专利名称：在微流体装置中产生热熔化曲线的方法和设备的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物材料微流体装置上的表征。更具体地，本发明的 实施方案涉及在微流体装置上测定生物材料的热特性。
背景技术：
进行化学或生化分析、测试、合成或制备时，对待测试的物质或 成分进行大量分开的操作，包括测量、等分、转移、稀释、混合、分 离、检测、培养等。微流体技术使这些操作小型化并将它们整合，使 得可以在一个或几个微流体装置中进行这些操作。
例如，已经研发了在微粒体系统中进行生物测试的初创微流体方
法，如Parce等在发明名称为"微量流体装置中的高通量筛逸测试系 统"的U. S.专利No. 5， 942， 443中以及Knapp等在发明名称为"闭环 生化分析仪，，的PCT公开No. W098/45481中所述的那些。此外，Stern 在U. S.专利No. 6， 670. 153中已经开发了用于进行温度介导反应的微 流体装置。
在许多科学领域中特别关注的一种生物测试是检测和定量各种分 子间的结合。例如，筛选各种化合物或分子以测定它们怎样相互结合 或它们怎样结合特定的目标分子在许多研究领域中是非常重要的。例 如，在药物研究中常常使用筛选大的分子文库。可以相对于特定的受 体筛选"组合"文库(其包括所产生的化合物的集合)来测试可能的 配体的存在以及来定量任何可能的配体的结合。
存在各种方法来表征分子之间的结合。这些方法中的许多涉及量 热分析。等温量热法(ITC)和差示扫描量热法(DSC)是这些方法的 实例。通过测量结合反应的热参数，量热法可以用来测试分子间结合 的存在，通过检测另一个分子结合一个分子时发生的分子热变性位移。可以通过指示剂染料的荧光来监控分子的热变性位移(这可以为分子 熔化曲线中所表示的)，该指示剂染料仅结合选择的分子构象状态。 或者，在一些情况中，可以通过分子之一的内在荧光的改变来测定分 子之间的结合。
分子间结合的表征在核酸的表征中也是一种重要的工具。例如，
Knapp等在发明名称为"用于高通量遗传分析的系统"的U.S.公开的 申请No. 2002/0197630中讨论了使用熔化曲线分析来检测单核苷酸多 态性(SNP)。分子熔化曲线(和分子熔化曲线之间的差异)还可以用 来检测和分析核酸之间的序列差异。例如，可以通过测量热参数、指 示剂染料/分子的荧光、荧光偏振、介电性能等来监控核酸的热变性曲 线。
本领域受欢迎的其他方法将是可以在微流体装置上进行快速结合 测试的方法，该方法使用最少的化合物和试剂。本发明通过提供使用 分子熔化曲线进行结合测试的方法和微流体装置，描述并提供了这些 和其他特征。根据以下的综述，本发明的这些和其他特征将更清辨。
发明概述
本发明提供了使用分子熔化曲线在微流体装置中进行结合测试的 方法、系统、试剂盒和设备。可以将待测试的分子流过装置中的微通 道，任选分子在其中暴露于其他的分子组成，例如，荧光指示剂分子 和/或待测试分子的结合伴侣。然后将涉及的分子加热(和/或冷却) 并在一定的温度范围内测量分子的可检测特性。从所得到的数据，构 建热特性曲线，这使得可以测定和定量所涉及分子的结合亲和性。
在一个方面中，提供了在微流体装置中产生至少一种分子的热特 性曲线的方法。该方法包括使分子流入微通道中，加热微通道中的分 子，在加热过程中检测分子的至少一种可检测特性，和，从该数据产 生分子的热特性曲线。所提供的方法包括观察一种或多种分子的至少 一种物理特性的变化，例如，荧光，这是由例如打开或变性或由分子 的一个或多个其他的物理特征的改变而引起的，这是响应温度的改变并且作为结合的结果。
该方法适用于各种类型的分子相互作用，包括蛋白、酶、核酸(双 链或单链的)、配体、肽核酸、辅因子、受体、底物、抗体、抗原、 多肽等与一种或多种其他的分子或部分的那些作用。本发明的方法还 适用于包括两种或多种分子的复合物的分子，例如，与第二种酶、配 体、肽核酸、辅因子、受体、底物复合的酶，或其他这样的组合。
在本发明的方法中，流动通常包括，例如，通过微流体装置的至 少一个微通道来传送目标分子。可以通过动电学、使用正压或负压、 通过动电学以及正压或负压、通过重力、通过毛细管作用、通过由展 开膜转移流体或通过向心力来进行这种流动。流动可以包括分子同时 或按序通过一个或多个微通道的传送。或者，本发明的方法可以使第 一种分子通过一个微通道，而使一种或多种其他分子通过第二微通道， 例如，其中各种微通道相互交叉。
根据本发明的方法中，加热包括将分子的温度升高，持续选定的
时间段。该时间段可以为，例如，约0. 1秒钟至约1. 0分钟或更长， 约0. 1秒钟至约10秒钟或更长，或约0. 1秒钟至约1. 0秒钟或更长，
包括之间的所有时间段。任选，加热可以包括在第一分子接触第二分 子后选定的时间点升高分子的温度。该选定的时间点可以是将第一分
子流入微通道后的例如约0. 1秒至约1. 0分钟或更长，约o. 1秒至约 IO秒或更长，或约0. l秒至约l.O秒或更长(包括之间的所有时间段)。
此外，方法中的温度控制可以将分子的温度设定至选定的温度，可以
是例如约10。C至约100'C或更高，约10r至约90'C或更高，或约10 。C至约60。C或更高(包括中间的所有时间段)。
根据本发明的其他方法中，加热包括通过连续提高分子的温度来 升高分子的温度。例如，可以以o. rc/秒至rc/秒范風的速率来连续 提高分子的温度。或者，可以以更慢的速率来连续提高分子的温度， 如o. orc/秒至o. lx:/秒范围的速率，或以更快的速率来连续提高分 子的温度，如rc/秒至io'c/秒范围的速率。
加热分子任选包括通过焦耳加热、非焦耳加热，或焦耳加热和非焦耳加热两者来升高微通道中的分子的温度。在一个实施方案中，通 过将可选择的电流流过微通道来进行焦耳加热，因此将温度升高。可 以在微通道的整个长度或微通道的选定部分进行焦耳加热。通过使可 选择的电流流过微通道的第一部分和第二部分将焦耳加热应用于选定 的部分，其中第一部分包括第一横截面，而第二部分包括第二横截面。 此外，第一横截面的大小大于第二横截面的，并且因此使用可选择的 电流时，温度高于第一横截面的。通过改变可选择的电流、电阻或电 流和电阻两者来控制焦耳加热的水平。用于焦耳加热的可选择电流可
以包括直流电、交流电或直流电和交流电的组合。参见，例如，U.S. 专利No. 5,965,410。
任选，本发明的方法中所用的加热包括非焦耳加热，例如，通过 使用内部或外部热源。在一个实施方案中，内部或外部热源包括热加 热板。正如焦耳加热一样，非焦耳加热任选在微通道的整个长度或在 微通道的选定部分进行。例如，可以将微通道的一个或多个片段接近 一个或多个加热部件。
根据本发明的加热方法还包括使用沿着一部分微通道长度的温度 梯度。将微通道长度一端的温度控制于第一选定的温度，而将长度另 一端的温度控制于第二选定的温度，因此形成跨越第一和第二选定温 度之间的温度范围的连续温度梯度。 一旦建立了流体通过微通道部分 的稳定状态流，将在该流体内建立温度梯度。使用焦耳加热时，可以 通过构造沿着长度的橫截面面积连续且单调地改变的通道从而沿着微 通道的长度来建立温度梯度，然后通过该长度使用单个电流。使用非 焦耳加热时沿着微通道长度建立温度梯度的一种方法是将热板接触微 通道，并使用加热或冷却部件以对应于微通道长度方向的方向来建立 穿过热板的温度梯度。
在本发明的另一个方面中，检测所涉及分子的特性的方法包括检 测作为结合相对量函数而改变的分子的荧光水平或从分子发射的光。 在一种构象中，荧光的检测涉及第一分子和第二分子，其中第一分子 是荧光指示剂染料或荧光指示剂分子，且第二分子是待测试的目标分子。在一个实施方案中，荧光指示剂染料或荧光指示剂分子通过结合 第二分子上的疏水性或亲水性残基结合第二分子或与第二分子相连。 检测方法任选进一步包括激发荧光指示剂染料或荧光指示剂分子来形 成激发的荧光指示剂染料或激发的荧光指示剂分子，并测定和测量激 发的荧光指示剂染料或荧光指示剂分子的发射或熄灭情况。
在涉及荧光检测方法的说明性实施方案中，涉及包括蛋白或多肽 的分子。在该实施方案中，检测方法进一步需要激发蛋白质或多肽中 的氨基酸残基如色氨酸，由此形成激发的色氨酸残基。将鉴别和测量 激发的色氨酸残基的发射或熄灭情况用来检测待测试分子的特性。
除了荧光或发射的光检测以外，或与荧光或发射的光检测分开， 检测待测试分子的特性可以任选包括使用例如荧光光谱学，包括例如
荧光偏振、荧光共振能量转移(FRET)、荧光寿命成像显微术、分子 信标、荧光相关谱技术(FCS)、圆二色性等。相似地，可以监控涉及 微通道中分子的系统的热参数的变化(例如，检测和测量热容量的变 化)。此外，可以跟踪和测量介电性能的变化。另一种检测待测试分 子的特性的方法包括监控分子的吸光率。
本发明方法的另一个方面包括产生热特性曲线。产生热特性曲线 的一个实施方案包括提供一个含有荧光指示剂染料或荧光指示剂分子 的分子，和至少第二含有酶、配体、肽核酸、辅因子、受体、底物、 蛋白质、多肽、核酸(双链或单链的)、抗体、抗原或酶复合物中的 一种或多种的分子。测量在作为温度的函数的第二分子存在下的第一 分子的荧光，并将所得到的数据用来产生热特性曲线。
产生热特性曲线的另一个实施方案包括测量一个分子的荧光变 化，该变化与另一个分子由于温度的改变而引起的物理特性的变化相 关或成比例。再一实施方案包括产生热特性曲线对照曲线，通过测量 在作为温度函数的第二分子存在下的第一分子的荧光，其中第一分子 是荧光指示剂染料或分子，而第二分子是蛋白质、多肽、酶、酶复 合物、核酸(单链或双链的)、配体、肽核酸、辅因子、受体、抗体、 抗原或底物。
12在另一个实施方案中，本发明的方法包括从第一分子上的色氨酸 的荧光产生热特性曲线，当第一分子是在第二分子存在下时，第一分 子包括含色氨酸蛋白、多肽、酶或酶复合物，第二分子包括酶、配体、 肽核酸、辅因子、受体、底物、蛋白质、多肽、核酸(双链或单链的)、 抗体、抗原或酶复合物。测量作为温度的函数的第二分子存在下时， 第一分子中存在的色氨酸残基的荧光，并将所得到的数据用来产生热 特性曲线。在本发明的实施方案中，产生热特性曲线的其他要素包括 测量笫二分子的熔化温度。任选，色氨酸残基的焚光变化与由温度改 变引起的笫二分子的物理特性的变化相关或成比例。任选，通过测量 作为温度的函数的第二分子不存在下的笫一分子的色氨酸残基的荧光 来产生热特性曲线对照曲线。
再一个实施方案中，根据本发明的方法包括产生热特性曲线，其 中第一分子和至少第二分子是蛋白质、多肽、酶、酶复合物、核酸(双 链和单链的)、配体、肽核酸、辅因子、受体、抗体、抗原或底物。 在这些实施方案中，当第一分子在至少笫二分子的存在下时，产生热 特性曲线包括测量作为温度的函数的系统的热参数的变化，该系统包 括微通道中的分子。其他实施方案需要产生对照曲线，通过在第二分 子不存在下测量系统的总的自由能作为温度的函数的变化。
在任选的实施方案中，本发明包括在微流体通道中建立基准温度 的方法，通过产生已知Tm的分子的热特性曲线，这些分子例如，生物
素、生物素-4-焚光素、焚光素生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素 蛋白、中性链亲和素，或已知序列和/或Tm的互补双链核酸(其任选 在每条链上不同标记，如在FRET供体/受体-淬灭剂对中，或另外标记 来表示转换至单链状态)。
在另一个方面中，本发明包括微流体系统，该系统包括具有体结 构的微流体装置，该体结构含有至少一个流体微通道；流体导向系统， 用于可控制地将试剂转移至微通道并通过微通道；用于可控制地加热 微通道中的试剂的至少一个能量源；流动结合微通道的荧光指示剂染 料或荧光指示剂分子的来源；流动结合微通道的待测试的一种或多种样品分子的来源；荧光指示剂染料或荧光指示剂分子的激发源；邻近 体结构的检测仪，用于检测一种或多种样品分子的物理特性的变化； 和，可操作地连接检测仪的计算机，其含有用于从检测仪获取数据和 用于从数据构建热熔化曲线和对照曲线的指令集。
在另一个实施方案中，本发明的集成系统或微流体装置包括流体 定向系统，其在运作过程中可控制地决定待加入微通道的一种或多种 试剂的选择；待加入微通道的一种或多种试剂的含量；将一种或多种 试剂加入微通道中的时间；和将一种或多种试剂加入微通道中的速度。
在另 一个实施方案中，本发明的集成系统或微流体装置包括至少
一个能量源，其在运作过程中升高微通道中的分子的温度，通过焦耳 加热、非焦耳加热或焦耳加热和非焦耳加热两者。
