含有8种甘油三酯的药物组合物、制剂及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药学领域，具体而言，本发明涉及含有8种甘油酯的药物组合物、制 剂、制备方法及其在制备抗肿瘤和提高机体免疫功能药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 薏该仁是禾本科薏该属植物薏该Coix lacryma-jobi L. var ma-yuen (Roman.) Stapf的成熟干燥种仁，为利水渗湿药，很久以来为药食两用品种。现代研究发现薏苡 仁具有镇痛抗炎、免疫调节、抗溃疡、降血脂和减肥等药理作用。近年来，国内外学者通 过TLC、HPLC-MS、GC等方法对薏苡仁的化学成分进行了研究，发现其含有多种活性成分， 主要包括薏苡仁酯、甘油三酯类、脂肪酸类、内酰胺类、薏苡仁内酯、糖类、留醇类、三萜 类等化合物。其中，酯类是首先被发现的具有抗肿瘤活性的成分，也是报道最多最受关 注的化学成分。虽然目前在中国临床上以薏苡仁油为有效成分的康莱特注射剂已得到 普遍应用，但关于其物质基础和抗癌活性成分的研究鲜有报道，向智敏等[中国中药杂 志，2005, 30(18) :1436-1438]仅采用液质联用法对薏苡仁油中三酯类成分进行了定性分 析，初步推定12种甘油三酯成分：三亚油酸甘油酯、二亚油酸油酸甘油酯、棕榈酸二亚油酸 甘油酯、亚油酸二油酸甘油酯、棕榈酸亚油酸油酸甘油酯、二棕榈酸亚油酸甘油酯、三油酸 甘油酯、油酸亚油酸硬脂酸甘油酯、棕榈酸二油酸甘油酯、棕榈酸亚油酸硬脂酸甘油酯、二 棕榈酸油酸甘油酯和二油酸硬脂酸甘油酯，但并未对各成分的具体化学结构及药理活性进 行深入研究。而薏苡仁油中不仅含有上述甘油三酯成分外，还含有甘油一酯、甘油二酯和脂 肪酸酯等。由此可见，薏苡仁油脂成分的复杂性，这必然会使实际生产过程中的质量控制和 临床用药安全面临很大的挑战。
[0003] 因此，开发一种安全、有效、可控的治疗肿瘤的药物即成为本发明关注的热点。本 发明对薏苡仁油中甘油三酯成分逐一进行了分离、结构确证、药效活性筛选，选取了 8种具 有显著抗肿瘤和增强免疫功能的甘油三酯单体，将其按照不同比例组合，进行药效试验研 究，得到了本发明所述的药物组合物、制剂及其在抗肿瘤和增强免疫能力中的应用。采用本 发明所述组合物用药，成分及组成确定，可有效保障工业生产中各批次成品质量的稳定性， 也避免了因直接采用薏苡仁粗油入药因成分复杂不清而导致的毒副反应。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种含有甘油酯的药物组合物，具体由如下质量百分含量 的8种成分组成：
[0005] 三亚油酸甘油酯 2.08-2.99 1-油酸-2,3-二亚油酸甘油酯 24.24-34.85 1-棕榈酸-2,3-二亚油酸甘油酯 3.44-4.95 U-二油酸-2-亚油酸甘油酯 22.32-32.09 1-棕榈酸-2-亚油酸-3-油酸甘油酯 10.32-14.84 1,3 -二棕榈酸-2-亚油酸甘油酯 0.40-0.58 三油酸甘袖酯 12.80-18.40 1-棕榈酸-2,3-二油酸甘油酯 4.40-6.33
[0006] 优选的，上述8种成分的质量百分含量为：
[0007] 三亚油酸甘油酯 2.34-2.86 1-油酸-2,3-二亚油酸甘油酯 27.27-33.33 1-棕榈酸-2,3-二亚油酸甘油酯 3.87-4.73 U-二油酸-2-亚油酸甘油酯 25.11-30.69
[0008] 1-棕榈酸-2-亚油酸-3-油酸甘油酯 11.61-14.19 U-二棕榈酸-2-亚油酸甘油酯 0.45-0.55 三油酸甘油酯 14.40-】8.40 1 -棕榈酸-2,3-二油酸甘油酯 4.95-6.05
[0009] 更优选的，上述8种成分的质量百分含量为：
[0010] 三亚油酸甘油酯 2.55-2.65 1-油酸-2,3-二亚油酸甘油酯 29.69-30.91 1-棕榈酸-2,3-二亚油酸甘油酯 4.21-4.39 ],3-二油酸-2-亚油酸甘油酯 27.34-28.46 1-棕榈酸-2-亚油酸-3-油酸甘油酯 12.64-13.16 U-二棕榈酸-2-亚油酸甘油酯 0.49-0.51 三油酸甘油酯 15.68-16.32 1 -棕榈酸-2,3-二油酸甘油酯 5.39-5.61
[0011] 其中，所述8种甘油三酯成分可以通过如本发明实施例所述方法分离获得，也可 以采用本领域常规合成方法制备或者直接市场购买。
