生物刺激剂的应用及其复合制剂和应用

本发明涉及污染土壤修复技术领域，具体涉及一种生物刺激剂的应用，还涉及包含该生物刺激剂的复合制剂和应用。

背景技术：

氯代芳烃是由人工合成、化学性质比较稳定的一类化合物，其广泛用于医药、农药、工程塑料、家庭卫生、材料合成以及染料工业等行业中。但氯代芳烃中的氯原子有较高的电负性，能够强烈吸引苯环上的电子，从而使苯环成为一个疏电子环，因而化学性质相当稳定，很难降解，而且毒性大，对中枢神经系统有抑制和麻醉作用，甚至是致癌的；通常高氯离子废水，盐度较大。随着氯苯的大量使用，致使环境中大量存在，对人类健康和生态环境造成严重威胁，随着国际、国内在可持续发展中对生态环境提出越来越高的要求，如何有效的消除该类污染已成为环境保护领域的重要研究内容。

从解决大面积污染的角度考虑，生物降解因其具有高效性及低成本性，被认为是消除氯苯类污染物最有效的途径。生物降解包括了厌氧和好氧生物降解两种方式。厌氧降解常用生丝微菌属(hyphomicrobium)、产乙烯脱卤拟球菌(dehalococcoides)等脱氯菌，使高氯代有机物还原脱氯。脱氯菌常与产乙酸菌(homoacgtogens)和产甲烷菌(methanogens)形成聚生体，在碳源和外源电子供体存在的条件下，氯代烃作为电子受体为厌氧微生物提供能源并同时被降解。但厌氧降解存在降解不彻底的缺陷，脱氯后的产物往往具有更大的生物毒性和致癌性。而好氧降解途径可通过羟基化作用或环氧化作用使得氯代烃完全降解，相对于降解不彻底的厌氧生物降解，好氧生物降解具有显著优势。

当前国内还未有报道利用粘质沙雷氏菌用于氯代芳烃污染土壤的降解研究。当前已报到功能菌株中，只能通过共代谢或厌氧脱氯等单一形式实现氯代芳烃的降解，条件要求苛刻，这在一定程度上限制了氯代芳烃好氧氧化在工程上的应用。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供生物刺激剂在提高微生物对氯代芳烃的降解率中的应用；本发明的目的之二在于提供包含该生物刺激剂的复合制剂；本发明的目的之三在于提供该复合制剂在修复氯代芳烃污染的土壤中的应用；本发明的目的之四在于提供该复合制剂修复氯代芳烃污染土壤的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、生物刺激剂在提高微生物对氯代芳烃的降解率中的应用，所述生物刺激剂为小分子碳源物质。

优选的，所述小分子碳源物质为柠檬酸钠或/和琥珀酸钠；所述氯代芳烃为氯苯(chlorobenzene，cb)或/和1,2-二氯苯(dichlorobenzene，dcb)。

2、含有生物刺激剂的复合制剂，其特征在于：所述复合制剂由生物强化菌和生物刺激剂组成；所述生物强化菌为粘质沙雷氏菌(serratiamarcescensstrain)tf-1，保藏于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为cctccno：m2019674；所述生物刺激剂为柠檬酸钠或/和琥珀酸钠；

优选的，所述生物强化菌和生物刺激剂的体积质量比为1～1.25：4，单位为ml：mg。

3、所述的复合制剂在修复氯代芳烃污染的土壤中的应用。

优选的，所述氯代芳烃为cb或/和dcb。

4、利用所述的复合制剂修复氯代芳烃污染土壤的方法，其特征在于：包含如下步骤：

1)将粘质沙雷氏菌tf-1菌液接种于污染土壤中；

2)加入柠檬酸钠或/和琥珀酸钠；

3)控制湿度为20～30％，ph值为6～9，温度为20～40℃下培养至少2天。

优选的，所述tf-1菌液与柠檬酸钠或/和琥珀酸钠、污染土壤混合比例为1～1.25：4：20，单位为ml：mg：g。

优选的，所述ph通过添加无机盐培养基控制，所述无机盐培养基各组分浓度如下：cacl20.1g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，nh4so42.5g/l，kh2po44.5g/l，nacl0.2g/l。