本发明的集成系统或微流体装置中的焦耳加热包括将可选择电流 流过至少一个微通道，因此将温度升高。可以在微通道的整个长度均 匀地使用焦耳加热，或在微通道的不同部分以不同的水平使用焦耳加 热。不同地加热微通道的不同部分的一种方法包括将可选择的电流流 过至少微通道的第一部分和通过至少微通道的第二部分，其中微通道 的第一部分包括第一横截面面积，而微通道的第二部分包括第二横截 面面积。第一横截面面积通常大于第二横截面面积，使得第二截面具 有比第一截面高的电阻，并且因此在施加可选择的电流时，其内比第 一部分中具有更多所产生的热量。或者，通过连续而单调地改变通道 的横截面面积来建立跨越通道长度的温度梯度。通过改变通道中流体 的可选择电流、电阻或电流和电阻两者来控制焦耳加热的水平。可选 择电流可以包括直流电、交流电或直流电和交流电的组合。
任选，本发明的集成系统或微流体装置包括通过内部或外部热源 的非焦耳加热。在一些实施方案中，内部或外部热源可以包括一种或
多种热加热板、珀尔帖装置、电阻加热元件、热电冷却器、通过传导 或对流转移热量的气体或液体。如同焦耳加热一样，非焦耳加热任选 可以沿着微通道的整个长度产生均匀的温度、在微通道的不同部分内 产生不同的温度，或沿着微通道的长度连续地改变温度。在本发明的另一个实施方案中，集成系统或微流体装置任选提供 至少一个荧光指示剂染料或荧光指示剂分子，其能够结合另一个分子 的一个或多个疏水性氨基酸残基、 一个或多个亲水性氨基酸残基，或 其组合。例如，荧光指示剂染料或荧光指示剂分子包括，例如，
l-analino-萘-8-磺酸盐。在另一个实施方案中，荧光指示剂染料或荧 光指示剂分子可以插入或通过另一种机理结合一个或多个核酸聚合 物。在另一个实施方案中，荧光指示剂分子包括至少一个色氨酸残基。
在各种实施方案中，根据本发明的集成系统或微流体装置可以包 括高通量形式、低通量形式或多元形式。在本发明的许多实施方案中， 用于激发荧光指示剂染料或荧光指示剂分子的激发源包括光源。例如， 光源可以包括钨-卣素灯、氙-电弧灯、汞灯、激光、LED或光导纤维 电缆中的一种或多种。集成系统的一些实施方案在沿着微流体装置中 的微通道长度的多个位置包括光源阵列来激发荧光。
在一些实施方案中，集成系统通过产生已知Tm的分子的热特性曲 线来测定系统内微流体装置的微流体通道中的基准温度，这些分子例 如，生物素、生物素-4-荧光素、荧光素生物素、抗生物素蛋白、链霉 抗生物素蛋白、中性链亲和素，或已知序列和/或Tm的互补双链核酸 (其任选在每条链上不同标记，如在FRET供体/受体-淬灭剂对中，或 另外标记来表示转换至单链状态)。
根据本发明的集成系统可以包括以下的一种或多种类型的光学检 测仪光纤探头、电荷耦合器件、荧光成像相机、光电倍增管、光敏 二极管或荧光偏振传感器。该系统还可以包括光学检测仪阵列来测量 沿着微流体装置中的微通道长度的多个位置发射出来的光学信号。此 外，根据本发明的集成系统可以包括一种或多种以下类型的测温仪 接触性测温仪，如热电偶、热电阻测温仪或热敏电阻器；或非接触性 测温4义，如IR温度计或光学高温计。该系统还可以包括一系列测温仪 来测量微流体装置中沿着微通道长度的多个位置的温度。光学检测仪 任选具有检测激发的荧光指示剂染料或分子的荧光或发射光的能力， 或任选具有检测系统的热参数变化的能力，该系统在至少 一个微通道中含有分子。
用于进行一个或多个目标独立性和/或目标依赖性测试来产生本 发明的预筛选文库的试剂盒也是本发明的特征。
附图简述
图1,图A、 B和C，是包括本发明元件的微流体系统实例的示意
性顶^见图、侧视图和透视图。
图2是包括计算机、检测仪和温度控制器的系统的示意图。
图3是说明由于例如配体的结合引起的位移的示例性热特性曲线
的模拟图。
图4，图A和B，是能够用于构建热特性曲线的微流体芯片的示意 性实例。
图5是从双链寡核苷酸的热解离产生的图，显示了在一定温度范
围内发射的荧光。
图6是从双链寡核苷酸的热解离产生的数据构建的热特性曲线。
图7是根据本发明的微流体装置的示意图。
图8显示了测量温度和荧光信号随时间的变化。
图9A-9C用示意图表示了可以用于本发明的一些实施方案中的微 流体系统的一部分。
图IO显示了能够进行连续流动PCR，接着扩增子的熔化曲线分析 的微流体装置。
图11A-11D显示了与图10的微流体装置相接的集成系统的一部分。
图12A-12B显示了使用图IO中所示的微流体装置获得的DNA热变 性(热熔化)实验的示例性数据。
发明详述
根据本发明的方法和装置可以通过产生分子熔化曲线而快速地表 征各种生物材料。例如，双链DNA分子的分子熔化曲线可以提供关于
16分子中碱基对的数量、GC含量以及偏离理想Watson-Crick碱基配对 的含量的信息。分子熔化曲线还可以用来表示一种或多种测试分子与 目标分子之间的结合程度。"结合"不仅包括例如受体-配体相互作用， 而且例如核酸-核酸杂交相互作用，并可以包括特异性和非特异性相互 作用两者。如果测试分子结合了目标分子，那么可以通过本发明来定 量它们的结合。在此的方法和装置是灵活的，并可以用于许多不同类 型的化合物和分子。例如，目标分子和测试分子可以都是以下的任何 一种或多种例如蛋白(是酶的或不是)、酶、核酸(例如，DNA和/ 或RM，包括单链的、双链的或三链的分子)、配体、肽核酸、辅因 子、受体、底物、抗体、抗原、多肽、单体或多聚蛋白(同数或异数 的)、合成寡核苷酸、重组DM分子或染色体DNA的一部分、蛋白质/ 肽/受体/等能够或具有二级、三级或四级结构等的一部分或碎片。目 标分子还任选与例如辅酶、辅因子、脂质、磷酸盐基团、寡糖或辅基 相互作用。
简而言之，本发明的方法和装置能够构建和比较分子熔化曲线。 或者将分子熔化曲线描述为"热熔化(melting)曲线"、"热熔化(melt) 曲线"、"热特性曲线，，、"热变性曲线"或"热特征曲线"。因此，
(melting)分析、热熔化(melt)分析、热特性分析、热变性分析或 热特征分析。在这样的分析中，可以将待测试的一种或几种目标分子 的样品流入微流体装置中的一个或多个微通道中。任选，然后将目标 分子接触一种或多种测试分子，筛选与目标分子和/或指示剂如荧光指 示剂染料或分子可能的结合能力。本发明的任选实施方案允许涉及的 所有多变量例如，热供应、流速、试剂组成、结合条件和定时的多个 配置。
一旦测试分子与目标分子和/或标记化合物相互作用，本发明将以 可控制的方法将反应条件设定至所需的温度(在一定范围的温度内连 续地设定或非连续地设定至不连续的温度点)。测量在微流体装置中 分子的选定物理特性，并从测量值产生热特性曲线。热特性曲线是基于例如分子接受热时产生的温度诱导的变性或打开。变性可以包括， 例如，由核酸链等的解巻、解开扭曲或解开折叠、解离引起的次级、 三级或四级结构丢失。当目标和测试分子相互结合时，例如，受体-配体相互作用，稳定目标分子的构象并改变或转移温度诱导的变性的 模式。源自只加热目标分子的热特性曲线与源自结合加热目标分子和 测试分子的热特性曲线的比较使得可以测定和定量目标分子和测试分 子之间的任何结合。本发明的适用性任选使热特性曲线在微流体装置 中同时运行，以及任选同时运行结合测试的多个配置(例如，l吏用不
同的反应参数，如pH、温度梯度等)。
可以通过本发明的方法、装置和系统来测试各种类型的分子。例 如，可以检测蛋白-蛋白结合反应，包括，例如，受体-配体、抗体-抗原和酶-底物相互作用。此外，可以检测例如基于氨基酸的分子和基 于核酸的分子之间的相互作用。相似地，例如，在PNA与核酸或其他 分子的相互作用中，可以监控人造分子如肽核酸(PNA)。此外，可以 通过使用本发明来完成杂交探针和核酸之间的相互作用的筛选，例如， 包括单核苷酸多态性(SNP )。对于通过本发明任选测试的分子相互作 用类型的实例，参见，例如，Weber, P.等，(1994) "Structure-based design of Synthetic Azobenzene Ligands for Streptavidin" / J/b C力e顶5V c 16: 2717—2724; Brandts, J.等，(1990) J/z7er/ca/7丄a6ora for/， 22:3041+; Gonzalez, M.等，(1997) "Interaction of Biotin with Streptavidin" ， /肠/ C力e/z/, 272 (17): 11288-11294; Chavan， A. 等，(1994) "Interaction of nucleotides with acidic fibroblast growth factor (FGF-1) A/oc力e顶，33 (23): 7193-7202; Morton, A. 等，(1995) "Energetic origins of specificity of ligand binding in an interior nonpolar cavity of T4 lysozyme. " A/oc力e/s， 34 (27): 8564-8575; Kleanthous， C.等，(1991) "Stabilization of the shikimate pathway enzyme dehydroquinase by covalently bound ligand" C/ e历，266 (17): 10893-10898; Pilch, D.等，(1994)
"Ligand-induced formation of nucleic acid triple helices. 11#a〃 Jcad MJ， 91 (20): 9332-9336;和Barcelo， F.等(1990) "A scanning calorimetric study of natural DM and antitumoral anthracycline antibiotic-DNA complexes. 11 C力e迈5/o/ T/^era", 74 (3): 315-324。
性变化的实际检测。例如，可以按照测试中来自分子的荧光或发射光 来跟踪分子的变性。荧光的程度或变化与待测试分子的构象变化程度 相关或成比例。本发明的方法和装置使得可以通过使用，例如，激光、 光等各种方法激发测试中涉及的分子。焚光可以是待测试分子内在的， 例如，来自分子中的色氨酸残基，或是待测试分子外在的，例如，来 自加入微流体装置中的测试混合物中的荧光团。可以任选根据所需测 试的特定需要以各种方式检测荧光或发射光的变化。
发射光的荧光变化表示目标分子的构象变化，并且从其可以构建 热特性曲线。当目标分子在测试分子存在下时，热特性曲线的置换或 移动使得可以检测和定量测试分子和目标分子之间的结合。
本发明中检测分子构象变化的另一种任选方法是通过测量介电特 性。随着分子结合并经受构象变化，它们的介电特性也会变化。可以 将这些变化定量并用来测定分子相互作用参数。
本发明中检测待测试目标分子构象变化的一种任选方法是通过量 热测量。随着测试中分子经受温度诱导的变性来测量热容量的变化。 如果使用荧光方法，检测分子间的结合并通过比较来自只用目标分子
定量。''一 " 、 、''、'、
热特性曲线
目标分子应答温度变化的解折叠、解离或变性可以用于许多应用 中，例如，用于测定特定条件下的特性蛋白的稳定性，或用于鉴定核 酸、检测核酸中的SNP等。目标分子的分子变性、解离或解折叠的测 量用来构建热特性曲线。在其他应用中，基础热特性曲线的变化可以用来测试，例如，是否特定的配体或其他分子结合了目标分子。例如， 可以通过热特性曲线来研究特性配体与特定受体的结合。参见，例如，
Gonzalez, M. 等， (1997) "Interaction of Biotin with Streptavidin" /胁7 0 e/z/， 272 (17): 11288-11294。此外，可以 用热特性曲线证实特定的寡核苷酸的相互杂交。参见，例如，Clegg， R. 等(1994) "Observing the helical geometry of double-stranded DNA in solution by fluorescence resonance energy transfer." 户roc Jcacf 咖90 (7): 2994-2998。
由于结合引起的稳定作用
热特性曲线是基于由于温度变化而引起的分子构象变化。如上所 述，分子，例如，蛋白和核酸，在一定的温度范围内显示出解折叠、 解离或变性。给定目标分子的解折叠等作为温度函数的测量值产生了 该分子的热特性曲线。例如，配体(例如，如核酸或蛋白)与目标分 子的结合可以使得分子稳定并因此产生热特性曲线的变化。参见，例 如，Gonzalez, M. 等，(1997) "Interaction of Biotin with Streptavidin" /胁/ C/ e迈，272 (17): 11288-11294; Schellman， J. (1975)胁/70/，w， 14:999-1018 ; Barcelo， F.等，(1990) "A scanning calorimetric study of natural DNA and antitumoral anthracycl ine ant ibiot ic-DNA complexes." C力e迈 _5/c>7 //^erac〃歸，74 (3): 315-324; Schellman， J. (1976) Biopolymers， 15:999-1000; 和Brandts, J. 等(1990) "Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry"胁c力e迈29:6927-2940。
