一种利用蓝藻原位修复砷污染高盐碱水的方法及菌株与流程

本发明涉及一种蓝藻新菌株及利用蓝藻原位修复砷污染高盐碱水的方法。

(二)

背景技术：

砷是自然界中广泛存在的类金属，同时也是对人体有巨大毒性的一种污染物。有研究表明，人体的砷中毒剂量为0.01-0.052g，致死剂量为0.06-0.02g。而随着工农业的不断发展，砷作为其中不可避免会出现的污染物，极易被释放到环境中，使得环境中的动植物乃至人类都易暴露在砷污染下，特别是在干旱/半干旱，土壤、水体盐碱化程度较高的地区，由于这些地区的环境特点-高盐碱，导致了砷的高度可迁移性，因此这些地区环境中的砷污染往往比较严重。根据文献调研结果显示，在新疆奎屯地区部分地下水中砷浓度达到了～1200μg/l；内蒙古呼和浩特盆地部分地下水中砷浓度达到了～1500μg/l。从文献调研的结果看，砷污染已经成为干旱/半干旱/土壤、水体盐碱化程度较高的地区亟待解决的难题。

然而，国内外对于砷污染废水的治理方法主要存在有物理、化学、生物这三大类。其中，物理方法主要利用一些吸附材料的高比表面积从而实现砷的吸附固定。此类方法，虽然简单易行，有较好的处理效果且易于解吸回收，但是此类方法在盐碱地区，这类高离子强度的水体中效果较差且不稳定。同样的原因也在物流化学的处理砷污染废水的方法上，混凝沉淀、离子交换等物化的技术，在盐碱环境中，失去了其原本高效的处理效果。而利用化学法如化学沉淀、氧化等处理砷污染废水时，又由于投加的药剂极易对环境造成二次污染的问题，无法实现干旱盐碱砷污染水体的原位修复。生物法修复砷污染的主流方法主要可分为植物富集和微生物修复这两大类。植物富集主要利用一些对砷有高/超富集能力的植物，如水浮莲、蜈蚣草等，而这些植物在干旱盐碱地区极难生存。而微生物修复的方法来修复地表水体砷污染之前的研究和应用主要通过微生物的细胞壁或胞外聚合物中的一些官能团对砷发生的离子交换、络合和配位作用实现水中砷污染的固定和富集，但是，环境条件变化时微生物吸附和富集砷容易发生解吸附而二次释放出砷。

综上所述，目前针对地表水体砷污染的原位修复技术很难在高盐碱干旱地区获得很好的修复效果，而又由于在高盐碱地区砷的高迁移性和对人体和自然环境的高度危险性，凸显本发明方法所述的利用钙化微生物原位修复砷污染地表水体技术的重要性和意义。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一种利用蓝藻原位生物修复砷污染高盐碱水的方法及新菌株，本发明在砷污染高盐碱地区可以实现砷污染在地表水中迁移的阻隔，为实现盐碱地区-地表水-土-地下水中砷污染的全面治理的提供了重要的一环。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种利用蓝藻原位修复砷污染高盐碱水的方法，所述方法为：将蓝藻和cacl2加入砷污染高盐碱水中，在温度为20-30℃、光照强度2000～3000lux、光照/黑暗为12h/12h的条件下培养，获得修复的高盐碱水。

所述蓝藻是具有钙化功能的蓝藻，优选蓝藻(synechocystissp.)z1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2019年03月11日，保藏编号cctccno：m2019135，地址中国武汉武汉大学，邮编430072。所述蓝藻以发酵培养获得的菌体沉淀形式加入，所述发酵培养方法为：将蓝藻接种至含36mg/lcacl2·2h2o的bg11液体培养基中，在25℃、光照/黑暗为12h/12h环境中培养至对数生长期(优选1h)，获得蓝藻发酵培养液，将培养液在5500rpm离心20min，去掉上清液后，收集菌体沉淀；所述bg11液体培养基组成：1.5g/lnano3、40mg/lk2hpo4、75mg/lmgso4·7h2o、6mg/l柠檬酸、6mg/l柠檬酸铁铵、1mg/ledtana2和20mg/lna2co3，溶剂为去离子水，ph值自然。

