ResolvinD1作为抗癫痫药物的应用

Resolvin D1作为抗癫痫药物的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药技术领域，具体涉及Resolvin D1作为抗癫痫药物的应用。
【背景技术】
[0002]癫痫(Epil印sy)是神经系统仅次于脑卒中的第二大常见疾病，全世界有约5000万人患有癫痫，我国的癫痫患者约有900多万，每年的新发病人大于40万，目前癫痫的治疗仍以药物为主要手段，其中，传统的抗癫痫药物有苯妥英钠、卡马西平、丙戊酸、苯巴比妥、扑痫酮、乙琥胺、氯硝西泮；新型的抗癫痫药物有托吡酯、拉莫三嗪、加巴喷丁、非氨酯、奥卡西平、氨已烯酸、替加宾、唑尼沙胺、左乙拉西坦、普瑞巴林。约75-80%患者使用以上抗癫痫药物得以控制，但仍有25-30%癫痫患者药物治疗无效。这不仅给癫痫患者的身心健康带来严重的影响，也给家属带来了沉重的经济负担，并带来一系列心理社会问题。近年来癫痫与炎症的关系是癫痫领域的热点问题，并且有大量研究发现癫痫与炎症关系十分密切。然而，癫痫发作的机制尚未完全阐明，因此，研究癫痫发病机制并寻找新的更加安全有效、不良反应少的抗癫痫药物显得尤为重要。
[0003]Resolvin D1 (消退素D1)是由ω-3多不饱和脂肪酸DHA衍生的消退素家族中的重要一员。消退素D1 (Resolvin D1)能抑制细胞核转录因子NF-κ B的活性，从而抑制过度的中性粒细胞向组织浸润，降低炎症性细胞因子的产生。消退素D1还能对脂多糖(LPS)介导的小鼠急性肺损伤发挥保护作用，也通过中枢或者外周机制减轻炎症性疼痛，改善小鼠缺血再灌注损伤以及控制小鼠动脉粥样硬化形成等作用。但Resolvin D1在癫痫导致的脑组织损伤是否有保护作用，目前国内外未见相关报道。

【发明内容】

[0004]本发明的目的是提供Resolvin D1作为抗癫痫药物的应用，将Resolvin D1作为抗炎症、抗癫痫药物，能降低受损脑细胞炎症反应。
[0005]本发明所采用的技术方案是:
Resolvin D1作为抗癫痫药物的应用。
[0006]所述Resolvin D1通过增加内源性抗粘附分子DEL-1的表达、降低IL-17含量而作为抗炎、抗癫痫的药物。
[0007]本发明具有以下优点:
本发明利用现代生物学技术，首次提出了 DEL-1在癫痫发作后人脑脊液、血清及鼠脑组织中的表达下调。并涉及3 μ g/kg的Resolvin D1对癫痫大鼠的脑保护作用及机制。所述Resolvin D1对氯化锂匹罗卡品诱导的癫痫大鼠有抗癫痫作用，具有抗炎症反应性能，其机制可能为显著增加DEL1表达，降低IL-17含量等途径降低癫痫大鼠体内炎症反应，产生对癫痫大鼠的脑保护作用。
【附图说明】
[0008]图1为癫痫发作后人脑脊液中DEL1的ELISA检测结果，显示癫痫发作后人脑脊液中DEL1的表达含量与对照组相比显著下降< 0.001)。
[0009]图2为癫痫发作后人血浆中DEL1的ELISA检测结果，显示癫痫发作后人血浆中DEL1的表达含量与对照组相比显著下降(***P < 0.001)。
[0010]图3为Western Blot检测DELI在人脑脊液中的表达结果，显示癫痫发作后人脑脊液中DEL1水平与对照组相比显著下降(***P < 0.001)。
[0011]图4为Western Blot检测DELI在大鼠海马组织中的表达结果，显示癫痫发作后大鼠海马组织DEL1的表达量与对照组相比明显下降，且resolvin D1可显著增加DEL1在癫痫大鼠海马组织中的表达量(#*P < 0.001)。
[0012]图5为癫痫发作后人脑脊液中IL-17的ELISA检测结果，显示癫痫发作后人脑脊液中IL-17的表达含量与对照组相比显著增加(***P < 0.001)。
[0013]图6为癫痫发作后人血浆中IL-17的ELISA检测结果，显示癫痫发作后人血浆中IL-17的表达含量与对照组相比显著增加(*#P < 0.001)。