优选的，所述培养的时间为14～22天。

本发明的有益效果在于：本发明公开一种生物刺激剂的应用及其复合制剂和应用，利用优选的小分子物质琥珀酸钠、柠檬酸钠作为生物刺激剂进行生物刺激修复，可提高微生物对氯代芳烃的降解效率，且琥珀酸钠的效果优于柠檬酸钠。将上述生物刺激剂及其和粘质沙雷氏菌tf-1联合制成复合制剂，利用生物刺激/生物强化联合修复的形式使两种技术互补，能有效降解氯苯和1,2-二氯苯，该方法具有去除效果显著、成本低、可扩展性强的优势，可广泛应用于有机污染场地的土壤修复与治理。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为生物刺激(柠檬酸钠为底物)/强化微生物降解土壤中的cb；

图2为生物刺激(柠檬酸钠为底物)/强化微生物降解土壤中的dcb；

图3为生物刺激(琥珀酸钠为底物)/强化微生物降解土壤中的cb；

图4为生物刺激(琥珀酸钠为底物)/强化微生物降解土壤中的dcb。

生物保藏：

本发明中粘质沙雷氏菌(serratiamarcescensstrain)tf-1保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2019674,地址位于中国武汉武汉大学，保藏日期为2019年8月29日，分类命名为粘质沙霍氏菌(serratiamarcescensstrain)tf-1。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、菌种富集与优化

本实施例中的菌种为可降解氯苯的粘质沙雷氏菌(serratiamarcescensstrain)tf-1，保藏于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为cctccno：m2019674。

1)富集培养：将筛选得到的菌液母液2％于装有50ml已灭菌lb培养基中的125ml盐水瓶中，用已灭菌的聚四氟橡胶盖密封，设置摇床参数为30℃、160r/min进行驯化，培养时间为3～4天，获得初代功能微生物。

2)菌种优化：将初代功能微生物制备菌悬液，加入到装有一定量(体积比为0.1～0.15)无机盐培养基的盐水瓶中，无机盐溶液配方为：cacl20.1g；mgso4·7h2o0.2g；nh4so42.5g；kh2po44.5g，nacl0.2g，蒸馏水1l。分别添加氯苯至终浓度为60mg/l、130mg/l、200mg/l，后具塞密封，放入摇床设定30℃、160r/min条件下振荡培养3～5天为一个驯化期，每隔24h检测菌液浓度以及cb浓度，连续培养4次，cb降解率稳定70％以上结束驯化，并将此作为菌种种子液(菌液od600＝0.4～0.5)，4℃冰箱保存，用于后续实验。

实施例2、柠檬酸钠为底物强化/刺激土壤中cb的降解

供试土壤样品取自不同深度的氯代芳烃污染土壤中，将供试土壤样品风干、粉碎、除杂、过2.0mm筛后，称取2g处理后的土壤(覆盖土)于装有0.3ml10％的氯化钠溶液的20ml顶空瓶中，分别加入0.04、0.08、0.2、0.4、0.8、1.2、2ml的500μg/mlcb标准储备液配制成10、20、50、100、200、300、500μg/g浓度梯度的加标土样，以峰面积与对应的浓度进行线性回归，得到各组分的线性方程和相关系数。

氯代芳烃的检测采用气相色谱，色谱条件如下：db-23弹性石英毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm)。进样口温度240℃，检测器温度260℃，柱温：90℃(1.0min)以10℃/min升至140℃，再以20℃/min升至200℃(1.0min)；载气：氮气(99.999％)，柱内载气流量2.0ml/min，分流进样，分流比10∶1；ecd电流0.5na；尾吹气流量40ml/min。

