专利名称：差分光测量法的制作方法
技术领域：
本发明涉及借助一微量滴定板进行差分光和荧光分析确定物质的相互作用的方法以及使用一微量滴定板进行差分光和荧光分析确定物质的相互作用。
分光确定同一溶液中的物质，在许多领域都发挥着作用，例如在环境分析，基础研究，医学诊断，法学等等领域。在这些确定范围内，确定象核酸，蛋白质，酶，其培养基等等，就是说要证明其存在和／或者确定它们的数量，常常要同时确定不同物质的相互作用。常借助差分光分析或者荧光分析，根据它们所改变的光谱或荧光特性来测定物质间的相互作用。光谱或者荧光的变化要么是由物质彼此间直接的相互作用，要么是由结合导致的结构改变引起的。同样，也可以测定取决于溶媒的结构改变，或者在取决于介质和物质浓度情况下，也可以观察聚集平衡。
差分光或荧光分析测量一般是借助两个串联的透明小容器进行，即一个试样透明小容器和一个基准透明小容器。一个透明小容器包括两个由一垂直布置的隔断隔开的室。差分光或荧光分析测量时，将同一浓度的第一种物质的溶液分别放入试样容器和基准容器的一个室中。另外两个室注入中性溶液。在随后利用一水平透过两个室的光束进行的测量中，两个容器必然出现相同的分光和荧光特性。接着，将一定量的第二种物质加入试样容器中第一种物质的溶液中，并将相同的量加入注有基准容器的中性溶液室，由此平衡配体吸收或者配体荧光。为避免浓度差，必须用相同量的中性溶液与基准容器中的第一种物质溶解。随后，如前面所介绍过的，进行第二次测量并对数值进行比较。基于光谱或荧光非常细微的变化，这种方法对浓度差非常敏感，因此每次加入第二种物质都要根据容积微量选择。测量受物质在中性溶液中的溶解度所限制。最后，在混合物质时必须注意，不要让溶液从室中溢出。
因此，本发明以该技术难题为依据，提供一种克服上述缺陷的方法，特别是将浓度作用降低到最低限度，以提高测量的灵敏度，使之能够对具有较低溶解度的物质进行研究并减少混合引起的误差，以及使快速、可广泛应用的并且因此以较少的费用测定物质的相互作用成为可能。
本发明通过提供一种方法解决了该技术难题，即借助于一有大量小皿的微量滴定板，确定至少两种不同物质的差分光和荧光的相互作用，微量滴定板配有一带有至少一个配合小皿的凹穴的盖，并且第一种物质的第一种溶液置入一个小皿中，第二种物质的第二种溶液置入配备给该小皿的凹穴，而且含有第一种和第二种物质混合物的第三种溶液置入其他凹穴和／或者其他小皿，以致于随后可以借助电磁波对注满的凹穴和小皿的垂直照射进行差分光和／或者荧光分析。为进行这些分析，可以使用传统的光度计和荧光计，也就是ELISA或MTP读数器。由此本发明规定，在一微量滴定板被称为基准范围的范围内，两种不同的物质分开且垂直重叠布置，而物质的混合物被限定在微量滴定板的试样范围内，可同时进行测量。
如果第一种物质与第二物质产生相互作用，使光谱和／或者荧光的特性发生改变，那么第三种溶液也就是两种溶液的混合物中的至少一种物质的消光系数或者荧光特性与两种分别置放的溶液相比会出现变化。消光系数的这些改变可以归结为是物质的相互作用以及物质特性和物质结构的结果。如果没有相互作用或者处于零点平衡，则消光系数或者荧光特性不变。
在本发明为微量滴定板的小皿和盖的凹穴优选的相同的几何图形中，只要没有溶液置入，试样范围内的吸收，就是说在接受第一种和第二种溶液的混合物凹穴所处的微量滴定板的范围内，和基准范围即在第一种和第二种溶液在凹穴和小皿中分开相互重叠布置的微量滴定板范围内是相同的。如果每个小皿和／或者凹穴的几何图形是不同的，那么分析时必须同时考虑几何因子。
在一特别优选的实施例中，本发明涉及一上述产生第三种溶液的方法，它是将第一种物质的溶液与第二种物质的溶液相混合，在这种情况下，用于制备第三种溶液所使用的两种溶液的体积和／或者物质浓度各与第一种和第二种溶液的相等。
在另一个优选的实施例中，本发明涉及一种基于上述方法的方法，处于小皿或凹穴中的第三种溶液的层高等于处于小皿和凹穴中的第一种和第二种溶液的层高之和。