[0012] 本发明的又一目的在于提供一种含有甘油酯的药物制剂，具体包括本发明所述药 物组合物及一种或几种药学上可接受的载体。
[0013] 其中，所述药学上可接受的载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、乳 化剂、粘合剂、润滑剂、吸收促进剂、表面活性剂、崩解剂、润滑剂或抗氧化剂，必要时还可以 加入香味剂、甜味剂、防腐剂或着色剂。
[0014] 所述药学上可接受的载体可以选自：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫 代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、大豆磷脂、维生素 C、维生素 E、EDTA二钠 、EDTA 钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯 化钠、氯化钾、乳酸钠、羟苯乙酯溶液、苯甲酸、山梨酸钾、醋酸氯己定、木糖醇、麦芽糖、葡萄 糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻 酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二 醇、环糊精、β -环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙或硬脂酸镁。
[0015] 所述药物制剂可以是口服固体制剂、口服液体制剂或注射剂。
[0016] 优选的，
[0017] 所述口服固体制剂选自胶囊剂、片剂、滴丸、颗粒剂、浓缩丸中的一种；所述口服液 体制剂选自水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或是一种在使用前可用水或其 它适宜的载体复配的干燥产品；所述注射剂选自纳米混悬剂、脂质体、乳剂、冻干粉针剂和 水针剂中的一种。
[0018] 更优选的，
[0019] 所述注射剂包括如下成分：本发明所述药物组合物50~350g，注射用大豆磷脂 或可供注射用大豆磷脂10~40g，注射用甘油或可供注射用甘油15~50g，注射用水加至 1000ml〇
[0020] 其可通过如下方法制备：
[0021] 称取处方配制量的注射用大豆磷脂或可供注射用大豆磷脂，加适量的注射用水 后，用高剪切分散乳化机分散至无块状及颗粒状固体，加入按配方量称取的注射用甘油或 可供注射用甘油，并加注射用水至规定量，搅拌均匀备用；
[0022] 另称取含有8种活性成分的药物组合物，将称取的油酯与水相分别加热至60~ 70°C后，置高压均质机进行高压乳化，乳化时均质机低压为5~12MPa，高压为25~50MPa， 再循环均质3~6遍，至2μηι以下颗粒应不少于95%，5 μ m以上颗粒不得检出，必要时用 NaOH或HC1调节pH至4. 8~8. 5,优选6. 8~7. 0,最优选为6. 8 ;
[0023] 将制得均匀乳剂氮气加压通过小于等于3 μ m的微孔滤芯过滤器过滤，充氮灌装 灭菌，冷却即得。
[0024] 所述胶囊剂包括如下成分：含有8种活性成分的药物组合物200~800g，抗氧化 剂和/或乳化剂〇. 20~0. 60g，制成1000粒。
[0025] 其可通过如下方法制备：
[0026] 胶液配制：按重量比为1:0. 6~1. 2:0. 3~0. 8:0. 0001~0. 01称取适量明胶、纯 化水、甘油和防腐剂；依次将甘油、纯化水、防腐剂（选自10%羟苯乙酯溶液、苯甲酸、山梨 酸钾和醋酸氯己定中的一种）加入化胶罐内，加热至70°C~90°C后，再加入明胶不断搅拌、 抽真空，直至明胶完全溶解，将胶液过滤，在56~62 °C下存放，备用；
[0027] 药液配制：将配方量的药物组合物、抗氧化剂和/或乳化剂（抗氧化剂为维生素 E，乳化剂为吐温80)加入配料罐内，不断搅拌，直至混合均匀；
[0028] 压胶囊：根据胶囊大小选择合适的压丸模具，在15~30°C、相对湿度小于35%条 件下进行压丸定型后干燥，剔除大小丸，再用95%药用乙醇洗丸后，继续干燥至含水量小于 12%，目检剔除不合格胶囊，印字，包装即得。
[0029] 本发明通过药效实验表明，所述药物组合物及其制剂对多种人肿瘤细胞株均有不 同程度的抑制作用，可作为治疗肿瘤疾病药物。