每瓶20g土壤，cb(氯苯)添加量为200μg/gsoil，柠檬酸钠添加量为0.2mg/gsoil，外源菌液(tf-1)接种量为1～1.25ml/20g土壤，空白对照为不添加tf-1和柠檬酸钠，tf-1为实施例1中经过富集优化的粘质沙雷氏菌tf-1。土壤灭菌条件为于105℃条件下烘48h，同时按0.25mg/gsoil的剂量添加nan3。供试土壤保持20～30％含水率，供试土壤的ph值为6～9，大多数污染土壤的ph值均在此范围内，若果污染土壤的ph值大于9或者小于6的情况下，则可提前加入无机盐培养液调节土壤的ph值，无机盐溶液起始添加量为3ml/20g土壤，无机盐溶液配方为：cacl20.1g，mgso4·7h2o0.2g，nh4so42.5g，kh2po44.5g，nacl0.2g，蒸馏水1l。无机盐溶液可根据7天平均气温予以添加调整，月平均气温为25～35℃时，无机盐溶液每7天添加一次；月平均气温为20～25℃，无机盐溶液每4天添加一次，以此来保持土壤含水率为20～30％。放置恒温摇床中保持温度为20～40℃，培养时间为14天，实验分组见表1。

表1.添加柠檬酸钠后对cb污染土壤降解实验设计

结果如图1所示：灭菌土+cb+tf-1组cb的剩余量为40.2％，非灭菌土+cb组最终cb的剩余率为80％，说明土著微生物对cb有一定的降解作用；其中非灭菌土+cb+柠檬酸钠(底物)和灭菌土+cb+柠檬酸钠(底物)+tf-1这两个实验组最终均能将土壤中的cb完全降解。

其中，非灭菌土+cb的最大降解速率为0.033mg/(g·h)，灭菌土+cb+tf-1的最大降解速率为0.11mg/(g·h)，土著微生物在添加柠檬酸钠后最大降解速率为0.43mg/(g·h)，相较于非灭菌土+cb提升了13.03倍，tf-1在添加柠檬酸钠后最大降解速率为0.38mg/(g·h)，相较于非灭菌土+cb提升了11.52倍，土著微生物在同时添加柠檬酸钠和tf-1降解速率为0.2mg/(g·h)，提升了6.06倍，其cb最终剩余量分别为1.64ug/gsoil和0.28ug/gsoil，说明以柠檬酸钠作为生物刺激药剂、tf-1作为生物强化菌剂可实现cb的有效降解。

实施例3、柠檬酸钠为底物强化/刺激土壤中dcb的降解

每瓶20g土壤，dcb添加量为200μg/gsoil，柠檬酸钠添加量为0.2mg/gsoil，外源菌液(tf-1)接种量为1～1.25ml/20g土壤，空白对照为不添加tf-1和柠檬酸钠，无机盐溶液起始添加量为3ml/20g土壤。tf-1为实施例1中经过富集优化的粘质沙雷氏菌tf-1，供试土壤保持20～30％含水率，保持土壤温度为20～40℃，供试土壤的ph值为6～9，土壤灭菌条件、检测方式等条件同实施例2，培养时间为22天，实验分组见表2。

表2.添加柠檬酸钠后对dcb污染土壤降解实验设计

结果如图2所示：非灭菌土+dcb组最终剩余量为85.9％，非灭菌土+dcb+柠檬酸钠(底物)组dcb最终的剩余量为68％，非灭菌土+dcb+柠檬酸钠+tf-1组即土著微生物在生物刺激及生物强化的作用下对dcb的降解率为52.9％，灭菌土在添加tf-1的作用下对dcb的降解率为78.9％，在不添加柠檬酸钠时tf-1对dcb的最大降解速率为0.28mg/(g·h)，土著微生物在添加柠檬酸钠后最大降解速率为0.29mg/(g·h)，相较于tf-1对dcb的降解速率提升了1.03倍，tf-1在添加柠檬酸钠后第8天达到最大降解速率为0.34mg/(g·h)，趋于稳定时的平均降解速率在0.28mg/(g·h)左右，相较于tf-1直接降解dcb的最大降解速率提升了1.21倍，土著微生物在添加柠檬酸钠和tf-1后对dcb的最大降解速率为0.79mg/(g·h)，相较于tf-1直接降解dcb提升了2.86倍。说明联合生物刺激和生物强化可实现dcb的快速降解。