换句话说，测试分子与目标分子例如配体的结合将使得目标分子 以不同于没有结合的方式来变性(或解离、解折叠等)。当然，这种 特性在许多应用中非常有用，例如，测定多种配体与目标分子的相对 结合亲和性或突变蛋白的结合能力，例如，如在此所述的。在热特性
曲线的产生中，"L"表示"中点温度"或变性或解折叠反应完成一
20半时的温度。
在本发明的一些方面中，与上述那些相似的热特性曲线的构建可 以用来测定微流体通道中溶液遇到的基准温度。更具体地，本发明的 实施方案使微流体通道内流体的基准温度与可以容易地测量的通道外 的物理参数值相关。对于许多应用，例如，用于测试例如配体结合等
的PCR和/或热特性曲线的构建需要在微流体装置的微流体部件内，如 通道或腔室内的精确温度控制。使用已知分子(例如，链霉抗生物素 蛋白/生物素-荧光素等)产生的熔化曲线来监控和校准微流体部件内 的温度是有很大益处的，因为例如通过使用简单而便宜的材料可以测 定温度，该过程基本上是不可逆的或任选可逆的(参见下文)，可以 通过使用具有不同熔化温度的不同分子来微调(参见下文)，并消除 了在微流体装置内放置传感器的需求。与基准温度相关的物理参数必 须是与通道内的温度相关的物理参数。例如，物理参数可以是与微流 体部件相邻的微流体装置的外表面温度、用于焦耳加热流体的部件中
流体的电流或与微流体部件热接触的热板的温度。
在本发明的一些任选实施方案中，通过测定基准温度将分子如链 霉抗生物素蛋白和生物毒-荧光素用于校准微流体装置中的温度。将具 有大约74。C熔化温度的游离链霉抗生物素蛋白(SA)任选与(例如， 生物素-荧光素等的)四个分子结合，因此使SA具有约108。C非常高 的熔化温度。与链霉抗生物素蛋白结合时，荧光素基本上得到淬灭(即， 没有发射荧光)。但是，当链霉生物素蛋白分子变性时(即，由于微 通道内加热引起的)，生物素-荧光素缀合物得到释放并因此可以检测 荧光。为了使生物素-荧光素结合SA，任选在过量生物素-荧光素缀合 物的存在下孵育SA。饱和后，通过例如大小过滤除去未结合的生物素 -荧光素。在例如加热的荧光计或其他类似的检测仪上测定该SA-生物 素-荧光素复合物的熔化温度。然后任选将SA-生物素-荧光素复合物 通过本发明装置的微通道(即，其具有对准目标的基准温度)。如果 在沿着微通道长度的编程为基准温度的位置(或在另一个方便的位置) 检测到来自SA-生物素-荧光素系统的合适荧光，那么在通道中获得预定的基准温度。如果没有检测到合适的荧光素荧光，那么在微通道中 没有获得正确的基准温度。在不同的实施方案中，温度还任选从高温
(例如，IO(TC )跳跃至低温(例如，4(TC ),同时监控终点(或其他 方便的位置)荧光。此外，可以将一系列具有不同熔化温度(参见下 文)的探针按次序装栽于微通道中。按照这种方法，任选描绘跨越整 个温度范围的温度标准。
任选将具有不同特性的商业生物素-荧光素缀合物用于上述的温 度测定/校准中(例如，生物素-4-荧光素和荧光素-生物素)。这样的 缀合物的主要不同在于连接物的长度。此外，生物素-4-荧光素非常快 速地结合SA (或任选结合抗生物素蛋白(AV)中性链亲和素(M)， (5- (N- (5- (N- (6-生物素)氨基)己酰)氨基)p-乙基)硫脲基)，而由于连 接物引起的空间位阻，荧光素(也称为荧光素-生物素)非常緩慢地结 合(花费高达十个小时以达到饱和，甚至是在过量存在时)。变性后
(即，由于提高的温度引起的)，AV/SA/NA任选复性。使用具有快速 结合时间的生物素-4-荧光素，因此任选使温度监控/校准测试成为可 逆测试(即，测试任选是可重复的(例如，在不同的温度范围或跳跃 速度)，因为生物素-4-荧光素可以在相对短的时间段内重新结合SA)。 然而，使用荧光素-生物素将使得测试在至少几小时的时间段内是基本 上不可逆的，因为结合时间相对较长。
在任选的实施方案中，通过使用例如AV、 SA或NA(其中各自具 有不同的熔化温度)来改进监控/校准方法。另外，选择生物素-4-荧 光素或荧光素-生物素任选影响熔化温度。天然生物素任选给予AV等 最大的稳定性，接着为生物素-4-荧光素和荧光素-生物素。此外，在 其他任选的实施方案中，将变性剂如脲或盐酸胍加入温度测定/校准 中。这样的变性剂浓度的滴定任选导致校准微调至所需的熔化温度。 任选测试由变性剂引起的变性温度的任何衰减并在校准中考虑。
实例热特性曲线
图3只是用于说明的目的，提供了说明由于配体结合引起的热特性曲线位移的模拟图。该图描绘了作为温度函数的可检测特性(例如， 过量的热容量)。如贯穿文中所解释的，为了表示变性，任选追踪其 他变化，例如，指示剂染料或分子的荧光、内在的荧光等。
峰302表示分子X的热特性曲线，其中没有另外的分子例如配体 接触分子X。峰302的Tm居中于约95'C，并表示分子X的变性和解折 叠完成一半时的熔化温度。
峰304表示分子X加分子Y的热特性曲线，分子Y是例如结合分 子X的配体。结合分子Y时，分子X的Tm "位移"并居中于约115'C。
峰306表示分子X加分子Z的热特性曲线，分子Z是例如可替换 的结合分子X的配体。结合分子Z时，分子X的Tm "位移"并居中于 约133。C。
使用本发明方法/装置的另一个实例显示于图4a、 5和6中。通过 测量一定温度范围内的发射荧光来进行图4a、5和6中说明的双链DNA 寡核苦酸的链之间的解离追踪。如本领域所公知的，由于例如它们的 不同组成，不同的双链核酸(如图4a、 5、 6中所用的双链DM)在不 同的温度解离。如果两个相关的链没有正确地配对，例如，因为一条 链含有SNP，那么解离温度特征(即，热特性曲线)将不同于由两条 正确配对的链产生的曲线/特征。
为了产生图5和6中所示的图，设计35-碱基对DNA寡核苷酸(双 链)，使得使用FRET (参见下文关于FRET的讨论)来追踪其在一定 的温度范围内的解离。通过Bethel, Minn的Oligos Etc. Inc. (www.oligosetc.com)合成寡核苷酸，并具有以下的序列
GTAGG TTCCT CATCG ACACA GTAGT CCGGG CGGCG 5'-荧光素 CATCC AAGGA GTAGC TGTGT CATCA GGCCC GCCGC - TAMRA
当然，从本领域公知的各种商业来源可容易地获得相似的寡核苷 酸，也可以通过本领域技术人员容易地合成。将得知本发明的方法和 装置不限于使用特定的核酸序列或长度。换句话说，所有可以想到的 核酸序列/组合能够用于本发明中并且不应当认为以上的寡核苷酸序 列是限制的。因此，根据本发明的方法和装置可以用于诊断应用中，
23例如，用来分析从母体样品获得的DNA,该DNA已经得到纯化并通过 PCR得到扩增。
在该实施例中，在一半寡核苷酸链上的荧光素作为FRET供体，而 另 一半寡核苷酸链上的TAMRA ( 6-羧基四甲基若丹明)作为FRET受体 (参见下文中关于用于相似测量的其他可能的辐射源/受体对)。因此， 当DNA是双链构象(并因此荧光素非常接近TAMRA)时，来自荧光素 的荧光转移至TAMRA。随着温度升高，两条链分开(再次，特定的温 度取决于例如，所用的寡核苷酸的特定序列)，因此分离荧光素和 TAMRA，并因此使得可以检测从焚光素发射出的荧光。
在如图4a中所示的微流体芯片400中监控上述寡核苷酸的熔化曲 线。将寡核苷酸以-4psi流过微通道402。通过将电流通过电阻加热部 件404来加热通道402及其内含物，404是3000A厚的金属轨道，404 沿着通道402延伸大约20mni。用485nm波长能量激发荧光素部分并在 520nm的波长测量所得到的发射荧光。通过置于通道402中心的物镜 来进行这样的测量。将通道402的温度保持于最初的温度，持续30 秒钟，然后以l'C/秒的速率提高，持续95秒，提高至笫二温度(参 见，图5和6关于温度范围的图)。然后将温度降至最初的温度，还 再以rC/秒的速率，持续95秒。总地将这样的循环重复三次。温度 和荧光特征(各自由线500和线502来表示)显示于图5中。所得到 的熔化曲线显示于图6中。除了检测错配的核酸链，将通过图4a中的 上述实例产生的热熔化曲线用于测量/证实微通道或其他相似的微部 件中的流体材料的内部温度，因为可以计算已知双链核酸的Tm。换句 话说，如果，例如，以相似方式标记的具有已知Tm的双链DNA寡核苷 酸具有在微流体装置内产生的熔化曲线，然后可以测定在微流体装置 上达到温度L需要的条件。换句话说，L可以作为该微流体装置的基 准温度。
即使如图4a中图示的在微流体芯片中进行了证实已知纽成的标 记的寡核苷酸的热特性曲线构建的实验，将认识到任选在无数不同的 微流体芯片排列/构象中进行该热特性曲线(并且实际上，在此所述的任一种热特性曲线)。例如，相似的热特性曲线，或，再次，如在此
所述的基本上任何热特性曲线，任选在芯片中进行，如图4b中所示的。 如图4b中所示的，任选将分子流过主通道410。通道410在交叉点470 和480与两个大的电入口通道，450和460流体相通。冲黄过的通道440， 它用于引入例如特定的染料、标记等这样的物质(例如，只结合蛋白 质等中的疏水性氨基酸部分的染料)与主通道410流体相通。电入口 通道450和460与填满的储存器490流体相连，将电流流入交叉点470 和480之间的主通道中(参见下文关于通过4吏用^:通道中的电流而加 热的描述，焦耳加热)。电入口通道的电阻450和460低于主通道410 的电阻。由交叉点470和480限定了主通道的加热部分，并且任选在 不同的实施方案中根据要测定的特定加热/流动需求是不同长度和深 度的。通过样品装载源将待测试的分子(例如，蛋白质和推定的该蛋 白质的结合分子)引入主通道中。进入主通道中的加热部分(即，470 和480之间)时，每个分子和推定的结合剂随着通过所述部分移动时 接受加热(例如，同步或连续地)。还是在该部分中，放置适于测试 条件的检测系统(例如，测量荧光的光学检测仪，参见下文)来测量 该温度范围内的任何分子物理特性(例如，荧光)，并将这些读数输 送至计算机，以便构建热特性曲线(任选包括对照或校准曲线，其中 没有将推定的结合分子加入例如主通道中的待测试蛋白质分子中)。 在以下的"实例集成系统"部分中提供了根据本发明的微流体装置和 集成系统的其他实例。
用于构建热特性曲线的可检测特性
在构建热特性曲线中，必需测量待测分子的物理特性，以便测定 分子的变性/解折叠。作为变化温度的函数测量该物理特性的变化并且 与分子构象变化成比例/相关。例如，可以测量量热分析、热容量的变 化来表示温度诱导的分子变性，参见，例如，Weber， P.等，(1994) "Structure-based design of Synthetic Azobenzene Ligands for Streptavidin" / j历67 e范Soc 16:2717-2724。可以测量来表示分子折叠/构象变化的其他物理特性包括，例如，各种光语现象，如荧光或 发射光的存在、荧光或发射光的变化或荧光或发射光偏振的变化。可 以在一定温度范围内测量这些特性并在微流体装置中的检测下与目标
分子的解折叠/变性变化相关。
热量测定-因为将目标分子接受温度变化，本发明的一个实施方案 使用热量测定来测量热力学参数变化。例如，任选将差示扫描量热法
(DSC)用来测量分子的相对稳定性。在本发明中使用DSC,在微流体 装置中的一定范围内加热含有目标分子的样品。在加热过程中的一些 点，目标分子经历吸收或释放热的物理或化学变化，例如，变性。然 后将过程中的热变化作为温度的函数来作曲线，曲线下的面积表示整 个过程的总热量或焓变化(AH)。本领域技术人员可以使用所得到的 曲线来测定例如热容量变化(ACp) ， Tm (或变性或解折叠反应完成 一半的中点温度)等。参见，例如，Gonzalez, M. et al. ， (1997) "Interaction of Biotin with Streptavidin"， C力e/Z7， 272 (17):
11288-11294。
任选重复上述程序，添加一种可能结合目标分子例如配体的测试 分子(或几种测试分子)。然后将通过加热目标分子及其推定的结合 剂分子产生的热特性曲线与通过加热目标分子自身产生的热特性曲线 相比较。两个热特性曲线的比较可以公开例如测试分子是否确实结合 了目标分子。如果分子确实相互结合，那么在测试分子存在下测定的