本发明在另一优选实施例中规定，所注入的第一种、第二种和／或者第三种溶液的层高标准化，就是说，依据本发明，通过使用一带有至少一个凹穴的盖，避免由于不同的溶液注入层高形成半月面或测量误差，该凹穴的底部在从小皿的底部到布置在其上的凹穴的底部的小皿中提供一确定距离的光程。
本发明规定使用一带有大量小皿的微量滴定板，该微量滴定板至少部分被一个盖所遮盖，该盖具有至少一个配给一个小皿的凹穴。这类的试样载体系统在其主要特征上，例如在DE 4405 375 A1中有所介绍，这类试样载体系统的制造和结构一并列入本公开内容中。
本发明因此使用一试样载体系统，该系统包括两个部件，即一个微量滴定板和一个配备给该微量滴定板的盖。
该盖包括至少一个带有一个或数个侧壁和一个底部的凹穴，优选为多个凹穴，它们各自由数个侧壁和一个底部构成并通过一个底板和／或者一个框部件相互连接。盖可以部分或全部遮盖微量滴定板，可以规定，只有盖的范围含有配给小皿的凹穴，盖的其他范围为平面。盖这样配置给微量滴定板，例如它可以插在或平放在该微量滴定板上，盖的凹穴从上面凸入微量滴定板小皿的开口中或嵌入其中。但盖也可以打开并合上，例如借助于合页，安装在微量滴定板上，与其构成一体或与其呈永久固定布置，在后两种实施例中规定各有一个注入口用于小皿的填充。
在一实施例中可以规定，盖只有一个由底部、侧壁和可选择配设的环形弯曲边或凸缘构成的唯一的凹穴，盖的底板平面全部或者部分遮盖微量滴定板的其他部分。带有唯一凹穴的这种盖可以与各种微量滴定板组合使用。在使用带有传统的小皿形状的微量滴定板或新型微量滴定板的相应造型的小皿的情况下，盖的上边缘或凸缘作为微量滴定板的支承面使用。在微量滴定板具有新型相应造型小皿形状下，本发明的盖的底也可用作微量滴定板上的支承面。
盖的底板可以构成腹板和／或者优选由全部或部分包含微量滴定板的框部件构成，框部件的作用是将盖插在微量滴定板上并使盖在微量滴定板上保持固定。盖可以以排的形式设置凹穴，就是说，由一个接一个布置的凹穴构成。但也可以规定，盖以矩阵形式设置凹穴。本发明当然也规定，这种类型的盖只遮盖例如微量滴定板的一排范围，也就是说配备给该板范围。据此，一个小皿排可以配备一个呈排形式的盖。但也可以规定，一个例如呈矩阵结构的微量滴定板配备一个呈矩阵结构的盖，遮盖微量滴定板上的全部小皿。盖的具体构成根据所使用的传统的还是新型的微量滴定板的形状而定。
特别优选的方法是使用一个微量滴定板盖，它的一部分平面遮盖微量滴定板的一部分小皿，也就是说无凹穴，并由此构成处于其下的微量滴定板的一个试样区，盖的另一部分包含配备给各个小皿的凹穴并遮盖微量滴定板的基准区。在微量滴定板的试样区，也就是试样的不允许重叠布置的确定位置，注入第三种溶液也就是第一种和第二种物质的混合物，而第一种和第二种溶液可以分别注入凹穴凸入的彼此分开重叠布置的基准区的小皿中。
不言而喻，也可以规定一个盖，它在微量滴定板的试样区内有凹穴。在这种情况下，依据本发明也可以规定，第三种溶液只注入盖的凹穴中，并不注入小皿中或者注入两者中，也就是说，注入小皿和配备给它的凹穴中。
依据本发明所使用的盖的特征是，它给每一个小皿提供一个凹穴，小皿配备给该凹穴，凹穴的底部布置在小皿开口的里面或上面，并在小皿的底部和凹穴的底部之间提供一确定的间隙或距离，它部分或全部填充试样液体。据此，以有益的方式提供所要研究的试样的一确定的层厚或层高，这是因为不受注入高度和半月面形成的影响，光束垂直在试样内部经过一确定的行程。因此凹穴必须如此构成，即决不会让小皿中的试样液体进入凹穴，就是说凹穴向下和侧面液体密封并据此被例如整体相互构成的侧壁和一底部所封闭，有益的方式是向上保留一个开口。凹穴的尺寸和几何形状是任意的，具体取决于小皿的尺寸和几何形状。依据本发明也可以规定，盖的凹穴例如构成一具有注入口的各面均封闭的空心体。
