本发明属于土壤修复技术领域，具体涉及用于低温土壤修复的微生物制剂及其制备方法和应用。
背景技术
随着城市化和工业化进程的加快，城市和工业区附近的土壤有机污染日益加剧，多环芳烃、农药、多氯联苯、邻苯二甲酸酯等有机污染物在工业区周围的土壤中超过国家标准多倍。目前中国土壤污染的总体形势相当严峻，已对生态环境、食品安全、百姓身体健康和农业可持续发展构成威胁。农药是人们主动投放于环境中数量最大、毒性最广的一类化学物质，农药进入土壤后，主要有吸附和降解两个去向，吸附是有机质或粘土矿物通过固定、络合等作用来完成的，由于农药状态发生变化，所以，在一定范围内可降低农药生态毒性，但这是被动过程，目前采用酶修复土壤农药污染研究很多，但是单纯的酶修复局限性很大，而且单纯的酶活性不稳定，容易失活。
据调查，该污染已经延续到了偏远寒冷地区，目前也有许多关于采用微生物菌剂进行土壤修复的报道，但是由于很多微生物不能耐受低温环境，或者是处理的效果单一，从而导致不能从根本上对土壤进行整体修复。
土壤多酚氧化酶主要来源于土壤微生物、植物根系分泌物及动植物残体分解释放的酶，它是一种复合型酶，可以有效修复土壤，但是也存在效果单一不稳定的问题，为了能够更加有效修复农药污染、有机物污染、氨氮污染低温地区土壤的问题，亟待出现能全面解决以上污染问题的方案。
技术实现要素：
发明目的：本发明的目的是提供一种能够有效降低低温土壤中氨氮含量，降解土壤中农药污染的复合微生物菌剂。该复合微生物菌剂能够结合固定化氧化还原酶与微生物菌剂综合处理低温土壤中的农药污染、氨氮污染等。
本发明的另一目的在于提供上述用于低温土壤修复的微生物制剂的制备方法和应用。
技术方案：本发明提供一种用于低温土壤修复的复合微生物菌剂，该复合微生物菌剂包括耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031菌剂、好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3菌剂和固定化氧化还原酶；所述固定化氧化还原酶由固定化棘根过氧化物酶和固定化土壤多酚氧化酶组成。
为了使该复合微生物菌剂高效降解、吸收土壤中的氨氮和农药等有机物，上述冷菌玫红假裸囊菌hd1031菌剂、好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3菌剂的重量比为0.5～2:1～3。
其中，上述固定化棘根过氧化物酶和固定化土壤多酚氧化酶的重量比为1：2～5。固定化棘根过氧化物酶是将介孔分子筛材料sba-15加入到棘根过氧化物酶中，在温度为5℃～20℃；ph为5.0；转速为150～220rpm；固定化时间为12～24h下进行固定化后获得。其中，上述棘根过氧化物酶的rz值为3.2，棘根过氧化物酶的酶浓度为20u/mg～30u/mg。
其中，上述固定化土壤多酚氧化酶是将介孔分子筛材料sba-15加入到土壤多酚氧化酶中，在温度为5℃～20℃；ph为7～10；转速为150～220rpm；固定化时间为12～24h下进行固定化后获得。
该土壤多酚氧化酶的浓度为20u/mg～30u/mg。
其中，上述复合微生物菌剂中，耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031菌剂的活菌含量为3×108～8×1010cfu/g，好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3菌剂的活菌含量为2×109～7×1010cfu/g。
一种制备所述的用于低温土壤修复的复合微生物菌剂的方法，该方法包括以下步骤：
1)将耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031菌剂和好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3菌剂按照0.5～2:1～3的质量比混合均匀得到复合菌剂；
2)向步骤1)制得的复合菌剂中加入所述固定化氧化还原酶，混合均匀，即得所述用于低温土壤修复的复合微生物菌剂。
其中，上述耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031菌剂的制备方法包括：将耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031培养到对数期，然后按培养基体积2％～5％的接种量将培养到对数期的菌种接种到培养基中，10～20℃下，摇床震荡150～170rpm，培养40～48小时，得到耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031的发酵液，向该发酵液中加入吸附剂，干燥，即得耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031菌剂；所述吸附剂为膨润土或活性炭一种或几种。
其中，上述培养基为小麦秸秆粉和红薯藤粉为碳源、硫酸铵和蛋白胨为氮源的培养基。
其中，上述好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3菌剂的制备方法包括：将好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3培养到对数期，然后按培养基体积2％～5％的接种量将培养到对数期的菌种接种到lb液体培养基中，12～20℃下，摇床震荡120～180rpm，培养24～48小时，加入吸附剂，干燥，制得好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3菌剂；所述吸附剂为膨润土或活性炭中的一种或几种。
本发明内容还包括上述的用于低温土壤修复的复合微生物菌剂在低温土壤修复中的应用。
有益效果：本的复合微生物菌剂能够结合固定化氧化还原酶与微生物菌剂综合处理低温土壤中的农药污染、氨氮污染等，特别是戊唑醇农药和有机磷农药的去除率均到达了86％以上，氨氮的去除率也到达了85％以上，远远高于现有技术和本发明的对比例中的去除率，因此本发明的用于低温处理的的复合微生物菌剂能够有效修复污染土壤，而且制备方法简单，适合大规模生产，为偏远低温地区带来了福利，解决了目前亟待解决的环境污染问题。
具体实施方式
本发明中耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031为中国科学院微生物研究所馈赠，反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3为吉林农业大学资源与环境学院馈赠。本发明中所有的试剂均为市面上购买获得。
实施例1
棘根过氧化物酶的固定化：将介孔分子筛材料sba-15加入到rz值为3.2的棘根过氧化物酶中，在温度为5℃；ph为5.0；转速为220rpm；固定化时间为12h下进行固定化后获得。