进一步，所述砷污染高盐碱水中砷含量为10-40mg/l，盐度为15-35‰，ph值为8.0-10。

进一步，所述蓝藻加入量以砷污染高盐碱水体积计od685在0.4～0.8之间，优选0.7。所述cacl2加入终浓度以砷污染高盐碱水体积计为400～1000mg/l，优选400mg/l。

进一步，所述砷污染高盐碱水是将nacl和砷加入bg11培养基制成的模拟水样，通过加入nacl使水样盐度为15-35‰；所述nacl加入终浓度以bg11培养基体积计为15～35g/l，所述砷加入终浓度以bg11培养基体积计为10～40mg/l。

更进一步，本发明所述利用蓝藻原位修复砷污染高盐碱水的方法按如下步骤进行：(1)蓝藻的制备：将蓝藻(优选蓝藻cctccno：m2019135)接种至bg11培养基中，在25℃、光照/黑暗为12h/12h环境中培养至对数生长期，将培养液在5500rpm离心20min，去掉上清液后，收集菌体沉淀；

(2)砷污染高盐碱水的修复：将步骤(1)菌体沉淀接种至砷污染高盐碱水中，同时加入cacl2至终浓度为400～1000mg/l，在温度为20-30℃、光照强度2000～3000lux、光照/黑暗为12h/12h的条件下培养14天，每隔4个小时摇晃一次，获得修复的高盐碱水；所述砷污染高盐碱水是将nacl和砷加入bg11培养基制成的模拟水样，ph8.5；所述nacl加入终浓度以bg11培养基体积计为15～35g/l，所述砷加入终浓度以bg11培养基体积计为10～40mg/l。

本发明还提供一种用于原位修复砷污染高盐碱水的蓝藻，所述蓝藻为蓝藻z1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2019年03月11日，保藏编号cctccno：m2019135，地址中国武汉武汉大学，邮编430072。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：①本发明蓝藻能在最高盐度为45‰的环境中存活(以菌株的生长率为指标)，4天的平均生长(生物量以od685的吸光度值计)速率为0.104965(/天)，4天的平均光合系统活性(即光合效率fv/fm为指标)fv/fm值为0.3355，能在最高砷含量为50mg/l的环境中以平均生长速率为0.134(/天)生长，4天的平均光合系统活性fv/fm值为0.3241675。②利用蓝藻处理高盐碱含砷废水，无需异位，方便且成本低，处理效果较理想，在高盐度(15-35‰)高砷含量(10-40mg/l)的环境中，砷的去除率均可达到70％以上，且不易造成二次释放；③本方法所用蓝藻具有环境适应性高，可在恶劣环境中生存的特点。故本修复技术稳定且环保。

(四)附图说明

图1为实施例2中蓝藻菌体的sem图。

图2为实施例1中钙化鉴定过程中在400mg/lca²⁺环境中蓝藻钙化后的sem图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

所述bg11液体培养基组成：1.5g/lnano3、40mg/lk2hpo4、75mg/lmgso4·7h2o、6mg/l柠檬酸、6mg/l柠檬酸铁铵、1mg/ledtana2和20mg/lna2co3，溶剂为去离子水，ph值自然。

bg11固体培养基是在bg11液体培养基中添加质量终浓度1.5％的琼脂制成。

实施例1蓝藻的分离提取及鉴定

1、蓝藻分离：蓝藻从盐碱地区砷污染水体土壤、底泥、水和藻菌生物膜中分离得到。

(1)培养：分别称取5g(湿重，不烘干)去除杂物的土壤、底泥加入250ml三角瓶中，加入50ml新疆奎屯123团排碱渠中水样(盐度15‰、ph8.24)，再加入100ml已灭菌的含质量终浓度5‰(即5g/l)nacl、终浓度5mg/lnaaso2和36mg/lcacl2·2h2o的bg11液体培养基，在温度为25℃、光照强度为2000lux、光照/黑暗为12h/12h条件下培养。当培养液中长出藻类时，将培养液用无菌水按10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6浓度梯度稀释，用涂布棒涂布于含质量终浓度5g/lnacl、终浓度5mg/lnaaso2和36mg/lcacl2·2h2o的bg11固体培养基上，在相同条件下倒置培养。