微量滴定板小皿的净高度，就是说从小皿底到其上边缘的距离，因嵌入小皿的凹穴的底部减少。由于可以有益的方式规定，盖的全部或许多凹穴具有同小皿一样的尺寸和几何形状，所以考虑到垂直穿透小皿的光束的行程长度，由凹穴的底部所部分遮盖的全部小皿标准化，就是说层厚或层高在所有被遮盖的小皿中的完全注满的小皿或凹穴中由垂直穿透的光束全部测量到的距离置于统一规格，由此消除注入高度或半月面形成中可能存在的差异。在这种情况下，可以特别有益的方式规定，小皿的横截面积，也就是与注入高度垂直的面积，在凹穴的底部所布置的小皿的面积大于凹穴底部的面积。结果，该底部并未遮盖其开口上小皿的整个净宽度，而是只遮盖其中一部分，以致于存在于该小皿中的试样液体可以向上排出，尽管如此仍保证了与其长度相关的标准化了的光程。
本发明中，微量滴定板可以理解为一块具有许多小皿的板，这些小皿用于容纳进行分光或荧光分析的试样。这些板和小皿相互构成整体，但也可以规定，这些小皿作为单独的单元或作为组合单元可拆式或不可拆式布置在一快板上和／或者一个框部件中。据此，板和／或者框部件作为透明小容器或小皿或者容器单元或容器组件的支架。这些小皿可以是普通的凹穴、阱、凹地、透明小容器、小管等等，其截面形状同样是任意的并据此例如可为圆形、多边形、四方形、矩形或椭圆形。每个微量滴定板的小皿的数量可为任意的，一般来说，以矩阵形式布置的小皿，例如采用96，384或1536个小皿构成。
本发明中，一块微量滴定板也可以理解为小皿成排布置的一种装置，就是说非矩阵形式的，据此例如具有8个小皿的板或者具有8个小皿各通过腹板相互连接的板同样可以称为微量滴定板。微量滴定板的小皿一般具有向上的开口，以致于可以注入试样。这些小皿侧面通过侧壁、向下通过底部构成，这些元件可以相互呈整体结构。
本发明中，一种物质可以理解为一种分析物，它可借助于分光或荧光法确定，也就是证实和／或者确定数量，也就是起到发色体的作用。这种类型的分析物可以是例如蛋白质，肽，蛋白质或肽的衍生物，金属络合物，配体，色素，核酸或低分子量或大分子量的化合物。本发明所使用的微量滴定板可由任意材料构成，例如聚氯乙烯，聚苯乙烯，聚丙烯，石英玻璃或类似材料。不言而喻，也可以规定使用带有涂层小皿的微量滴定板。
本发明提供一种可广泛应用的，快速的，同时进行的并因此是费用低廉的研究不同物质的相互作用的方法。因此，优点是可以分析具有短半衰期物质的特性。另一个优点在于，将降低灵敏度的浓度作用降到最低限度并可以对具有较低溶解度的物质进行更好的研究。最后，还可减少在传统方法中因混合出现的误差。
本发明还涉及一种前面介绍过的微量滴定板，也就是具有许多小皿的微量滴定板，该微量滴定板配备有一带至少一个分配给一个小皿的凹穴的盖，并且该盖包括具有至少一个凹穴的盖底板和一个优选主要是平面的盖顶板，并且盖顶板可相对盖底板垂直移动，并遮盖盖底板中的凹穴。这种类型的装置的优点是，无论是微量滴定板的小皿中还是盖的凹穴中都可以使确定的层高成为可能。
本发明还涉及带有一个盖和许多小皿的微量滴定板的使用，该盖具有至少一个配备给一个小皿的凹穴，以实施差分光或差分荧光分析物质相互作用的方法，在优选的方式中，盖由两个垂直相对移动的板构成，其中下板含有凹穴。
以下借助下面的实施例和附图对本发明作更为详细的说明。
附图中
图1是本发明使用的带盖微量滴定板一部分的垂直断面图，图2是本发明使用的另一实施例的带盖微量滴定板一部分的垂直断面图，图3是本发明使用的又一实施例的带盖微量滴定板一部分的垂直断面面，图4是本发明使用的另一实施例的打开和封闭状态下的带盖微量滴定板一部分的垂直断面图。
下文中结构或功能相同的部分以相同的标号标示。