移"。这种热特性曲线的位移是由于目标分子的热变性的结合依赖性 变化引起的。结合稳定了目标分子。参见，例如，Gonzalez, M. et al.， (1997) "Interaction of Biotin with Streptavidin"， / ^/o/ C細， 272 (17): 11288-11294 ; and Barcelo， F. et al. (1990) "A scanning calorimetric study of natural DNA and antitumoral anthracycline ant ibiotic-DNA complexes. " CAe"/o7 //^era"， 74 (3): 315-324。 电流-本发明的另 一个实施方案使用所用电流的测量值作为温度 的函数来追踪目标分子的变性/解折叠。可以以"夹子"模式来使用焦耳加热。因为检测下的分子(即，单独的和组合的)通过装置中的温 度而循环，测量维持特定的一个温度或几个温度需要的电流量。
荧光-本发明的另 一个实施方案使用光语学来测量荧光或光随着 目标分子接受温度变化的变化来追踪目标分子的变性/解折叠。光镨 学，例如，通过焚光，是检测热诱导的分子变性/解折叠的有用方法。 许多涉及荧光的不同方法可用于检测分子的变性(例如，内在荧光、 各种荧光指示剂染料或分子、荧光偏振、荧光共振发射转移等)，并 且是本发明的任选实施方案。这些方法利用目标分子的内部荧光特性 或外部荧光，即，分析中涉及的其他指示剂分子的荧光。
内在荧光-测量目标分子的变性/解折叠程度(当目标分子是基于 氨基酸的)的任选方法是通过监控例如色氨酸残基的内在荧光。除了 色氨酸以外，其他芳香族氨基酸残基呈现出内在荧光并任选可用于本 发明中。当目标分子由于温度的提高而经历解折叠时，之前居于蛋白 质结构内部的各种色氨酸或其他分子可以变成暴露于分子周围的溶剂
中。例如，色氨酸残基暴露的变化导致目标分子荧光的相应变化。发 射的量子产额降低或是提高取决于目标分子的序列和构象。目标分子 解折叠时，分子内部发射中通常存在红移，这任选也可以用于检测构
象变化。参见，例如，Ropson， 1.等(1997) "Fluorescence spectral changes during the folding of intestinal fatty acid binding protein"肠c力e迈，36 (38): 8594-8601。作为温度的函数来测量从该 方法观察到的内在荧光变化并用来构建热特性曲线。如上所述，测试 分子与目标分子的结合移动了热特性曲线并用来测定和定量/定性结
合情况。
荧光指示剂染料和分子-测量目标分子的变性/解折叠程度的另一 种方法是通过监控指示剂染料或分子的荧光，该染料或分子是与目标 分子和任何目标测试分子一起加入微流体装置中的。"荧光指示剂染 料"或"荧光指示剂分子"指的是荧光分子或化合物(即，荧光团)， 其在目标分子一旦解折叠或变性后或在目标分子由例如变性而经历构 象变化之前可以结合目标分子，并且其在受到例如特定波长的光激发后发射荧光能量或光。"荧光指示剂染料"和"荧光指示剂分子"包 括所有荧光团。
例如，特异性地结合分子上特定部分的荧光染料可任选用于本发 明的微流体装置中来监控由于温度引起的目标分子的分子解折叠/变 性。 一组这样的荧光染料的一个实例包括特异性结合分子的疏水性部
分的染料。该组中说明性而非限制性的实例是l-苯胺-8-萘磺酸盐 (ANS) 。 ANS在极性环境中具有低的荧光，但其结合非极性片段时， 如自然折叠的蛋白质的内部片段中发现的那些，其荧光产量将得到显 著提高。当目标分子变性，例如，随着微流体装置中递增的温度而发 生的变性时，它们变成变性的，因此使溶剂例如水到达并淬灭ANS的 荧光。或者，可以以其他方式将ANS用来监控温度诱导的构象变化， 这也取决于本发明的微流体装置中研究的特定分子/反应/等(例如， 蛋白质的变性途径可以形成疏水性片段，ANS可以与其结合并发出荧 光；或者，变性可以形成疏水性蛋白小球体，ANS可以与其结合；因 为ANS与蛋白质上结合位点的配体等竟争，因此可以监控ANS荧光)。 参见，例如，Schonbrunn， E.等(2000) "Structural basis for the interaction of the fluorescence probe 8-ani1ino-l一naphthalene sulfonate (ANS) with the antibiotic target MurA"尸roc #a〃 Jcsd 脂97 (12): 6345-6349;和Ory， J.等(1999) "Studies of the Ligand Binding Reaction of Adipocyte Lipid Binding Protein Using the Fluorescent Probe
1， 8-Anili画aphthalene-8-Sulfonate" "/op力"77: 1107-1116。本 领域公知的各种其他疏水性荧光染料等是结合微流体装置中待检测的 目标分子上的其它特定区域的荧光染料，其任选在本发明中体现。
本发明的微流体装置中所用的另 一种任选的染料类型是插入核酸 链内的一种。这种类型染料的典型实例是溴化乙锭。将溴化乙锭用于 结合测试的实例包括例如监控从溴化乙锭发射出来的荧光降低，该降 低是由于测试分子与核酸目标分子的结合引起的(溴化乙锭置换测 试)。参见，例如，Lee， M.等，(1993) "In vi tro cytotoxicity of
28GC sequence directed alkylating agents related to distamycin" "e/z 36 (7): 863-870。在变性测量中使用核酸插入试剂是本领 域技术人员公知的。参见，例如，Haugland (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals Published by Molecular Probes, Inc.， Eugene, 0R。
案中。例如，结合双链DNA小沟的染料可以用来监控由于温度引起的 目标分子的分子解折叠/变性。合适的小沟结合染料的实例是SYBR Green家族染料，其由Molecular Probes， Inc. of Eugene OR销售。 参见，例如，Haugland (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals Publ ished by Molecular Probes, Inc., Eugene, 0R。 SYBR Green染料将结合任何双链DNA分子。当SYBR Green染料 结合双链DNA时，荧光发射强度提高。随着更多的双链DM由于递增 的温度而变性时，SYBR Green染料信号将降低。
荧光偏振-本发明的其他实施方案使用荧光偏振。荧光偏振(FP) 提供了有用的检测目标分子间杂交形成的方法。该方法尤其适用于核 酸间的杂交检测，例如，来监控单核苷酸多态性(SNP)。
通常，通过监控荧光标记如荧光染料例如在包括测试和目标分子 的分子间结合情况之前、之中和/或之后的旋转速度来操作FP。简而 言之，测试分子与目标分子的结合通常导致分子之一上结合标记的旋 转速度降低，导致FP的变化。
例如，用偏振的光源激发荧光分子时，分子将在固定平面发射荧 光，例如，发射的光也是偏振的，只要分子固定于空间中。然而，因 为分子在空间中通常是旋转和翻转的，其中发射荧光的平面将随着分 子的旋转而改变(也称为分子的旋转扩散)。再次声明，发射的荧光 通常是消偏振的。分子在溶液中旋转越快，消偏振越高。相反，分子 在溶液中旋转越慢，消偏振越低，或偏振越高。给定分子的偏振值(P) 与分子的"旋转相关时间"或分子通过大约68.5'C角旋转需要的时间 量成比例。将观察到旋转相关时间越小，分子旋转越快，偏振越低。将观察到旋转相关时间越大，分子旋转越慢并且偏振越高。旋转相关
时间与粘性(/7 )绝对温度(T)、摩尔体积(V)和气体常数(R)相 关。通常根据以下的公式来计算旋转相关时间旋转相关时间-3" V/RT。如从上述等式可以看到的，如果温度和粘性维持不变，那么旋 转弛豫时间并且因此偏振值与分子体积正相关。因此，分子越大，荧 光偏振值越高，并且相反，分子越小，荧光偏振值越小。
在本发明的荧光结合测试的进行中，通常将具有相对快的旋转相 关时间的小的荧光标记的分子，例如，配体、抗原等用于结合大得多 的分子，例如，受体蛋白、抗体等，其具有慢得多的旋转相关时间。 小的标记分子与较大分子的结合显著提高了标记物质的旋转相关时间 (降低了旋转量)，即,标记的复合物超过游离的未结合的标记分子。 这对可检测的偏振水平具有相应的作用。具体地，标记的复合物比未 结合的标记分子呈现出更高的荧光偏振。
除了 Nikiforov 和 Jeong "Detection of Hybrid Formation between Peptide Nucleic Acids and DNA by Fluorescence Polarization in the Presence of Polylysine" (1999)爿/2"y〃ca7 万/oc力eyz7/Wiy275: 248-253,其他讨论荧光偏振和/或其在分子生物学 中用途的参考文献包括Perrin "Polarization de la lumiere de fluorescence. Vie moyenne de molecules dans l'etat excite'1 (1926) /脚"ad/"迈7: 390; Weber (1953) "Rotational Brownian motion and polarization of the fluorescence of solutions"爿c^ Aofe// C力e范8: 415; Weber (1956) / Soc爿迈46: 962; Dandliker 和 Feigen (1961)， "Quantification of the antigen-antibody reaction by the polarization of fluorescence" "/oc力e/z7 "/o/ A/s
Co卿f/" 5:299 ; Dandliker and de Saussure (1970) (Review Article) "Fluorescence polarization in immunochemistry'1 /顺w/ oc力e/z72'W/y 7: 799; Dandliker W. B.，等(1973)， "Fluorescence polarization immunoassay. Theory and experimental method" T/zM7W70c力e/z72、fr/ 10:219;Levison S.A. ，et al. (1976)，
30"Fluorescence polarization measurement of the hormone—binding site interaction" i"她cr/;2o/柳99: 1129; Jiskoot等.(1991)， "Preparation and application of a fluorescein-labeled peptide for determining the affinity constant of a monoclonal antibody-hapten complex by fluorescence polarization" j/7<s7 飾c力e迈196:421 ; Wei 和 Herron (1993)， "Use of synthetic peptides as 轨道 r antigens in fluorescence polarization immunoassays of high molecular weight analytes" J/2a/ C力e迈 65:3372; Devlin等(1993)， "Homogeneous detection of nucleic acids by transient-state polarized fluorescence" C力e/ff 39:1939 ; Murakami 等 (1991). "Fluorescent—labeled oligonucleotide probes detection of hybrid formation in solution by fluorescence polarization spectroscopy" Jc/c^s b 19:4097. Checovich et al. (1995)， "Fluorescence polarization—a new tool for cell and molecular biology" (product review), A""ure 375:354-256; Kumke 等(1995)， "Hybridization of fluorescein-labeled DNA oligomers detected by fluorescence anisotropy with protein binding enhancement11 yi力a/ C/ e历67 (21): 3945-3951;和Walker, J.等(1996)， "Strand displacement amplification (SDA) and transient-state fluorescence polarization detection of mycobacterium tuberculosis DNA" C///z/ca/ C7 e迈/"r/ 42 (1): 9-13。