[0030] 因此，本发明的目的还在于提供一种上述药物组合物、药物制剂在制备抗肿瘤药 物中的应用。以及上述药物组合物在制备提高机体免疫功能药物中的应用，及其与LAK细 胞（淋巴因子激活的杀伤细胞）的组合在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0031 ] 其中，所述肿瘤是指早期、中期或晚期的肺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌或 乳腺癌。
[0032] 以下通过实验数据说明本发明所述组合物及其制剂在抗肿瘤和提高机体免疫功 能方面的有益效果。
[0033] -、体外MTT法测定药物组合物及其制剂对8种人肿瘤细胞株的抑制作用
[0034] 1、实验材料及配制
[0035] (1)细胞株：PANC-1 (人胰腺癌细胞）、SK0V3 (人卵巢癌细胞）、MCF-7 (人乳腺癌细 胞）、Bcap-37 (人乳腺癌细胞）、SMMC-7721 (人肝癌细胞）、H印G-2 (人肝癌细胞）、A549 (人 肺癌细胞）、H460 (人肺癌细胞），上述细胞株由上海医药工业研究药理评价研究中心保存， 传代维持。
[0036] (2)01^1完全培养基：添加10%新生牛血清（6四0)81^)、双抗。
[0037] (3)0. 25%胰蛋白酶溶液（Trypsin):购自 Invitrogen 公司，-20°C保存。
[0038] (4)磷酸缓冲液（PBS) :NaC18g，KC10. 2g，Na2HP04l. 15g，ΚΗ2Ρ040· 2g，溶于 1L 双蒸 水，121°C高压消毒20min，4°C保存。
[0039] (5) MTT (AMRESC0)溶液：用 PBS 配成 5mg/ml 溶液。
[0040] (6)溶解液：每100ml去离子双蒸水含SDSlOg，异丁醇5ml，浓盐酸0· 1ml。
[0041] 2、实验方法
[0042] 样品对上述细胞株的抑制作用通过MTT法测得。
[0043] 具体步骤如下：
[0044] (1)细胞培养：①将细胞从液氮中取出，在37°C水浴中迅速解冻，细胞在无菌操 作台中移入l〇ml无菌离心管中加6ml细胞培养基，1000转/分钟离心5分钟。弃去上清 液，沉淀中加入5-6ml细胞培养基，滴管吹打使其悬浮后移入细胞培养瓶中，置37°C细胞培 养箱内。②次日，自培养箱中取出细胞，弃去细胞瓶中细胞培养基，加入5~6ml细胞培养 基，置37°C细胞培养箱内。③隔日，自培养箱中取出细胞，弃去细胞瓶中细胞培养基，加入 PBS (pH7. 4) 2~3ml晃动清洗，倒掉PBS溶液后再重复一次清洗。在培养瓶中加入3~5滴 0. 25%胰蛋白酶溶液晃动均匀，加盖置于37°C细胞培养箱内3分钟左右，于显微镜下观察 发现细胞自培养瓶壁上脱离，加细胞培养基2ml，滴管吹打使细胞完全脱离瓶壁后，分别移 入2个干净培养瓶中，加入细胞培养基5~6ml吹打均匀，置于37°C细胞培养箱内。④隔 日，重复③步骤。在整个培养过程中，贴壁细胞不允许生长过密，悬浮细胞始终保持对数生 长期。（2)样品及对照品制备：称取适量药物组合物样品溶解于DMS0中，得到浓度为10mg/ ml 的溶液。再用 PBS作梯度稀释，得到浓度 10mg/ml、5000 μ g/ml、2500 μ g/ml、1250 μ g/ml、 625 μ g/ml、312. 5 μ g/ml 的稀释样品。
[0045] (3)将稀释好的样品加入平底96孔板中，每孔10 μ 1，每点作两个平行测试。将 DMS0相应作梯度稀释后加入板中，作为对照。
[0046] (4)取处于对数生长期的细胞，细胞经胰酶消化并洗涤后悬浮于含10%小牛血清 的培养基中，经苔盼蓝染色排除法计活细胞数，并调节细胞悬浮液密度至2X 105个细胞/ ml〇
[0047] (5)将加入细胞的平底96孔板在37°C、5% C02细胞培养箱中培养48小时。
[0048] (6)每孔中加入20 μ 1的5mg/ml MTT溶液，继续在培养箱中保温3~4小时。
[0049] (7)每孔加入100 μ 1溶解液，继续在培养箱中保温过夜，使生成的甲臢晶体充分 溶解。测定570nm光吸收值。
[0050] (8)根据光吸收值计算各样品浓度组的细胞生长抑制率。计算公式如下：
[0051] (1 -实验孔平均光吸收值/对照孔平均光吸收值）X 100%
[0052] 3、实验结果
[0053] 表1不同浓度样品对8种细胞株的生长抑制率（％ )
[0055] 表2样品在体外对8种细胞株的IC5。（ μ g/ml)
[0057] 4、结论
[0058] 不