。该菌种的16srRNA基因在GenBank中的登录号是KC688875。
[0009]进一步地，本发明提供了上述微小杆菌GLY-3109在控制蓝藻水华中的应用。
[0010]进一步地，本发明微小杆菌GLY-3109在控制蓝藻水华中的应用方式可以是通过其发酵产物，包括发酵液、发酵液浓缩物、发酵液粗提物或发酵液提取物。
[0011]微小杆菌GLY-3109发酵产物的制备步骤如下:
[0012]I)、发酵微小杆菌GLY-3109菌株，获得发酵液；
[0013]2)、用萃取剂萃取发酵液，获得萃取液；
[0014]3)、将萃取液蒸干，获得粗提物；
[0015]4)、将粗提物溶于水后过滤；
[0016]5)、将步骤4)过滤后的滤液进一步提纯得到多组分或单一组分的有效溶藻物质，即为发酵液提取物。
[0017]优选地，步骤I)中，发酵条件为，微小杆菌GLY-3109接种于pH7.0的灭菌牛肉膏蛋白胨培养基中，28°C、220rpm环境条件下发酵48h。
[0018]优选地，步骤2)中，萃取剂为乙酸乙酯，萃取体系中乙酸乙酯与发酵液的体积比为1:1，混合后，放入振荡器中振荡24h，分离出的上层乙酸乙酯溶液即微小杆菌GLY-3109发酵液的萃取液。
[0019]优选地,步骤3)中，过滤为使用0.22 μ m孔径滤膜过滤。
[0020] 优选地，步骤4)中，进一步提纯手段为柱层析，具体为:将滤液通过半制备柱，用HPLC进行初步纯化，得到溶藻成分；将得到的溶藻成分通过分析柱，用HPLC进行进一步纯化，得到具有溶藻活性的有效成分ES-1。
[0021 ] 微小杆菌GLY-3109的代谢产物中有效的溶藻成分的化学结构通过LC-MS和GC-MS分析获得。
[0022]有效溶藻成分ES-1的分子尚子峰为205.0970,样品分子量为204.0007,分子式为C11H12N2O2，可信度为99.15%;对ES-1进行GC-MS分析，与GC-MS数据库中3-苄-2，5- 二酮哌嗪的相似度(similarity index)为 936.958,大于 850。
[0023]进一步地，将样品ES-1的LC-MS和GC-MS结果进行综合分析，有效的溶藻成分ES-1是所述微小杆菌GLY-3109的代谢产物3-苄-2，5- 二酮哌嗪，其具有结构式(I)。
[0024]
【权利要求】
1.一株具有溶藻活性的微小杆菌(Exiguobacterium sp.) GLY-3109,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC N0.8980，保藏日期为2014年3月28臼。
2.如权利要求1所述的微小杆菌GLY-3109在控制蓝藻水华中的应用。
3.如权利要求1所述的微小杆菌GLY-3109的发酵产物在控制蓝藻水华中的应用。
4.具有结构式(I)所示结构的化合物在控制蓝藻水华中的应用。
5.一种溶藻菌剂，其特征在于，所述溶藻菌剂中包含权利要求1所述的微小杆菌(Exiguobacterium sp.)GLY-3109。
6.一种溶藻药剂，其特征在于，所述溶藻药剂中包含权利要求1所述的微小杆菌(Exiguobacterium sp.)GLY-3109的发酵产物,所述发酵产物为发酵液、发酵液浓缩物、发酵液粗提物或发酵液提取物。
7.一种控制蓝藻水华的方法，包括如下步骤: 1)、发酵权利要求1所述的微小杆菌GLY-3109，获得发酵液； 2)、用萃取剂萃取发酵液，获得萃取液； 3)、将萃取液蒸干，获得粗提物； 4)、将粗提物溶于水后过滤； 5)、将步骤4)过滤后的滤液进一步提纯得到多组分或单一组分的有效溶藻物质，即为发酵液提取物。
8.如权利要求7所述的方法，其中步骤I)中，发酵条件为，微小杆菌GLY-3109接种于PH7.0的灭菌牛肉膏蛋白胨培养基中，28°C、220rpm环境条件下发酵48h。
9.如权利要求7所述的方法，其中步骤2)中，萃取剂为乙酸乙酯，乙酸乙酯与发酵液的体积比为1:1。
10.如权利要求7所述的方法，其中步骤4)中，所述进一步提纯手段为:将滤液通过半制备柱，用HPLC进行初步纯化，得到溶藻成分；将得到的溶藻成分通过分析柱，用HPLC进行进一步纯化，得到单一组分的有效溶藻成分。
【文档编号】C02F1/50GK104130960SQ201410360194
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月25日 优先权日:2014年7月25日
【发明者】杨虹, 耿梦馨, 郭星亮 申请人:上海交通大学