(2)分离纯藻：在bg11固体培养基中长出藻类后，采用平板划线法对藻类进行分离，在无菌条件下，用接种环挑取藻类并在新的含36mg/lcacl2·2h2o的无菌bg11固体培养基中，在温度为25℃、光照强度2000lux、光照/黑暗为12h/12h的环境中划线培养，分离的蓝藻，记为菌株z1。

2、菌株z1的鉴定

将步骤1分离的菌株z1送样中科院武汉水生生物研究所，通过形态鉴定和分子鉴定，结果为蓝藻(synechocystissp.)。

1)分子鉴定

采用ctab(cetyltrimethylammoniumbromide)方法提取菌株z1基因组，并参考《molecularsystematics》进行分子鉴定，结果(从5’-3’端)如下(seqidno.1所示)：

gactgctcgcgtgcgcccttcggacgggtgagtaacgcgtgagaacctaccttcagaatggggacaacagttggaaacgactgctaatacccaatgtgccgaaaggtgaaagatttatcgtctgaagatgggctcgcgtctgattagctagatggtggggtaagagcctaccatggcaacgatcagtagctggtctgagaggatgagcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaattttccgcaatgggcgaaagcctgacggagcaataccgcgtgagggaggaaggtccttggattgtaaacctcttttatcagggaagaagttctgacggtacctgatgaataagcatcggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggaggatgcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgtccgtaggtggttatgcaagtctgccgttaaagaatggagcttaactccataggagcggtggaaactgcaagactagagtacagtaggggtagcaggaattcccagtgtagcggtgaaatgcgtagatattgggaagaacatcggtggcgaaagcgtgctactgggctgaaactgacactgagggacgaaagctagggtagcgaaagggattagatacccctgtagtcctagccgtaaacgatggatactaggcgtggcttgtatcgacccgagccgtgccgaagctaacgcgttaagtatcccgccagggggagtacgcacgcaagtgtgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagtatgtggtttaattcgatgcaacgcgaaaaaccttaccacggcttgacatccctggaatcctgcggaa。

2)形态鉴定

菌株z1接种至含36mg/lcacl2·2h2o的bg11固体培养基，在温度为20-30℃、光照强度2000～3000lux、光照/黑暗为12h/12h的环境中培养。单细胞，或聚集成团。细胞球状或椭球状。不具胶被，或形成具无色、不易观察的薄胶被。细胞内含物均匀或具微小颗粒，浅蓝绿色、亮绿色或灰色。在细胞分裂后，2个子细胞常呈半球状暂时连在一起。细胞直径1.5-3μm。

该藻种属于一种集胞藻属(synechocystissp.)，隶属于蓝藻门(cyanophyta)、蓝藻纲(cyanophceae)、聚球藻目(synechococcales)、平裂藻科(merismopediaceae)、集胞藻属(synechocystis)，鉴定为集胞藻属蓝藻(synechocystissp.)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2019年03月11日，保藏编号cctccno：m2019135，地址中国武汉武汉大学，邮编430072。

3、蓝藻钙化能力的测定

将蓝藻cctccno：m2019135接种在ca²⁺浓度为400mg/l的bg11液体培养基中，温度为25℃、光照强度2000lux、光照/黑暗为12h/12h的环境中培养14天后，离心收集沉淀，利用质量浓度2.5％戊二醇水溶液在4℃固定4h，并用乙醇脱水后，在冷冻干燥器中(-80℃，真空环境)干燥48h，取出，利用sem观察微生物表面钙化的情况，如图2。蓝藻表面均发生了钙化，说明分离得到的蓝藻具备钙化的能力。

4、蓝藻耐盐能力的测定

将蓝藻cctccno：m2019135接种在含盐(nacl)45g/l、36mg/lcacl2·2h2o的bg11液体培养基中至od685为0.7，在温度为25℃、光照强度2000lux、光照/黑暗为12h/12h的环境中培养4天，每天测定培养基中od685，将藻液黑暗放置30min后，利用叶绿素荧光仪测定fv/fm值，并计算4天平均生长速率为0.104965(1/天)，4天的平均光合系统活性fv/fm值为0.3355，说明分离得到的蓝藻具有很强的耐盐能力。