图1为带有盖1的微量滴定板2。微量滴定板2具有向上敞开的圆柱形小皿11，每个小皿都由一个底部13和侧壁15构成。盖1具有至少一个配备给一个小皿11的圆柱形的向上敞开的凹穴17，凹穴17具有一底部21和侧壁19。所示的还有与未标示的其他凹穴17相连的盖1的底板23，用来保证凹穴17在小皿11中精确定位或配置。盖1的这种结构，使至少一个小皿11由一平面的没有凹穴的面25所遮盖，而另一个小皿11容纳盖的凹穴17。在盖1置放在微量滴定板2上时，图1左侧的小皿4中因此形成两个垂直重叠布置的室，即小皿11的下部内空间以及凹穴17的内空间。凹穴17在小皿11的内空间中的这种布置，可分别盛装溶液并称为基准区6。在盖1平面布置并且没有凹穴凸入处于其下小皿11内空间内的微量滴定板2的范围内，在小皿11的内空间内没有形成分离的隔室，该范围称为试样区7。
试样区7中的小皿11的内空间在整个高度和内周边上有一侧壁加强壁28。这一加强壁将该内空间的横截面积减小到等于基准区6的小皿11中内空间下部的横截面积。
所示的还有在基准区6中小皿11内空间的下部区域内，一环绕整个小皿内部范围的侧壁加强壁27。这一加强壁的作用是使小皿11内空间下部范围内的横截面与布置在其上面的凹穴17的横截面同样大。
根据本发明的方法，为确定A和B两种物质的相互作用，将物质A的溶液3置入盖1的凹穴17中，并将物质B的溶液4置入凹穴17下面的小皿11的内空间中，选择溶液4的容积，使液体上沿处于凹穴17的底部21的下面。在试样区7中，就是说没有配备凹穴17的小皿11中，注入含有物质A和B溶液混合物的第三种溶液5，选择其容积、浓度和其他参数与基准区6中的溶液所使用的相同。由于试样区内凹穴和小皿几何形状相同，产生一层高，它与基准区6内溶液3和4相加的层高相等。被光束穿过的玻璃或塑料底层的数量和厚度以及溶液外面全部测量到的光程，在试样区和基准区中是相同的。在将试样区7中的溶液进行必要的混合后，现在可以借助一分光光度计，例如MTP-读数器，或一荧光测量仪，垂直从下向上或从上向下(见双箭头)，将基准区6和试样区7的光谱或荧光特性进行分析比较，分析物质A和B的相互作用。如果基准区6中垂直测定的隔离的第一种和第二种溶液3和4的荧光或分光特性与处于试样区7中的相同，那么没有相互作用，否则物质A和B有相互作用。
图2所示的本发明方法的微量滴定板2及其盖1大体上与图1的装置相当。与图1的不同之处在于，在这里试样区7与基准区6没有区别，就是说，盖1在其整个范围内结构是相同的，以致于每个小皿11均配有凹穴17，该凹穴凸入小皿11的内空间中。基准区6和试样区7仅由小皿11和凹穴17的注入方式确定。微量滴定板2的基准区6为试样A和B的溶液3，4分别测定且垂直叠置的地方，即小皿11内空间的下部范围内和处于其上的凹穴17的内空间中。微量滴定板2的试样区7处于作为溶液3和4的混合物的第三种溶液5注入的地方。它可以是内径11的下部范围及配备给该小皿11的凹穴17。也可以将第三种溶液5分开注入到凹穴17和小皿11中。这里也是用双箭头表示光束对微量滴定板的主表面垂直照射。
图3所示为本发明所使用的微量滴定板2及其盖1的另一个实施例，与图1和图2装置的差别在于所使用的小皿11和凹穴17从上向下变小，就是说，它们各自的底部21和13的横截面小于其内空间上部范围的横截面。
图4所示同样为微量滴定板2及盖1，图4的左边所示为在盖1还未放到微量滴定板2上的状态下的该装置，而右边为盖1放到了微量滴定板2上。这种微量滴定板有一双体盖1。
微量滴定板2基准区6中的圆柱形小皿11有一侧壁加强壁29，环绕其向内进入内空间范围的下部区域，它向上一直延伸到小皿11大致一半的高度。在微量滴定板2的试样区7内，同样有一圆柱形小皿11的这种类型的侧壁加强壁31，它向上几乎延伸到微量滴定板2的上沿55的上面。在两种情况下，侧壁加强壁29或31的作用是缩小内径。在其上部接触区域内，两个加强壁29和31有环形缓冲槽或缓冲床39和41。
盖1由两部分构成，即由盖底板1b和布置在其上面的、至少在垂直方向上可移动的平面盖顶板1a组成。板1a和1b可通过螺丝、卡子、合页或类似装置相互连接。板1a也可只放在盖底板1b上。盖底板1b构成圆柱形凹穴17，也就是其侧壁19和底部21。凹穴17被一由环形壁42与凹穴隔开的环形缓冲床35包围。底部21的横截面与小皿11底部13内空间的横截面相等。在盖底板1b的另一个区域内没有凹穴17，而是用一平面37代替。