土壤多酚氧化酶的固定化：将介孔分子筛材料sba-15加入到土壤多酚氧化酶中，在温度为5℃；ph为7；转速为220rpm；固定化时间为12h下进行固定化后获得。
耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031菌剂的制备：将耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031培养到对数期，然后按培养基体积2％的接种量将培养到对数期的菌种接种到培养基中，该培养基为以小麦秸秆粉和红薯藤粉为碳源、硫酸铵和蛋白胨为氮源的培养基，10℃摇床震荡170rpm，培养24小时，得到耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031的发酵液，向该发酵液中加入膨润土，干燥，即得耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031菌剂。该耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031菌剂的活菌含量为3×108cfu/g。
好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3菌剂的制备：将好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3培养到对数期，然后按培养基体积2％的接种量将培养到对数期的菌种接种到lb液体培养基中，20℃下，摇床震荡120rpm，培养48小时，加入活性炭，干燥，制得好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3菌剂。好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3菌剂的活菌含量为2×109cfu/g。
用于低温土壤修复的复合微生物菌剂的制备：
1)将以上制备的耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031菌剂和好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3菌剂按照0.5:1的质量比混合均匀得到复合菌剂；
2)向制得的复合菌剂中加入以上制备的固定化棘根过氧化物酶和固定化土壤多酚氧化酶，混合均匀，其中，该棘根过氧化物酶的酶浓度为20u/mg，土壤多酚氧化酶的浓度为20u/mg，即得所述用于低温土壤修复的复合微生物菌剂。
实施例2
棘根过氧化物酶的固定化：将介孔分子筛材料sba-15加入到rz值为3.2棘根过氧化物酶中，在温度为20℃；ph为5.0；转速为150rpm；固定化时间为24h下进行固定化后获得。
土壤多酚氧化酶的固定化：将介孔分子筛材料sba-15加入到土壤多酚氧化酶中，在温度为20℃；ph为10；转速为150rpm；固定化时间为24h下进行固定化后获得。
耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031菌剂的制备：将耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031培养到对数期，然后按培养基体积5％的接种量将培养到对数期的菌种接种到培养基中，该培养基为以小麦秸秆粉和红薯藤粉为碳源、硫酸铵和蛋白胨为氮源的培养基，20℃摇床震荡150rpm，培养48小时，得到耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031的发酵液，向该发酵液中加入活性炭，干燥，即得耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031菌剂。该耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031菌剂的活菌含量为8×1010cfu/g。
好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3菌剂的制备：将好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3培养到对数期，然后按培养基体积5％的接种量将培养到对数期的菌种接种到lb液体培养基中，12℃，摇床震荡180rpm，培养24小时，加入膨润土，干燥，制得好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3菌剂。好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3菌剂的活菌含量为7×1010cfu/g。
用于低温土壤修复的复合微生物菌剂的制备：
1)将以上制备的耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031菌剂和好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3菌剂按照2:3的质量比混合均匀得到复合菌剂；
2)向制得的复合菌剂中加入以上制备的固定化棘根过氧化物酶和固定化土壤多酚氧化酶，混合均匀，其中，该棘根过氧化物酶的酶浓度为30u/mg，土壤多酚氧化酶的浓度为30u/mg，即得所述用于低温土壤修复的复合微生物菌剂。
实施例3
棘根过氧化物酶的固定化：将介孔分子筛材料sba-15加入到rz值为3.2的棘根过氧化物酶中，在温度为12℃；ph为5.0；转速为180rpm；固定化时间为18h下进行固定化后获得。
土壤多酚氧化酶的固定化：将介孔分子筛材料sba-15加入到土壤多酚氧化酶中，在温度为13℃；ph为8；转速为180rpm；固定化时间为18h下进行固定化后获得。
耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031菌剂的制备：将耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031培养到对数期，然后按培养基体积3％的接种量将培养到对数期的菌种接种到培养基中，该培养基为以小麦秸秆粉和红薯藤粉为碳源、硫酸铵和蛋白胨为氮源的培养基，15℃下，摇床震荡160rpm，培养44小时，得到耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031的发酵液，向该发酵液中加入膨润土，干燥，即得耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031菌剂；该耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031菌剂的活菌含量为6×109cfu/g。