荧光共振能量转移-本发明的再一个任选实施方案使用荧光共振 能量转移(FRET)来追踪目标分子作为温度函数的构象变化(以及与 结合目标分子的测试分子的相互作用)。FRET依赖于能量从供体荧光 团距离依赖性转移至受体焚光团。如果受体荧光团接近激发的供体荧 光团，则供体荧光团的激发可转移到受体荧光团。这引起供体荧光团 强度的伴随降低和受体焚光团发射强度的增加。因为激发转移的效率 特别依赖于两个荧光团之间的距离，可以用技术来测量非常小的距离，如检测构象变化时产生的。这种技术特别适用于测量结合反应、蛋白-蛋白相互作用，例如，如目标蛋白结合抗体，和改变两个标记分子接 近性的其他生物学情况。许多合适的交互式标记是已知的。例如，荧 光标记、染料、酶标记和抗体标记全部是合适的。交互式荧光标记对
的实例包括铽螯合物和TRITC (异硫氰酸四若丹明)、铕穴合物和别 藻蓝蛋白、DABCYL和EDANS以及本领域技术人员已知的许多其他实例 (例如，供体荧光团，如羧基荧光素，碘代乙酰氨基荧光素 (iodoacetaraidofluorescein)和异硫氰酸荧光素和受体荧光团如橫 代乙酰氨基曙红(iodoacetamidoeosin)和四曱基若丹明)。相似地， 两个比色标记可以形成组合作用，其产生第三种颜色，例如，接近黄 色发射的蓝色发射提供了观察到的绿色发射。关于荧光对，存在各种 已知能相互淬灭的荧光团。荧光淬灭是降低荧光量子产额的双分子过 程，通常没有改变荧光发射光谱。淬灭可以是由瞬时激发的状态相互 作用引起的，(碰撞淬灭)，或，例如，由非荧光基础状态物质形成 引起的。自我淬灭是一个荧光团由另一个引起的淬灭；当高浓度、标 记密度或标记接近发生时，易于产生这种情况。FRET是距离依赖性激 发态相互作用，其中一个荧光团的发射结合另一个接近的激发(足够 近以产生可观察的发射变化)。 一些激发的荧光团相互作用来形成激 发物，其是激发态的二聚物，呈现出改变的发射光谱(例如，具有芘 sn-2酰基链的磷脂类似物)。参见，例如，Haugland (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals Published by Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. e.g., at chapter 13; 和 Selvin， P. (2000) "The renaissance of fluorescence resonance energy transfer"57rw"肠/ 7 (9): 730-734。
分子信标-本发明的其他任选实施方案在以下的目标分子/测试分
子的构象变化中使用分子信标，作为温度的函数。分子信标是可以用 来报道特定核酸存在的探针(即，就本发明而言是测试分子)。它们 在其中不需要或不可能分离待测试核酸杂交体的情况中尤其有用。
在结构上，分子信标是发夹型核酸分子，其具有由两侧为两个互补末端片段的特定核酸序列的中心"环"部分(退火在一起)，其中 一个具有荧光部分，另一个具有淬灭剂部分。环片段与目标物或特定 的核酸序列互补。当分子信标不在其正确目标分子存在下并且是发夹 构象时，荧光部分和淬灭剂部分足够近，使得荧光淬灭，并且能量作 为热发射出来。然而，当分子信标遇到其正确的目标分子时，其改变 构象，因此其内部环片段结合目标核酸序列。这迫使荧光部分远离淬 灭剂部分而移动，这导致荧光恢复。通过使用不同的荧光团，可以以
多种不同的颜色来形成分子信标。DABCYL (非荧光发色团)通常作为 分子信标中的通用淬灭剂。分子信标是非常特异性的并因此用来检测 例如本发明中分子间的单个核苷酸差异。参见，Tyagi， S.等，(1996) "Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization" 组5/Wec力14:303-308 ; 和Tyagi， S.等(1998) "Multicolor molecular beacons for allele discrimination" A/otec力 16:49-53。
圆形二向色性-本发明另一个任选实施方案使用圆形二向色性 (CD)作为温度函数来追踪目标分子/测试分子的构象变化。CD是一 种光吸收光镨学，其测量由右循环偏振光和左循环偏振光之间的分子 引起的吸光率差异。CD对多肽和蛋白质的结构非常敏感。对于CD的 应用和技术的综述，参见，例如，Woody， R. (1985) "Circular Dichroismof Peptides" in The Peptides 7: 14-114， Academic Press; Johnson, W. (1990) "Protein Secondary Structure and Circular Dichroism: A Practical Guide"户rote^2S 7:205-214。为了构建分 子熔化曲线，本发明任选使用CD来追踪由温度变化引起的目标和测试 分子的构象变化。
介电特性
本发明的任选实施方案包括使用介电特性的测量来检测和/或跟 踪分子的构象变化(例如，由于分子间如例如配体-受体结合中的相互 作用产生的那些)。用于测量介电特性变化的 一种非限制性任选方案包括结合固体支 持物的目标分子。然后信号通过结合的目标分子传导(例如，特定波 长的电磁能量)，然后测量独特的信号应答。通过结合的目标分子的 独特介电特性来调节信号应答。如果测试分子与结合的目标分子相互 作用，那么将改变独特的信号应答。这种信号应答的改变可以用来测 定测试分子对于目标分子的亲和性和特异性。
此外，这种方法可以区分测试分子在例如目标分子上的变构部位 的结合和测试分子在目标分子上的特征性相互作用部分的结合。换句 话说，非特异性结合产生与特异性结合产生的截然不同的"信号"。
对于该检测方案的实例和更多的详细内容参见，例如，Smith等，W0 99/39190， Hefti等，WO 00/45170和Hefti， J.等,"Sensitive detection method of dielectric dispersions in aqueous—based, surface—bound macromolecular structures using microwave spectroscopy"场7/ed脚"e〃e"， 75 (12): 1802-1804。
UV吸光率
本发明的任选实施方案包括使用UV吸光率的测量来检测和/或追 踪核酸分子的变性，和/或定量核酸的总量。UV可以用来测量变性的 程度，因为单链核酸分子的UV吸光率值高于双链核酸分子的吸光率值。
本发明的集成系统、方法和微流体装置
除了构象变化的实际检测和热特性曲线的构建，本发明的微流体 装置还包括各种任选的不同实施方案，用于例如流体转移、温度控制、 荧光检测和加热。
术语"微流体装置，，指的是具有通常以微米至小于微米尺度构造 的流体通道或腔室通道装置，例如，通道或腔室通常具有至少一个小 于约lmm范围的横截面尺寸。微流体装置中的通道有时候也称为"微 流体通道，，。微流体通道通常是微流体装置内部内的闭合通道。在许
34多微流体装置中，通过在第一平面基质表面上构造沟槽来形成通道， 然后通过将第二平面基质连接该表面来闭合这些沟槽。集成系统，或 微流体系统，与微流体装置相接。在许多微流体系统中，微流体装置 是可移动的部分，如药筒一样。可以从与检测下特定实验等中存在的 条件相容的材料构造根据本发明的微流体装置。这样的条件包括，但
不限于，pH、温度、离子浓度、压力和电场的应用。例如，如全文中 所述的，所述系统可以利用温度控制根据在此所述的方法来提供热熔 化曲线。因此，可以选择材料来提供在任何特定温度的特殊特性。还 可以根据对将在装置中进行的实验的组分的惰性来选择装置的材料。 这样的材料包括，但不限于，玻璃、石英、硅和聚合物质，例如，塑 料，这将取决于计划的应用。
尽管在此特意说明的装置和系统就几个或一个特定的操作进行了 说明，但从该公开内容将容易地得知这些系统的灵活性允许将其他的 操作容易地整合至这些装置中。例如，所述的装置和系统将任选包括 用于实际上进行在此特意描述操作的上游和下游的各种操作的结构、 试剂和系统。这样的上游操作包括样品处理和制备操作，例如，细胞 分离、提取、纯化、扩增、细胞激活、标记反应、稀释、等分等。图 7中显示了微流体装置的图示，该装置进行根据本发明产生熔化曲线 的操作上游的操作。微流体装置700包括微流体通道710。通过装置 顶视图中的箭头来表示流过通道710的一般方向。在装置的区域A中 进行上游操作，而在下游区域B中产生熔化曲线。图7中所示方案的 一个特别有利的应用是进行样品纯化和/或核酸扩增以在区域A中分 离和扩增目标核酸分子，而在下游区域B中，通过区域B中的熔化曲 线来表征分离和/或纯化的目标核酸分子。可以使用的扩增反应的实例 包括PCR和LCR。为了在上游区域A中进行扩增，必须将合适的扩增 试剂在区域内与目标核酸混合。例如，如果核酸分子是DNA分子，并 且扩增反应是PCR,扩增试剂将包括合适的引物、热稳定聚合酶和核 苷酸。下游操作任选包括相似的操作，包括，例如，样品组分的分离、 组分的标记、测试和检测操作、基于动电学或压力的组分注射等。根据本发明的集合微流体系统可以包括其他部件，如导引流体并 可能是颗粒在微通道内移动的流体转运系统。流体转运系统可以想到 地使用本领域中已知的任何流体移动机理(例如，用于调节微通道中 的流体压力的流体压力源、用于调节微通道中的电压或电流的动电学 控制仪、重力流动调节器、用于调节微通道内磁场的磁性控制部件或 其组合)。
本发明的微流体装置还可以包括流体操纵部件，如平行流射流转 换器，即促进至少一系列试剂流转换成试剂平行流，用于将试剂平行 传送至装置内的一个反应部位或几个反应部位。例如，在此的系统任
选包括阀组(valve manifold)和多个电》兹阀来控制通道之间的流动 开关和/或控制微通道中的压力/真空水平，例如，分析或孵育通道。 流体操纵部件的另 一个实例包括例如毛细管，任选用于从微量滴定平 板吸啜一种样品或几种样品并将其传送至多个通道中的一个，例如， 平行反应或测试通道。此外，任选通过一个吸移管管理器毛细管将分 子等装载入微流体装置的一个或多个通道中，吸移管管理器毛细管与 一个或多个通道中的每一个和样品或颗粒源流体相通，如微孔平板。
在本发明中，任选监控和/或检测如细胞、蛋白质、抗体、酶、底 物、緩沖剂等的物质，例如，使得可以检测目标成分的存在，可以测 定化合物的活性，或可以测量调节剂对例如酶活性的作用。根据所检 测的信号测量值，任选关于随后的流体操作作出决定，例如，是否详 细地测试特定的成分来测定例如动力学信息，例如，基于热熔化曲线 的分析。
在此所述的系统任选包括微流体装置，如上所述，结合用于控制 装置内的流体转运、流速和方向的其他装置，用于检测或读出由系统、 处理器例如计算机执行的操作结果的检测装置，用于根据编程指令指 示控制装置，接收来自检测装置的数据，和用于分析、储存和解释数 据，并且以容易获得的报道格式提供数据和解释。
温度控制本发明的实施方案使用温度控制来完成用于熔化曲线测试的分子 熔化或变性。根据本发明的集成系统还可以控制温度来控制反应参数，
例如，在热循环反应中(例如，PCR, LCR)，或来控制试剂特性。通 常，并且在本发明的实施方案中，可以用各种加热方法以在小型化流
体系统中提供受控的温度。这样的加热方法包括焦耳和非焦耳加热两 种。非焦耳加热方法可以是微流体装置内部的，即，整合至微流体装