[0014]图7为Western Blot检测IL-17在大鼠海马组织中的表达结果，显示癫痫发作后大鼠海马组织IL-17的表达量与对照组相比明显增加，且resolvin D1可显著抑制IL-17在癫痫大鼠海马组织中的表达量(***P < 0.001)。
【具体实施方式】
[0015]下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细的说明。
[0016]本发明涉及3 μ g/kg的Resolvin D1对癫痫大鼠的脑保护作用及机制。所述Resolvin D1对氯化锂匹罗卡品诱导的癫痫大鼠有抗癫痫作用，具有抗炎症反应性能，其机制可能为显著增加DEL1表达，降低IL-17含量等途径降低癫痫大鼠体内炎症反应，产生对癫痫大鼠的脑保护作用。
[0017]Resolvin D1具有抗炎反应及抗癫痫作用的实验:
1.病例(样本)选择方法:
人脑脊液及血清:收集2013年12月到2014年12月入住西安医学院第一附属医院神经内科符合入选标准的患者共35人，并分为癫痫组25人和对照组10人。所有患者及家属取得本研究的知情同意，并在24h内进行研究评估，及血清及脑脊液的采集。收集近期(24h内)有癫痫发作的癫痫患者20例，及符合标准的对照组患者20例。
[0018]入选标准:凡24h内因癫痫发作入住我科的患者，发作类型参照1981年国际抗癫痫联盟有关癫痫发作分类的规定进行分类。对照组:因头痛、周围神经系统疾病、原发性痴呆、继发记忆障碍等入住我科各项检查提示没有炎性疾病的患者。所有对照组病人进行神经系统常规检查，并进行后期脑脊液分析。
[0019]排除标准:癫痫发作是由明确病因引起的患者不纳入研究，如电解质紊乱，代谢紊乱，药物中毒，感染，MRI检查提示有新鲜病灶等；腰穿提示脑脊液颜色不清亮或含有血细胞其他疾病待排的标本不纳入研究。
[0020]符合入组标准的患者在癫痫发作后行2%的利多卡因局麻下L3-4或L4-5椎间隙腰椎穿刺术，留取脑脊液5ml，经3000r/min离心20min后留取上清分装，置于_80°C冰箱待后续实验用。血清:空腹肘静脉采血5ml，3000r/min离心20min后留取上清液，分装入小的离心管中，立即放人-80°C冰箱，待后续实验用。
[0021]2.动物模型制备:选择健康雄性SD大鼠(出生后6-8周，体重220_2600g)为研究对象，由动物中心提供，饲养于正常昼夜环境中，给予标准饲料及饮水。采用Costa-Ferro等沿用的方法:a.按127mg/kg的剂量依次腹腔注射氯化锂；b.20h后腹腔注射阿托品(0.1mg/kg)以降低匹罗卡品外周胆碱能反应；c.注射阿托品30min后，按40mg/kg的剂量腹腔注射匹罗卡品；d.半小时后开始观察大鼠癫痫发作的程度(依据Racine分级标准:0.无任何反应；1.面部阵挛，眨眼、动须、节奏性咀嚼等；I1.1级加节律性点头；111.1I级加前肢阵挛；IV.1II级加后肢站立；V.1V级加摔倒)；e.V级发作的SD大鼠随机纳入实验，V级以下或未发作的SD大鼠剔除本实验；f.癫痫持续状态(status epilepticus, SE) 90min后，腹腔注射地西泮(10mg/kg)终止癫痫发作。而生理盐水组大鼠经皮下注射相同剂量的生理盐水。Resolvin D1 (Cayman武汉艾美捷科技有限公司)在癫痫持续状态终止后30分钟经尾静脉给予Aesolvin D1溶解于0.9%的生理盐水，每只大鼠注射总量不超过1ml，在给药后24h进行检测。
[0022]3酶联免疫吸附法(ELISA)测定脑脊液和血浆中DEL-1和IL-17水平:
人DEL-1及IL-17 ELISA试剂品牌均为Cusab1 (武汉华美，中国)，对样品和标准品在450nm波长测量吸光度(0D值)，根据标准品的浓度及对应0D值计算出标准曲线的回归方程，再根据样品的0D值在回归方程上计算出对应的样品浓度。
[0023]4蛋白质印记法(Western Blot)检测脑脊液及大鼠海马区DEL-1水平:
探讨DEL-1在人脑脊液和大鼠海马中的表达水平，我们首先把冷冻标本称重，放入干燥清洁的匀浆器中，加入含有PMSF的RIPA裂解缓冲液，匀浆后4°C离心，12000转/分钟，20分钟，取上清。采用BCA定量测定试剂盒(Bestb1，中国)进行定量检测样品蛋白含量。之后我们使用标准的15%的SDS-PAGE凝胶进行SDS-PAGE电泳，转膜，以5%脱脂奶粉封闭，孵育多克隆兔抗大鼠DEL-1抗体(脑脊液1:1000，脑组织1:2500，武汉三鹰，中国)，室温孵育一小时，4°C过夜，然后用HRP结合的山羊抗兔抗体在室温下孵育一个半小时(稀释1:800，CST，美国)。我们应用β -actin作为内参抗体(稀释度1:300，武汉博士德，中国)，最后进行增强化学发光法定量(Pierce，美国)，X_光片曝光，显影、定影后室温晾干胶片扫描分析灰度值。
[0024]5统计结果分析:
数据以均数土标准差(X土SD)表示。应用GraphPad Prism 6.0统计软件进行统计学分析，实验组和对照组、实验组和实验组之间比较采用方差分析(AN0VA)和t检验。以a=0.05为检验水准，P < 0.05表示差异有统计学意义。
[0025]实验结果:
1.人脑脊液及血浆DEL1和IL-17的表达
DEL1是内源性的抗白细胞粘附因子，图1、图2 (ELISA)和图3 (Western blot)可见，癫痫病人脑脊液及血浆中DEL1的表达显著低于对照组DEL1的水平(P < 0.001)。
[0026]IL-17是癫痫发生发展中重要的炎性介质，图5和图6 (ELISA)可见，癫痫病人脑脊液及血浆中IL-17的表达水平与对照组相比显著增加(P < 0.001)。
[0027]2.大鼠海马中DEL1和IL-17的表达
图4 (Western blot)可见DELI在癫痫持续状态大鼠海马中的表达明显低于正常大鼠(P < 0.001)，且Resolvin D1可显著增加DELI在癫痫持续状态大鼠海马的表达。
[0028]图7(Western blot)可见在IL-17在癫痫持续状态大鼠海马中的表达明显高于正常大鼠(P < 0.001)，且Resolvin D1可显著降低IL-17在癫痫持续状态大鼠海马的表达。
[0029]本发明通过上述实例的研究表明，癫痫发生后人脑脊液、血清及鼠脑组织中内源性抗白细胞粘附因子DEL-1的表达明显降低，炎症因子IL-17的表达明显增加，而ResolvinD1可显著增加大鼠脑内癫痫后DEL1的表达，并且显著降低IL-17的表达，这提示ResolvinD1是DELI的激动剂，也具有拮抗IL-17的功能。本发明对新型抗癫痫药物的研发提供了理论基础，Resolvin D1可成为癫痫治疗的一个新的革巴点。
[0030]本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1.Resolvin D1作为抗癫痫药物的应用。2.根据权利要求1所述的ResolvinD1作为抗癫痫药物的应用，其特征在于: 所述Resolvin D1通过增加内源性抗粘附分子DEL-1的表达、降低IL-17含量而作为抗炎、抗癫痫的药物。
【专利摘要】本发明涉及Resolvin？D1作为抗癫痫药物的应用。Resolvin？D1具有强效的抗炎和促进炎症吸收作用，但其在癫痫导致的脑组织损伤是否有保护作用，目前国内外未见相关报道。本发明提供了Resolvin？D1作为治疗癫痫病药物的应用，所述Resolvin？D1通过增加内源性抗粘附分子DEL-1的表达、降低IL-17含量而作为抗炎、抗癫痫的药物<b>。</b>
【IPC分类】A61P25/08, A61P29/00, A61K31/232
【公开号】CN105287480
【申请号】CN201510709415
【发明人】李亚军, 孟芳霖
【申请人】西安医学院第一附属医院
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年10月28日