5、蓝藻耐砷能力的测定

将蓝藻cctccno：m2019135接种在含砷50mg/l、36mg/lcacl2·2h2o的bg11液体培养基中至od685为0.7，在温度为25℃、光照强度2000lux、光照/黑暗为12h/12h的环境中培养4天，每天测定培养基中od685，将藻液黑暗放置30min后，利用叶绿素荧光仪测定fv/fm值，并计算4天平均生长速率为0.134(/天)，4天的平均光合系统活性fv/fm值为0.3241675，说明分离得到的蓝藻具有很强的耐砷能力。

实施例2

(1)蓝藻的制备：将蓝藻cctccno：m2019135接种至装有500ml含36mg/lcacl2·2h2o的bg11液体培养基的锥形瓶中，并放置在25℃，光照强度2000lux、光照/黑暗为12/12环境中，培养至对数生长期，获得培养液(蓝藻od685＝0.7)，将培养液在5500rpm离心20min，去掉上清液后，收集菌体沉淀，即为蓝藻菌体。取少量菌体沉淀，用质量浓度2.5％戊二醇水溶液固定细胞，在用乙醇脱水后，在冷冻干燥器中(-80℃，真空环境)干燥48h，取出，利用sem观察蓝藻菌体，如图1。

(2)高盐碱砷污染模拟水样的修复：以添加25g/lnacl，不同梯度浓度(10mg/l、20mg/l、40mg/l)砷的bg11液体培养基作为高盐碱砷污染的模拟水样。向500ml模拟水样中添加终浓度400mg/l的cacl2，再接种步骤(1)蓝藻菌体至od685为0.7，在模拟自然环境条件下(温度为25℃，光照强度为2000lux，光照/黑暗为12h/12h)培养，每4个小时摇晃一次锥形瓶，在第14天即在第336h时，取2ml培养液，根据初始砷浓度稀释至100μg/l以下的稀释倍数，用去离子水将培养液稀释相同倍数后，过0.22μm醋酸纤维膜，利用氢化物发生原子荧光分光光度计(afs)测量砷浓度并计算去除率(去除率(％)＝100*(c0-c)/c0)；c0为初始as(iii)浓度，c为修复过程中，不同砷浓度模拟水样的as(iii)浓度。实验结果表明：在25g/l盐含量下，不同砷污染程度(10mg/l、20mg/l、40mg/l)的水样中，利用所述的蓝藻，经过14天的原位修复，砷的去除率分别达到了77.43％，74.59％，70.17％。

(3)蓝藻钙化除砷稳定性检验：为了检验本方法蓝藻钙化除砷的稳定性，实验室模拟水环境的变化，评估修复后的模拟水样中砷的再释放情况。将步骤(2)修复14天后的培养液取50ml放入真空烘箱中于40℃低温真空干燥后，加入等量的(50ml)去离子水，放入摇床，在室温(25-30℃)、120rpm下振荡6h，取2ml振荡反应后的混合液，采用步骤(2)方法检测砷浓度，以步骤(2)模拟水样中砷的浓度(10mg/l、20mg/l、40mg/l)为基准计算砷的去除率。

实验结果表明：经过砷污染稳定性检测，在25g/l含盐环境中，利用所述蓝藻修复后的模拟水样，经过蒸发再溶解后，不同砷污染程度(10mg/l、20mg/l、40mg/l)依旧保持着较好的去除率，分别为：53.04％，44.32％，41.73％，显示了本发明方法能够在不对环境造成二次污染的前提下，较稳定的固定高盐碱环境中溶解态的砷，实现高盐碱砷污染水体的原位生态恢复。