置的结构中，或是外部的，即，与微流体装置分开，但是微流体系统 的一部分。可以通过光子束、通过液体的传导或对流加热和冷却(例 如，将液体通过装置中的通道，或将装置的一个或多个外表面接触气 体或液体)、激光、电磁场、电子束、热电加热器、炉子、电阻性薄 膜、电阻性加热线圏、珀尔帖加热器和热电加热器或冷却器。那些非 焦耳加热方法中的许多可以结合使用热模块，这是一块热接触微流体 装置的外表面的热传导材料，通过传导将热能转移至微流体装置或从 微流体装置中转移出来。热传导材料模块是"热接触"微流体装置内 部内的微流体通道，因为模块内的温度变化将引起微流体通道内的温 度变化。可以使用一种或多种之前列出的非焦耳加热方法来操纵热模 块的温度。例如，可以通过控制通过热接触热模块的电阻性加热器的 电流，或通过控制通过珀耳帖装置的电流来操纵热模块的温度。与微 流体装置相接的系统中的控制器或微流体装置自身内的控制器可以用 来调节所涉及的温度。这些实例是非限制性的并且可以使用各种其他
能源来升高微流体装置中的流体温度。
非焦耳加热部件可以直接连接微流体装置芯片的外面部分。或者， 非焦耳加热部件可以整合至微流体装置的结构中。在任一种情况中，
任选将非焦耳加热只用于微流体装置中芯片的选定部分，或任选加热 微流体装置的整个芯片，并提供通过芯片的均匀温度分布。
可以将各种方法用于降低微流体系统中的流体温度，通过使用散 能装置。散能装置可以是吸热设备或吸化学物质源(chemical sink), 并可以是大量的、随时间变化的、随空间变化的或连续的。吸热设备 可以包括，特别是，流体射流、液体射流、气体射流、低温流体、超冷液体、热电冷却装置，例如，珀耳帖装置或电磁场。散能装置可以 用来冷却微流体装置的区域，该区域也是使用焦耳或非焦耳加热方法
得到加热的。例如，以液体冷却形式的散能装置可以用于图10中微流 体装置100的背面来降低加热区域130的温度，而金属轨道s150可以 用来升高加热区域130的温度。结合焦耳或非焦耳加热方法使用散能 装置使得微流体装置能在热循环过程中更快地改变温度。
大部分非焦耳加热方法通常用来给微流体装置提供热能，而没有 将能量直接提供给装置中的通道。例如，上述非焦耳加热方法中的许 多将热传送至微流体的外表面，因此在那些方法中，在到达通道中的 流体之前，必须通过微流体装置的壳体来传导热。例如，在使用热模 块的实施方案中，在微流体通道内含有的流体中实现温度变化需要通 过模块和微流体装置之间的界面、通过微流体装置的壳体和通过通道 的内表面将热转移至模块或从模块转移出来。通过各种界面和微流体 装置的壳体来传导热的需求可以形成热惯性，这引入了热模块得到加 热或冷却的时间和影响装置中微通道内温度的加热或冷却时间之间的 延迟。此外，因为几乎所有的非焦耳加热方法没有均勻地加热微流体 装置的壳体，例如，可能将热只施加于装置的一个表面，或可能加热 装置的一个表面，同时将装置的另一个表面冷却，因此微流体装置的 壳体内具有温度差异是非常常见的。换句话说，微流体装置通道中的 温度不同于装置的一个或多个外表面的温度。
由于热惯性引起的通道中温度应答的延迟，以及表面温度和通道 温度之间的相抵使得非常精确地控制装置通道内流体温度是成问题 的，因为通常非常难以将测温装置置于微通道中。之前所述的用于测 定微流体通道内基准温度的方法可以用来定量温度抵消。可以定量应 答时间的延迟，并因此以各种方式来补偿。定量延迟的一种方法显示 于图8中。因为大部分荧光物质产生的荧光量随着温度而改变，通道 中的荧光相对含量可以是通道中相对温度的表示。如图8中所示的， 通过直接加热和冷却表面，以特征性的模式来改变微流体装置外表面 的温度820。图8中的特征性模式是正弦波。用于装置表面的温度变
38化模式将在热接触表面的装置内通道中产生相似的温度变化模式。因 为那些通道内荧光物质产生的焚光量随着温度而改变，从通道发出的
荧光量将再次再现模式。因此，图8的实施方案中，微流体装置外表 面温度的正弦变化产生从通道发出的正弦荧光变化810。在图8中所 示的实施方案中，通道中物质的荧光随着物质温度提高而降低。由热 惯性引起的延迟形成了表面上温度最大的时间和通道中温度最大的时 间之间的抵消830 (如通过最小荧光值所示的)。因此，表面温度的 正弦变化和监控通道中的正弦荧光应答使得可以定量由热惯性引起的 时间延迟。图8中所示的方法将可用于任何荧光将随着温度而变化的 荧光化合物，与荧光是否随着温度而增强或降低无关。此外，任何其 他具有可识别特征的温度变化模式可以用来测量时间延迟。例如，替 代正弦波，模式可以是阶梯函数或脉沖。另一种定量延迟的方式将是 测量熔化点探针(其在预定温度熔化)熔化时的微流体装置表面的温 度。 一种定量在装置表面上测量的温度抵消和装置通道内流体温度的 方法将是使用之前所述的用于测定基准温度的方法，通过产生具有已 知Tra的分子的熔化曲线并测定通道内温度为Tm时的微流体装置表面的 温度。
在焦耳加热方法中，通过通道内流体的电流产生热，这是通过将 能量通过流体的电阻来弥散。能量随着电流通过流体来弥散，并用来 作为时间函数的功率进入流体中来加热流体。以下的数学表达式通常 描述了功率、电流和流体电阻之间的关系其中POWER-流体中弥散的 功率；I-通过流体的电流；和R-流体的电阻。
P0WER=I2R。
以上的等式提供了弥散的功率("POWER")与电流("I")和 电阻("R，，)之间的关系。在本发明的一些实施方案中，其涉及移动 流体， 一部分功率进入使流体通过通道流动的动能中。焦耳加热使用
选定部分的功率来加热通道中或微流体装置的选定通道部分中的流体 并可以使用通道内电极。参见，例如，U.S.专利No. 5, 965,410。该通 道部分的横截面通常比通道结构中的其他通道部分窄或小。小的橫截
39面提供了较高的流体电阻，这随着电流通过提高了流体的温度。或者， 可以通过升高的电压沿着通道的长度来提高电流，这也提高了弥散至 流体中的功率量，相应地提高了流体温度。
焦耳加热允许精确地区域性控制本发明装置中分开的微流体元件 内的温度和/或加热，例如，在一个或几个分开的通道内，没有加热其 中例如不需要这样的加热的其他区域。因为与其中装配微流体元件的 整个微流体装置的大块相比，微流体元件是非常小的，这样热量基本 上保持在一个区域内，例如，在影响其他流体元件之前弥散至装置中 或从装置中弥散出来。换句话说，相对大的装置作为散热器来起作用，
用于其中所含的分开的流体元件。
为了选择性地控制微通道中 一部分流体或材料的温度，本发明的 焦耳加热电力供应可以以几种任选的方法施加电压和/或电流。例如，
电力供应任选施加直流电(即，DC)，其通过微通道的一个区域并进
入相同通道中横截面更小的另一个区域中，以便加热第二区域中的流 体和材料。可以以量级选择性地调节该直流电来补充区域之间所用的 任何电压或电场来将材料移进和移出各自的区域。为了加热区域内的 材料，而没有不利地影响材料的移动，可以通过电力供应来选择性地 应用交流电(即，AC)。可以选择性地调节用于加热流体的交流电来 补充区域之间所用的任何电压或电场，以便将流体移进和移出装置的 各个区域。可以调节AC电流、电压和/或频率，例如，来加热流体， 而没有实质性地移动流体。或者，电力供应可以施加电流和/或电压的 脉冲(pulse或impulse)，其将通过一个微通道并进入另 一个微通道 区域中，及时地以给定的距离加热区域中的流体。可以选择性地调节 该脉冲来补充区域间施加的任何电压或电场，以便将例如流体或其他 材料移进或移出各种区域。例如，可以调节脉冲宽度、形状和/或强度 来加热流体，而没有实质性地移动流体或材料，或来加热材料，同时 移动流体或材料。再进一步，电力供应任选施加DC、 AC和脉冲的任意
组合，这取决于应用。微通道自身任选具有所需的横截面(例如，直 径、宽度或深度)，这提高通过其的电流加热作用和能量从电流热转移至流体。
因为任选将电能用来直接控制微流体装置内所含的流体的温度， 将本发明任选用于微流体系统中，该系统使用动电学材料转运系统， 如在此所述的。具体地，可以与控制材料转运同时将相同的电流控制 器、电力供应和电极容易地用来控制温度。
在本发明的一些实施方案中，通过区域加热，该装置提供了多个
温度区域。 一个这样的实例装置描述于Kopp， M.等(1998) "Chemical amplification: cont inuous-f low PCR on a chip" 5We/7ce 280 (5 366): 1046-1048中。在此所述的装置由具有三个温度区域的芯片构成，对 应于用于PCR的变性、退火和引物延伸温度。可以通过使三个温度区 域热接触三个不同的热模块来形成温度区域，其中将三个热模块中的 每一个维持于不同的温度。装配于芯片中的通道多次穿过每个区域， 以实现20个循环的PCR。通过改变穿过芯片的流体流速，Kopp等，能 够改变PCR的循环时间。而用于本发明的装置与Kopp描述的相似，它 们通常以显著不同的方式。例如，由Kopp进行的反应限于20个循环， 这是实验中所用芯片的固定方面。根据本发明，反应任选包括任何数 量的循环(例如，取决于待测试的特定分子的参数)。此外，本发明 使用热循环，用于，例如，替代PCR的目标/测试分子的变性和/或复 性。对于微流体装置中温度控制的更多实例，参见，例如，Kopf-Sill， A的发明名称为"Inefficient Fast PCR，，的U. S.专利No. 6， 303， 343; 和Knapp， M等的发明名称为"Microf luidic systems and methods of genotyping"的U. S,专利No. 6， 403， 338。
之前描述的温度控制方法可以用来进行熔化曲线分析，以停流形 式或连续流形式进行。在停流形式中，在微通道内停止流动，而该通
道内的温度在产生所需熔化曲线需要的温度范围中跳跃。可以使用焦 耳或非焦耳加热方法中的任一种，可以结合散能装置来实现通道中温
度的受控跳跃。以停流形式产生熔化曲线需要的流动停止通常导致流 动停止于微流体装置的各处。因此，难以在熔化曲线分析的上游或下 游整合停流形式熔化分析和连续流过程。因此，例如，难以整合停流形式熔化曲线分析和连续流PCR过程，这描述于U.S.公开申请 No. 2002/0197630和2005/0042639中。因此，能够以连续流形式进行 熔化曲线分析是有利的，尤其是熔化曲线分析的上游或下游过程是连 续流过程时。
在使用停流形式的实施方案中，温度的受控跳跃包括通过连续提
高分子的温度来升高分子的温度。例如，可以以o. rc/秒至rc/秒范 围的速率连续提高分子的温度。或者，可以以更慢的速率连续提高分 子的温度，如o. orc/秒至o. rc/秒范围内的速率，或以更快的速率， 如rc/秒至10匸/秒范围内的速率。
可以以连续流形式进行熔化曲线分析，通过沿着微通道长度(即， 平行于流动的方向)应用温度梯度。如果熔化曲线分析需要待分析的 分子接受第一温度延伸至第二温度的温度范围，将微通道长度一端的 温度控制于笫一温度，而将长度另一端的温度控制于第二温度，因此 形成跨越第一和第二选定温度之间的温度范围的连续温度梯度。 一旦 建立了通过微通道部分的流体的稳定流动状态，将在流体内建立相应 的温度梯度。使用焦耳加热时，通过配置通道，使得沿着其长度连续 而单调地改变橫截面面积，然后通过该长度使用单电流，从而沿着微 通道的长度建立温度梯度。几乎任一种之前所述的非焦耳加热方法， 可以结合散能装置，可以用来建立穿过通道长度的温度梯度。例如， 可以将热模块接触微通道的长度，沿着该长度建立温度梯度，并且在 模块的两端放置两个分开的珀耳帖元件，使得以对应于微通道长度方 向的方向跨越模块来建立温度梯度。
当穿过微通道的长度建立跨越所需温度范围的温度梯度时，所有 产生熔化曲线需要进行的是在沿着通道的多个点测量表示结合或变性 的物理特性，例如，荧光。在荧光的情况中，通过与通道光学交流的 方式放置一列光学检测仪，使得光学阵列在沿着通道长度的多个点取 样荧光来实现此。为了产生精确的熔化曲线，特别是沿着温度轴精确 的曲线，使得可以进行Tm的精确测定，还应当使用一系列热检测仪来 测定沿着微通道长度的温度变化。能够进行连续流形式熔化曲线分析的两个微流体系统的图示显示于图9A、 9B和9C中。在图9A中所示的 系统中，光学检测仪阵列910和热检测仪阵列920都置于微流体装置 900之上。在图9B中所示的系统中，光学检测仪阵列910置于微流体 装置900之上，而热检测仪阵列920置于微流体装置之下。图9C图示
在微通道915的长度905中，进行温度和荧光测量，其中每个界内虛 线(hark mark) 950 (只指向子集)穿过通道915。。因为温度沿着 微通道长度905从熔化曲线最低的温度单调地变成熔化曲线的最高温 度，因此随着每个温度读数在相同的位置获取每个荧光读数，在沿着 通道的多个点的每个点获取的组合的荧光/温度数据将是熔化曲线的 数据点。