实施例4、琥珀酸钠为底物强化/刺激土壤中cb的降解

每瓶20g土壤，cb添加量为200μg/g，空白对照为不添加外源菌和琥珀酸钠，外源菌液(tf-1)接种量为1～1.25ml/20g土壤，琥珀酸钠添加量为0.2mg/gsoil，无机盐溶液起始添加量为3ml/20g土壤。tf-1为实施例1中经过富集优化的粘质沙雷氏菌tf-1，供试土壤保持20～30％含水率，保持土壤温度为20～40℃，供试土壤的ph值为6～9，土壤灭菌条件、检测方式等条件同实施例2,处理的时间为14天，实验分组见表3。

表3.添加琥珀酸钠后对氯苯污染土壤降解实验设计

结果如图3所示：以琥珀酸钠为底物时，tf-1在生物刺激的作用下第6天能实现cb的完全去除，但土著微生物在第13天才能实现cb的完全去除，土著微生物在生物刺激及生物强化的共同作用下也能实现第8天完全去除cb。

tf-1在添加琥珀酸钠后的最大降解速率为2.38mg/(g·h)，土著微生物在添加琥珀酸钠后最大降解速率为1.09mg/(g·h)，土著微生物在添加tf-1和柠檬酸钠后最大降解速率为0.78mg/(g·h)，相较于tf-1对cb的最大降解速率0.21mg/(g·h)分别提升了11.3、5.2和3.7倍，说明以琥珀酸钠为底物时，更能激发tf-1的降解潜能。

实施例5、琥珀酸钠为底物强化/刺激土壤中dcb的降解

每瓶20g土壤，dcb添加量为200μg/g，空白对照为不添加外源菌和琥珀酸钠，外源菌液(tf-1)接种量为1～1.25ml/20g土壤，琥珀酸钠添加量为0.2mg/gsoil，无机盐溶液起始添加量为3ml/20g土壤。tf-1为实施例1中经过富集优化的粘质沙雷氏菌tf-1，供试土壤保持20～30％含水率，保持土壤温度为20～40℃，供试土壤的ph值为6～9，土壤灭菌条件、培养时间和检测方式同实施例2，处理的时间为22天，实验分组见表4。

表4.添加琥珀酸钠后对dcb污染土壤降解实验设计

结果如图4所示：以琥珀酸钠为底物时，tf-1在生物刺激的作用下dcb的剩余率为40.4％，土著微生物在生物刺激以及生物刺激+强化联合作用下对1,2-dcb的剩余率分别为16.9％和13.8％。

土著菌降解dcb最大降解速率为0.091mg/(g·h)，tf-1降解dcb最大降解速率为0.19mg/(g·h)，tf-1在添加琥珀酸钠时最大降解速率为0.26mg/(g·h)，土著微生物在添加tf-1和琥珀酸钠后最大降解速率为0.63mg/(g·h)，相较于tf-1降解dcb提升了3.3倍，相较于土著微生物直接降解dcb提升了6.9倍。土著微生物添加琥珀酸钠后dcb第6天达到最大降解速率为0.94mg/(g·h)，降解速率最终趋于稳定时的平均降解速率在0.2mg/(g·h)左右，最大降解速率为是tf-1降解dcb的4.9倍。说明以琥珀酸钠为底物时，土著微生物与tf-1存在一定的竞争，但要弱于以柠檬酸钠为底物时的竞争强度，对dcb的降解，以琥珀酸钠为底物时更有优势，降解率更好。

综上可以看出，本发明选用的生物强化菌剂粘质沙雷氏菌tf-1，生物刺激药剂琥珀酸钠和柠檬酸钠在氯代芳烃污染土壤中均能发挥较好的效能，既可用生物强化菌剂实现氯代芳烃污染土壤的有效降解，也可通过添加生物刺激药剂刺激粘质沙雷氏菌及土著微生物实现土壤中氯代芳烃的快速去除。粘质沙雷氏菌独特的降解特性有望在氯代烃生物降解的工程应用领域取得新的突破。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。