盖1这样置放在微量滴定板2上，也即，使凹穴17凸入处于基准区6内的小皿11的内空间中，也就是其加强壁29只达到其高度一半左右的小皿11中。盖底板1b的平面区域17在试样区7中关闭或平放状态下，小皿11的内空间向上关闭，其加强壁31一直延伸到略高于微量滴定板2底板23的上部边缘55。
如果现在将溶液3注入基准区6的凹穴17，将溶液4注入基准区6中的小皿11内空间的下部区域，并将第三种溶液5注入另一个小皿11的试样区7中，然后放上盖，凹穴17的底部21直接置于小皿11下部范围内的加强壁29的上沿57上，假如注入足够的试样溶液4，关闭或阻止有干扰的半月面形成和注入高度不同。由此提供一确定的层高。没有标出的其他小皿11中的结构相同的布置使层高的标准化成为可能，并由此减少测量误差。在注入试样或放盖时可能压出的试样液体4被导入加强壁29上部区域内环形的缓冲床39内。同样，在封闭状态下，盖底板1b的平面37放在试样区7中小皿11的加强壁31的上部边缘59上，以此阻止在适当的注入高度下形成半月面和不同的注入高度并保证确定的层高。可能压出的第三种溶液5被导入加强壁31上部区域中的环形缓冲床41中。在封闭状态下，盖顶板1a放在盖底板1b上并可以固定，盖顶板1a利用壁42的上部边缘43关闭，并在注完时阻止有干扰的半月面形成和不同的注入高度。可能压出的试样液体3被导入盖底板1b中环绕凹穴17布置的缓冲床35中。按照这种方式光穿过隔离的溶液3和4以及第三种溶液5，而不受不同注入高度或半月面形成引起的误差的影响。
这样，图4的装置使无论是在基准区6还是试样区7中实施带有标准化层高的本发明的方法成为可能，并且因此特别适合于进行可进行对比的和精确的差分光或荧光测量。通过两体式盖1使在盖1的凹穴17中也能实现层高标准化，这被证明是特别有益的。本发明的方法在使用该装置情况下，也就是使用带有例如一平板1a的装置在盖1的凹穴17中进行层高标准化的情况下，非常有益并特别适合于自动化分析。
权利要求
1．借助一具有大量小皿的微量滴定板对至少两种不同物质的相互作用进行差分光或荧光分析的方法，其中，所述微量滴定板配备有一盖，该盖带有至少一个配备给一个小皿的凹穴，将第一种物质的第一种溶液注入一第一小皿中，第二种物质的第二种溶液注入配备给该小皿的凹穴中，并且将含有第一种和第二种物质的混合物的第三种溶液注入另一个凹穴和／或者小皿中，随后，借助电磁波的垂直照射穿过小皿和凹穴来进行差分光或荧光分析。
2．按权利要求1所述的方法，其中，通过将第一种物质的溶液与第二种物质的溶液相混合而制成第三种溶液，在这种情况下，两种溶液的容积和／或者物质浓度各与第一种和第二种溶液的相等。
3．根据前述权利要求之一所述的方法，其中，小皿和／或者凹穴中第三种溶液的层高等于小皿和凹穴中第一种和第二种溶液的层高之和。
4．根据前述权利要求之一所述的方法，其中，将所注入的第一种、第二种和／或者第三种溶液的层高标准化。
5．一装置，特别是实施权利要求1至4所述的方法所用的装置，它包括一具有大量小皿的微量滴定板(2)，该微量滴定板(2)配备有一盖(1)，该盖带有至少一个配备给一个小皿(11)的凹穴(17)，盖(1)具有一盖底板(1b)和盖顶板(1a)，所述盖底板(1b)包括所述的至少一个凹穴(17)，并且盖顶板(1a)可相对于盖底板(1b)垂直移动。
全文摘要
本发明涉及借助一包括大量小皿的装置进行分光和荧光测量以分析物质间相互作用的方法。
文档编号B01L3/00GK1294678SQ00800147
公开日2001年5月9日 申请日期2000年2月11日 优先权日1999年2月15日
发明者赫尔维希·布鲁纳, 于尔根·伯恩哈根, 弗兰克·菲茨图姆 申请人:弗劳恩农场主协会应用研究开发E.V.