在图9A-9C所示的实施方案中，连续提高或受控跳跃待分析分子 的温度，作为包括分子的流体沿着微通道915的长度流动的结果，该 通道中施加了温度梯度。在作为沿着施加了温度梯度的通道流动的结 果而连续提高分子温度的实施方案中，可以通过改变温度梯度、通道 的几何学(例如，通道的横截面面积)或含分子流体的流速中的一个 或多个来控制连续提高分子温度的速率。通过改变穿过通道的流体的
流速，可以以不同的速率连续提高分子的温度，包括o.rc/秒至rc/ 秒范围中的速率、o. orc/秒至o. rc/秒范围中的速率，或rc/秒至
1(TC/秒范围中的速率。
在以下的"检测仪"部分中讨论了可以用于光学检测仪阵列中的 光学检测仪的类型。各种不同类型的温度检测仪可以用于热检测仪阵 列中。例如，阵列中的每个检测仪可以是接触性温度检测仪，如热电
偶、热电阻测温仪或热敏电阻器；或非接触性测温仪，如IR温度计或 光学高温计。除非检测仪直接取样微通道中的流体，可能需要使用之 前讨论的用于补偿测得的温度和通道中温度之间的差异的方法。
如从以上可看出的，根据所考虑分子的特定需求，可以以许多不 同的排列来设定本发明。例如，可以以多种方式来排列温度循环模式。 几个非限制性实例包括具有所设定的阵列，使得不同的分子混合物流过区域，其中温度通过区域循环(例如，从目标分子主要为天然的 温度上升到目标分子主要为变性的温度)，同时连续监控信号(例如，
荧光、介电特性等)；通过测量分子的L来配置热/流动阵列，并保 持其中的温度，同时监控任何配体诱导的信号变化(例如，焚光、介 电特性等的变化)；和从Tm开始循环温度并监控任何配体诱导的信号 变化(例如，荧光变化等)(这样的方法有助于避免起泡问题)。再 次，上述非限制说明只是本发明的许多不同配置/实施方案的实例。
流体流动
任选将各种控制装置结合上述的微流体装置来使用，用于控制流 体材料和/或本发明装置内的材料的转运和方向，例如，通过基于压力 或动电学控制。
在本发明的系统中，流体指引系统控制样品(例如，测试分子和 目标分子)、试剂(例如，底物)等通过微流体装置的转运、流动和/ 或移动。例如，流体指引系统任选指引一个或多个分子样品移动至第 一微通道中，任选在其中孵育分子。还任选指引一个或多个样品同时 或按序移动至检测区域并任选移动至例如试剂存储器和从例如试剂存 储器中移动出来。
流体指引系统还任选指引本发明装置中多个样品的装栽和下栽。 流体指引系统还任选反复地重复这些移动来形成高通量筛选，例如， 成千个样品的筛选。或者，流体指引系统重复较少反复程度的移动，
或低通量筛选(使用，例如在观察下需要特定分析时，例如，当高通 量形式与生产力相反时，使用长孵育时间)或流体指引系统使用高通 量和低通量筛选的形式，这取决于测试的特定需求。此外，本发明的 装置任选使用多元形式来获得高通量筛选，例如，通过使用一系列多 元化的吸移管管理器装置或多元化通道系统，这些装置或系统连接用 于篩选的单个控制器，以便提高给定时间段内分析的样品含量。
获得颗粒通过微流体通道的转运或移动的一种方法是动电学物质 转运。通常，动电学物质转运和指引系统包括依赖于用于结构的电场内带电物质的电泳移动性的那些系统。更特别地，将这样的系统称为 电泳物质转运系统。
如在此所用的动电学物质转运系统包括转运和指引含有微通道的 结构内的物质的系统，通过将电场用于物质，由此引起物质通过微通 道和/或微室和在微通道和/或微室中移动，例如，阳离子将朝向负电 极移动，而阴离子将朝向正电极移动。流体朝阴极或阳极或远离阴极 或阳极的移动可以引起流体内悬浮的颗粒(或甚至是流体在上面流动 的颗粒)的移动。相似地，颗粒可以是带电的，在该情况中，它们将 朝向相反电荷的电极移动(实际上，可以实现一个方向的流体流动， 同时实现相反方向的颗粒流动)。在本发明的一些实施方案中，流体 可以是固定的或流动的。
对于本发明任选的电泳应用，动电学转运系统内部通道的壁任选 是带电的或不带电的。典型的动电学转运系统由玻璃、带电的聚合物 和不带电的聚合物制得。任选用改变通道表面电荷的材料覆盖内部通
道。各种动电学控制器描述于，例如，Ramsey WO96/04547， Parce等， W098/46438和Dubrow等，W098/49548，以及其中引用的各种其他参 考文献。
为了提供合适的电场，微流体装置的系统任选包括电压控制器， 其能够同时将可选择的电压水平施加于不同的各个微通道和微室中， 并且包括地面。任选使用多个分压器和多个继电器来执行这样的电压 控制器，以获得可选择的电压水平。或者，使用多个独立的电压源。 通过多个流体管道(例如，微通道等)中每个内安置或制造的电极， 将电压控制器与每个装置流体管道用电力连接。在一个实施方案中， 安置多个电极，以提供微通道内电场方向的转换，由此使分析物移动 比微通道物理长度更长的距离。使用动电学转运来控制互连通道结构 中的物质移动描述于，例如，Ramsey的WO96/94547中。示例性控制 器描述于U. S.专利No. 5， 800， 690中。将调节电压伴随地应用于装置 的各个流体区域来影响所需的流体流动特征，例如，标记成分连续或 不连续的朝向废料存储器的流动(例如，使样品朝振荡方向移动的规则脉冲场)。特别地，在各个区域所用的电压调节可以移动和指导流 体流过装置的互连通道结构。
还任选将以上讨论的控制装置用于提供目标区域下游材料的动电 学注入或取出，以控制上游的流速。上述的相同装置和技术还用来将 流体注入下游端口，以用作流动控制部件。
本发明还任选包括其他转运方法，例如，可用于其中动电学方法 不理想的情况中。例如，在基于压力的系统中，任选整体或部分地进 行流体转运和指引、样品引入和反应等，以避免样品混合过程中的动
电学偏置。高通量系统通常使用压力诱导的样品引入。基于压力的流 动在其中也使用了动电学转运的系统中也是理想的。例如，任选将基 于压力的流动用于引入并在系统中反应试剂，在该系统中可以通过电 泳分离产物。在本发明中，任选装载分子并使用，例如，动电学流体 控制和/或施加压力将其他试剂流过微通道。
任选将压力施加于本发明的微尺度元件，例如，施加于微通道、 微室、区域或存储器，以使用各种技术中的任一种来实现流体移动。 任选通过基于压力的机理如基于流体置换的那些来调节流体流动和悬 浮或溶解于流体中的物质(包括细胞和分子)的流动，例如，这些机 理例如使用活塞、压力隔膜、真空泵、探针等来置换液体并升高或降 低微流体系统中某个位置的压力。压力任选是气动的，例如，加压气 体，或使用水压，例如，加压的液体，或可替换地，使用正置换机理， 例如，适合材料存储器的活塞，用于迫使物质通过通道或其他管道， 或是这些压力的组合。内部源包括本领域中已经描述过的微尺寸制造
的泵，例如，隔膜泵、热泵、lamb wave泵等。参见，例如，U. S.专 利NO. 5， 271， 724; 5, 271,566;和5， 375， 979，以及公开的PCT申请 No. WO94/05414和WO97/02347。
在一些实施方案中，将压力源施加于微通道一端的存储器或孔来 迫使流体材料通过通道。任选，可以将压力施加于通道末端的多个端 口，或，可以在主要的通道末端使用单个压力源。任选，压力源是在 主通道的下游端或在多个通道的末端使用的真空源。任选在外部给装
46置或系统提供压力或真空源，例如，与通道的进口或出口密封地相适 配的外部真空或压力泵，或它们是在装置内部，例如，整合至装置中 并可操作地连接通道的微尺寸制造的泵，或它们同时是装置外部和内 部的。微尺寸制造的泵的实例已经在本领域中得到了广泛描述。参见，
例如，公开的国际申请No.W097/02357。
这些所用的压力或真空产生了穿过通道长度的压力差，来驱使流 体流过通道。在此处所述的互连的通道网络中，任选通过使用多个端 口处的不同压力或真空来完成不同的体积流速，或，通过使用在常见 的废物端口使用单个真空并给各个通道配置合适的电阻来产生所需的 流速。实例系统描述于1999年1月28日申请的U.S.系列 No. 09/238,467中。在本发明中，例如，真空源任选给不同的通道4吏 用不同的压力水平来转换通道之间的流动。如上所述，任选使用多个 来源或通过将单个来源连接包括多个电控制阀例如电磁阀的阀组来进 行此。
在使用停流形式方法产生熔化曲线的实施方案中，重要的是将产 生熔化曲线的微通道内的流动完全停止，以维持待分析样品的完整性。 由光褪色引起的样品荧光特征的变化可以用来测定通过微通道的流动 是否得到了完全停止。流动液体中光褪色的量低于停滞流体中光褪色 的量，只因为流动液体中的荧光部分暴露于激发光的时间较短，因为 该部分移动通过检测区。因此，光褪色的水平表示含有荧光部分的流 体在微通道内是移动的还是静止的。例如，如果完全停止(即产生为 零的流速)微流体通道内的流动需要的精确驱动力是未知的，可以将 包括精确驱动力的驱动力范围施加于通道中。如果微流体通道内的流
体含有荧光物质，并且如果用来激发荧光物质的光足够强来光褪色荧 光物质，那么当流体通过通道的流速为零时，将产生荧光物质最大程 度的光褪色。最大化光褪色的含量最小化了由荧光物质产生的荧光量。 因此，对应于零流速的最小驱动力是产生最小量荧光的驱动力。
还任选将流体静力、灯芯作用和毛细管作用用于提供流体压力， 用于本发明中如酶、底物、调节剂或蛋白质混合物这样的物质的连续流体流动。参见，例如，Alajoki等的"METHOD AND APPARTUS FOR CONTINUOUS LIQUID FLOW IN MICROSCALE CHANNELS USING PRESSURE INJECTION, WICKING AND ELECTROKINETIC INJECTION"，代理编号 017646-0070010， U. S.系列No. 09/245， 627， 1999年2月5日申请。 在使用灯芯作用/毛细管作用的方法中，放置吸附材料或分支的毛细管 结构，以流体接触其中施加了压力的区域，由此使流体朝向吸附材料 或分支的毛细管结构移动。在本发明中，任选将毛细管力结合电动学 或基于压力的流动来使用。毛细管作用拉动物质通过通道。例如，任 选加入灯芯以抽吸流体通过固定于微通道或毛细管中的多孔基质。
本发明任选包括在基于流体流动的过程中减少物质吸附的机理， 例如，如Parce等在1999年5月11日申请的"PREVENTION OF SURFACE ADSORPTION IN MICROCHANNELS BY APPLICATION OF ELECTRIC CURRENT DURING PRESSUE-INDUCED FLOW"中所述的，代理编号01-78-0。简而 言之，可以通过使用电场如改变流动过程中物质的电流来减少基于压 力的流动过程中组分、蛋白质、酶、标记和其他物质吸附于通道壁或 其他微尺寸组件。或者，由于吸附引起的流速变化是可检测的，并通 过压力或电压的变化来调节流速。
本发明还任选包括将标记试剂、酶、调节剂和其他成分集中于微 尺寸流动路径的中心，这在通过调整流速提高测试通量中是有用的， 例如，在基于压力的流动中，例如，如H. Garrett Wada等的"FOCUSING OF MICROPARTICLES IN MICROFLUIDIC SYSTEMS"中所述的，代理编 号01-505-0， 1999年5月17日申请。简而言之，通过迫使来自相对 一侧通道中的流体流入主通道中，或通过其他流体操作，将样品物质 集中于通道中心。
在可替换的实施方案中，本发明的微流体系统可以掺入离心机转 子装置，其在离心机中旋转。由于重力和向心/离心压力，流体和颗粒 移动通过装置。
任选使用上述技术中的任一种(单独或结合)来实现本发明装置 和方法中的流体流动或颗粒流动。通常，将所涉及的控制器系统适当配置来容纳或连接在此所述的微流体装置或系统元件。例如，控制器， 任选包括将本发明的装置置于其上的台架，来帮助控制器和装置之间 合适的相接。通常，台架包括合适的安放/排列结构元件，如嵌套孔、 定位销和/或孔、不对称边缘结构(来帮助正确的装置排列)等。许多 这样的构造描述于在此所述的参考文献中。
检测
通常，微流体装置中的检测系统包括，例如，光传感器、温度传
感器、压力传感器、pH传感器、电导传感器等。这些类型的传感器中 的每一个可容易地引入在此所述的微流体系统中。在这些系统中，将 这样的检测器置于微流体装置或装置的一个或多个微通道、微室或管 道内或附近，使得检测仪处于与装置、通道或腔室的传感连通内。如 在此所用的短语"接近"特定的元件或区域，通常指的是将检测仪安 置于一定的位置，使得检测仪能够检测微流体装置的特性、微流体装 置的一部分或微流体装置的一部分的内含物，为此需要检测仪。例如， 与微尺寸通道传感流通放置的pH检测仪能够测定该通道中所置流体 的pH。相似地，与微流体装置的壳体传感流通放置的温度传感器能够
测定装置自身的温度。
可以在本发明的微流体装置中检测许多不同的分子/反应特征。例 如， 一个实施方案检测荧光或发射光。另一个实施方案检测测试中涉 及的热参数(例如，热容量等)的变化。