好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3菌剂的制备：将好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3培养到对数期，然后按培养基体积3％的接种量将培养到对数期的菌种接种到lb液体培养基中，16℃下，摇床震荡150rpm，培养31小时，加入膨润土，干燥，制得好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3菌剂。好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3菌剂的活菌含量为3×1010cfu/g。
用于低温土壤修复的复合微生物菌剂的制备：
1)将以上制备的耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031菌剂和好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3菌剂按照2:1的质量比混合均匀得到复合菌剂；
2)向制得的复合菌剂中加入以上制备的固定化棘根过氧化物酶和固定化土壤多酚氧化酶，混合均匀，其中，该棘根过氧化物酶的酶浓度为25u/mg，土壤多酚氧化酶的浓度为25u/mg，即得所述用于低温土壤修复的复合微生物菌剂。
对比例1未经过固定化的酶制剂与菌剂制备得到的复合微生物菌剂
耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031菌剂的制备：将耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031培养到对数期，然后按培养基体积2％的接种量将培养到对数期的菌种接种到培养基中，该培养基为以小麦秸秆粉和红薯藤粉为碳源、硫酸铵和蛋白胨为氮源的培养基，10℃摇床震荡170rpm，培养24小时，得到耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031的发酵液，向该发酵液中加入膨润土，干燥，即得耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031菌剂。该耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031菌剂的活菌含量为3×108cfu/g。
好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3菌剂的制备：将好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3培养到对数期，然后按培养基体积2％的接种量将培养到对数期的菌种接种到lb液体培养基中，20℃下，摇床震荡120rpm，培养48小时，加入活性炭，干燥，制得好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3菌剂。好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3菌剂的活菌含量为2×109cfu/g。
用于低温土壤修复的复合微生物菌剂的制备：
1)将耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031菌剂和好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3菌剂按照0.5:1的质量比混合均匀得到复合菌剂；
2)向步骤1)制得的复合菌剂中加入棘根过氧化物酶和土壤多酚氧化酶，该棘根过氧化物酶的酶浓度为20u/mg，土壤多酚氧化酶的浓度为20u/mg，混合均匀，即得所述用于低温土壤修复的复合微生物菌剂。
对比例2
棘根过氧化物酶的固定化：将介孔分子筛材料sba-15加入到rz值为3.2棘根过氧化物酶中，在温度为20℃；ph为5.0；转速为150rpm；固定化时间为24h下进行固定化后获得。
土壤多酚氧化酶的固定化：将介孔分子筛材料sba-15加入到土壤多酚氧化酶中，在温度为20℃；ph为10；转速为150rpm；固定化时间为24h下进行固定化后获得。
耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031菌剂的制备方法包括：将耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031培养到对数期，然后按培养基体积1％的接种量将培养到对数期的菌种接种到lb培养基中，25℃摇床震荡180rpm，培养30小时，得到耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031的发酵液，向该发酵液中加入膨润土，干燥，即得耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031菌剂。
好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3菌剂的制备方法包括：将好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3培养到对数期，然后按培养基体积1％的接种量将培养到对数期的菌种接种到lb液体培养基中，25℃摇床震荡190rpm，培养30小时，加入活性炭，干燥，制得好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3菌剂。
用于低温土壤修复的复合微生物菌剂的制备：
1)将以上制备的耐冷菌玫红假裸囊菌hd1031菌剂和好氧反硝化耐冷约氏不动杆菌dbp-3菌剂按照2:3的质量比混合均匀得到复合菌剂；
2)向制得的复合菌剂中加入以上制备的固定化棘根过氧化物酶和固定化土壤多酚氧化酶，混合均匀，其中，该棘根过氧化物酶的酶浓度为30u/mg，土壤多酚氧化酶的浓度为30u/mg，即得所述用于低温土壤修复的复合微生物菌剂。
实施例4
用于低温土壤修复的复合微生物菌剂对土壤中氨氮和农药的降解能力测试：
1)选取环境温度为-3～13℃的西藏拉萨市尼木县的被戊唑醇农药、有机磷和氨氮等污染的土壤，平均分成15份，分别置于消毒后的容器中，将15份灭菌后的土壤分成5组，每组3份。
2)取实施例1～3和对比例1～2制得的用于低温土壤修复的复合微生物菌剂，每个实施例/对比例制得的低温土壤修复的复合微生物菌剂对应加入到其中一组土壤中，混合均匀，其中土壤中加入的用于低温土壤修复的复合微生物菌剂的质量占土壤质量的0.5％。
3)两个月后检测经处理后的土壤中氨氮、农药的含量，每组3份取平均值，结果如表1所示。
表1