实施例3

将实施例2中nacl浓度调整为35g/l，其他同实施例1，进行修复及稳定性的检验，结果表明，经过实验室模拟砷污染水体实验，在盐含量为35g/l，不同砷污染程度(10mg/l、20mg/l、40mg/l)的水环境中，利用蓝藻cctccno：m2019135，经过14天的原位修复，砷的去除率分别达到了73.67％，74.84％，73.48％。经过实验室砷污染固定的稳定性检测，在35g/l含盐环境中，利用所述的蓝藻修复后的模拟砷污染水样，经过蒸发再溶解后，不同砷污染程度(10mg/l、20mg/l、40mg/l)依旧保持着较好的去除率，分别为：51.02％，47.17％，45.71％。

按本发明所述方法，经过实验室模拟高盐碱砷污染地表水修复实验表明，各实施例中，均有很好的砷污染治理效果，且模拟地表水环境变化来评估本发明所述方法修复后水体的砷的再释放情况的实施例结果显示，本发明所述方法修复的砷污染不易被二次释放。

实施例4

将实施例2中nacl浓度调整为15g/l，ca²⁺浓度分别调整为50、200、500mg/l，as(iii)浓度调整为10mg/l，菌种使用本发明所述的蓝藻cctccno：m2019135与双囊藻属(geminocystis)(马苏超,王一郎,敖鸿毅,虞功亮,李守淳,李仁辉.双囊藻属(geminocystis)及分类和生态学讨论[j].湖泊科学,2019,31(01):236-242.)以湿重比1：1混合的混合藻，进行修复检验，结果表明，经过实验室模拟砷污染水体实验，在盐含量为15g/l，不同ca²⁺浓度(50、200、500mg/l)的水环境中，利用混合藻，经过8天的原位修复，砷的去除率分别为14.85％、27.61％和35.46％。实施例2、3中盐含量为25、35g/l，砷含量为10、20、40mg/l处理难度远大于实施例4中的环境，但是实施例2、3中砷的去除率却高于实施例4，说明本发明蓝藻对砷去除具有加强作用，双囊藻会抑制本发明所述蓝藻对砷的去除作用。

实施例5

(1)菌株的准备：如实施例4中所述的混合藻。

(2)自然盐碱砷污染地表水环境的模拟：在烧杯底部放入170g采自新疆地区河流中底泥，加入250ml过0.22μm滤膜后的采自新疆地区河流中的水样(nacl浓度均为15g/l，ph8.24)，并加终浓度10mg/lnaaso2，再加入30g采自新疆地区河流中的自然藻类，即为模拟自然盐碱砷污染地表水样。

(3)蓝藻修复自然盐碱砷污染地表水：向步骤(2)模拟自然盐碱砷污染地表水样中投加cacl2至终浓度700mg/l，850mg/l，1000mg/l。接种步骤(1)混合藻至od685为0.7，在模拟自然环境条件下(温度为25℃，光照强度为2000lux，光照/黑暗为12h/12h)培养，每4个小时摇晃一次锥形瓶，在第7天时，取2ml培养液，测量砷浓度，检测与去除率计算方法如实施例2中所述。实验结果表明：在不同浓度ca²⁺投加量(700mg/l，850mg/l，1000mg/l)的情况下，模拟自然盐碱砷污染地表水中利用所述的蓝藻修复，经过7天的原位修复，砷的去除率分别达到了69.49％，75.51％，83.33％。在实施例5中选择用混合藻，为了说明在双囊藻(能抑制本发明所述蓝藻去除砷的物种)大量存在的复杂盐碱水环境(底泥+水+生物膜)中，本发明所述蓝藻仍对砷有去除作用。

序列表

<110>浙江工业大学

<120>一种利用蓝藻原位修复砷污染高盐碱水的方法及菌株

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>894

<212>dna

<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum

<400>1

gactgctcgcgtgcgcccttcggacgggtgagtaacgcgtgagaacctaccttcagaatg60

gggacaacagttggaaacgactgctaatacccaatgtgccgaaaggtgaaagatttatcg120

tctgaagatgggctcgcgtctgattagctagatggtggggtaagagcctaccatggcaac180

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gacccgagccgtgccgaagctaacgcgttaagtatcccgccagggggagtacgcacgcaa780

gtgtgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagtatgtggtttaatt840

cgatgcaacgcgaaaaaccttaccacggcttgacatccctggaatcctgcggaa894