本发明的检测系统实例可以包括，例如，用于检测引入在此所述 的微流体系统中的微流体装置的微通道和/或微室内的物质的光学特 性的光学检测系统。这样的光学检测系统通常邻近微流体装置的微尺 寸通道来放置，并任选通过穿过装置的通道或室安置的光学检测窗口 或区域与通道传感连通。
本发明的光学检测系统包括，例如，能够测量从通道内的物质发 射出来的光的系统、物质的透射率或吸光率，以及物质的光谱特征， 例如，荧光、化学发光。检测仪任选检测标记的化合物，如荧光、比色和放射性成分。检测仪的类型任选包括分光光度仪、光电二极管、 雪崩光电二极管、显微镜、闪烁计数器、相机、二极管阵列、成像系
统、光电倍增管、CCD阵列、扫描检测仪、电流计-扫描仪、薄膜等， 及其组合。可以将发射可检测信号的蛋白质、抗体或其他成分流过检 测仪，或可替换地，检测仪可以相对于阵列移动，来测定分子位置(或， 检测仪可以同时监控多个对应于通道区域的空间位置，例如，在CCD 阵列中)。合适检测仪的实例可以从本领域已知的各种商业来源广泛 获得。对于光学元件的常见来源，请参阅，The Photonics Design and Application Handbook,第1、2、3和4册,由Laurin Publishing Co.， Berkshire Common, P.O. Box 1146， Pittsfield， Mass每年出版。
如上所述，本发明的装置包括，如微流体装置通常那样，可以监 控信号例如荧光的检测窗口或区域。该检测窗口或区域任选包括可以 可视和光学观察和检测测试结果的透明覆盖物，例如，观察比色、荧 光或放射性应答，或比色、荧光或放射性成分速度的变化。
本发明的另 一个任选实施方案涉及使用荧光关联能谱法和/或共 焦纳米荧光技术来检测微流体装置中分子的荧光。这样的技术是容易 获4寻的(侈寸^口，来自Evotec、 Hamburg、 Germany)并5步及检观寸来自通 过共焦透镜的光聚焦区域扩散的分子的荧光。所观察到的任何光子爆 炸的长度将对应于分子共焦聚焦中花费的时间。通过该区域的分子的 扩散系数可以用来测量，例如，结合的程度。用于分析的各种算法可 以用来评价来自单个分子的荧光信号，基于例如亮度、荧光寿命、光 谱移动、FRET、淬灭特征等的变化。
如上所述，本发明的装置和方法的传感器或检测部分可以任选包 括多个不同的装置。例如，可以通过例如光电倍增管、电荷耦合器件 (CCD)(或CCD相机)、光电二极管等来检测荧光。
光电倍增管是本发明的任选方面。光电倍增管(PMT)是将光(光 子)转化成电子信号的装置。将通过PMT的每个光子的检测扩大成更 大且更容易测量的电子脉沖。PMT是许多实验室应用和设置中常用的， 并且是本领域技术人员公知的。本发明的另一个任选实施方案包括电荷偶联器件。CCD相机是非 常有用的，因为它们甚至可以检测非常小量的电磁能量(例如，本发 明中由荧光团发射的)。CCD相机由半导体硅片制得，在光电子撞击 硅片时，硅片释放游离电子。电子输出与撞击硅片的电子量成线性正 比。这使得成像亮度和所观察到的情况的实际亮度之间相关。CCD相 机非常适于荧光发射的成像，因为它们甚至可以检测非常微弱的情况， 可以在宽的光语范围中工作，并可以检测非常亮和非常弱的情况。CCD 相机是本领域技术人员公知的，并且几个合适的实例包括由以下形成 的那些Stratagene (La Jolla， Calif.)， Alpha-I画tech (San Leandro， Calif.)， and Apogee Instruments (Tucson, Ariz.)。
本发明再一个任选的实施方案包括使用光电二极管来检测微流体 装置中分子发出的荧光。光电二极管吸收入射的光子，其引起光电二 极管中的电子穿过二极管中区域的扩散，因此引起穿过装置的可测量 电势差异。该电势可以测量并与入射光的强度成正相关。
在一些方面中，检测仪测量从物质如荧光或化学发光物质发射的 光含量。因此，检测系统通常包括收集光学器件，用于收集通过检测 窗口或区域发射的基于光的信号，并将信号传送给合适的光检测仪。 容易地使用不同放大倍数、视野直径和焦点长度的显微镜物镜，作为 该光学系列的至少一部分。通常将检测系统连接计算机(以下将更详 细地描述)，通过模数或数模转换器，用于将检测到的光数据传送至 计算机，用于分析、存储和数据操作。
在荧光物质如标记的细胞或荧光指示剂染料或分子的情况中，检 测仪任选包括光源，其产生用于激活荧光物质的合适波长的光，以及 用于指引光源至通道或室中所含物质的光学器件。光源可以是任一种 提供合适波长的光源，包括激光、激光二极管和LED。任选将其他光 源用于其他检测系统。例如，用于光散射/透射率检测方案的宽带光源 等。通常，光选择参数是本领域技术人员公知的。
检测仪可以作为分开的装置存在，但是优选与控制器系统整合成 单个装置。这些功能整合成单个装置有助于这些装置与计算机的连接
51(以下将描述)，通过允许使用几个或单个连通端口，用于传送控制 器、检测仪和计算机之间的信息。检测系统和计算机系统的整合通常 包括用于将检测仪信号信息转化成测试结果信息的软件，测试结果信 息例如为底物浓度、产物浓度、目标化合物的存在等。
在本发明的另 一个方面中，使用量热检测系统实现本发明中分子 的物理变化的监控。在量热测试中，随着分子经历由于温度变化引起 的解折叠测量热容量的变化。任选将滴定量热法和/或差示扫描量热法
用于测定本发明目标分子的测试分子的热参数。参见，例如，Brandts, J.等(1990) "Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry" Biochem 29 (29): 6927-6940。量热测量装置可从各种来源获得并且它们的4t准 和使用是本领域技术人员公知的。
计算机
如上所述，流体指引系统和/或检测系统之一或两者与合适编程的 处理器或计算机相连，这些处理器或计算机用来命令这些装置根据预 先编程的或使用者输入的指令的运行，接受来自这些装置的数据和信 息，并将该信息解释、操纵和报道给使用者。.因此，通常将计算机合 适地连接这些装置之一或两者(例如，按照需要，包括模数或数模转 换器)。
计算机任选包括用于接收使用者指令的合适软件，以使用者输入 设定参数区域例如GUI中的形式，或以预先编程的指令的形式，例如， 预先编程用于各种不同的特定操作。然后软件将这些指令转化成合适 的语言，用于指示流体指引和转运控制器的操作，以进行所需的操作。
例如，任选将计算机用于指引流体指引系统来控制流体流动，例 如，通过各种互连的通道。流体指引系统任选指引多个分子的至少第 一成员移动进入多个通道的第一成员中，同时指引多个分子的至少第 二成员移动进入一个或多个检测通道区域。流体指引系统还指引多个 分子的至少第一成员移动进入多个通道中，同时孵育多个分子的至少第二成员。还指引多个分子的至少第一成员移动进入一个或多个检测 通道区域，同时孵育多个分子的至少第二成员。
通过配合通道转换，系统以所需的时间间隔，例如，高于1分钟，
约每60秒或更短，约每30秒或更短，约每10秒或更短，约每1. 0 秒或更低，或约每O. l秒或更短，指引多个分子的至少一个成员移动 进入多个微通道中和/或指引一个成员进入检测区域。每个样品，使用 如上所述的合适通道转换，保持于多个通道中，持续所需的时间段， 例如，约0. 1分钟或更短至约60分钟或更长。例如，样品任选保持于 通道中，持续选定的孵育时间，例如，20分钟。
然后计算机接收来自系统内包括的一个或多个传感器/检测仪的 数据，并解释数据，以使用者理解的形式来提供，或使用数据来进一 步启动控制器指令，根据编程，例如，如在流速、温度、所用电压等 的监控和控制中。
在本发明中，计算机通常包括用于监控和控制通道中物质的软件。 例如，软件指引通道转换来控制和指引流动，如上所述。此外，任选 使用软件来控制动电学或压力调节的物质的注入或取出。^吏用注入或 取出来调节流速，如上所述。计算机通常还给例如控制器或流体指引 系统提供指令，用于转换通道之间的流动，来获得高通量形式。
此外，计算机任选包括用于从检测系统解巻积一种信号或几种信 号的软件。例如，解巻积区分两种可检测的不同光谱特征，这两种特 征都是可检测的，例如，当底物和产物包括可检测的不同标记时。
任何控制器或计算机任选包括监测器，其通常是阴极射线管 ("CRT")显示器、平板显示器(例如，有效矩阵液晶显示屏、液晶 显示屏)等。从微流体装置产生的数据，例如，来自结合测试的热特 性曲线，任选以电子形式显示在监测器上。此外，可以以打印的形式 输出从微流体装置收集的数据，例如，热特性曲线，或其他数据。不 管是打印形式或电子形式的数据(如监测器上显示的)，可以是不同 或多重形式，例如，曲线、直方图、数字系列、表格、图等。
通常将计算机电路置于盒子中，其包括，例如，大量的集成电路芯片，如微处理器、存储器、接口电路。该盒子还任选包括硬盘驱动
器、软盘驱动器、高容量可拆驱动器，如可写入CD-ROM，和其他常见 的外周元件。任选提供输入设备如键盘或鼠标，用于使用者输入和用 于使用者选择在相关计算机系统中待比较或其他操作的序列。
实例集成系统
图1，画面A、 B和C以及图2提供了关于实例集成系统的其他详 细内容，该系统任选用于实施在此的方法。根据本发明的集成系统包 括微流体装置1QQ，其是可更换的部件，如盒式磁盘或盒式磁带一样， 其与仪表200相接。图1和2中所示的微流体装置包括壳体结构102， 其具有置于其中的主通道104。任选将样品或组分的混合物从吸移管 管理器120朝向存储器114流动，例如，通过在存储器114 (或系统 中的另一个点)施加真空或通过施加合适的电压梯度。因此，吸移管 管理器表示流体流劫途径中最远的上游点，而存储器114表示流体流 动途径中最远的下游点。或者，在例如存储器108、 1U或通过吸移管 管理器通道120施加真空。任选将在此所述的其他物质，如緩沖液、 底物溶液、酶溶液、测试分子、荧光指示剂染料或分子等从孔例如108 或112中流出并流入主通道104。任选通过调节流体压力，或通过所 述的动电学方法(或两者)来进行从这些孔中的流出。随着流体加入 主通道104,例如，来自存储器108,流速提高。任选将一部分来自主 通道104的流体流入流动降低通道106或110来降低流速。图1中所 示的通道排列只是许多合适的并可以用于本发明中的排列中的一种。 例如，可以通过将在此所述的微流体元件例如流动降低通道结合在此 参考的专利和申请中所述的其他微流体装置来设计其他替换方案。
样品和材料任选从列举的孔中或从壳体结构外部的来源流出。如 所示的，集成系统任选包括吸移管管理器通道120，例如，从壳体102 突出，用作微流体系统外部的材料源的入口。通常，外部源是微量滴 定皿或其他方便的存储介质。例如，如图2中所示的，吸移管管理器 通道120可以进入微孔平板208，其在平板的孔中包括样品材料(例如，测试分子和/或目标分子)、緩沖液、底物溶液、荧光指示剂染料 或分子、酶溶液等。
与微流体装置100相接的设备200可以进行各种不同的功能提 供驱使流体通过芯片中通道的驱动力、监控和控制微流体装置通道内 的条件(例如，温度)、检测从芯片发出的信号、将流体引入和将流 体从芯片中提取出来，以及其他许多可能的情况。根据本发明的设备 200通常是受计算机控制的，使得可以将它们编程，以与不同类型的 微流体装置相接，和/或在特定的微流体装置内进行所需的处理。微流 体装置通常以U. S.专利No. 5， 955， 028; 6, 071,478; 6,399, 023;和 6， 399， 025中所示的方式与设备相接。
检测仪206与通道104传感相连，检测例如由标记的物质流过检 测区域引起的信号、热容量或其他热参数的变化等。任选将检测仪206 与装置中需要检测的任何通道或区域相连。将检测仪206可操作地连 接计算机204，其数字化处理、存储和操纵由检测仪206检测到的信 号信息，例如，使用上述的任何设备，例如，或任何其他设备装置， 例如，用于测定浓度、分子量或强度等。
流体指引系统202控制电压、压力，或两者，例如，在系统的孔 中或通过系统的通道，或在流动连接通道104或上述其他通道的真空 连接处。任选，如所示的，计算机204控制流体指引系统202。在一 套实施方案中，计算机204使用信号信息来选择更多的用于微流体系 统的参数。例如，检测来自微孔平板208的样品中目标成分的存在时， 计算机任选指引将其他可能的目标成分的调节剂加入系统中。
温度控制系统210控制系统的孔中或通过系统的通道的焦耳和/ 或非焦耳加热，如在此所述的。任选，如所示的，计算机204控制温 度控制系统210。在一套实施方案中，计算机204使用信号信息来选 择更多的用于微流体系统的参数。例如，检测通道l(H中样品的理想 温度时，计算机任选指引将例如可能的结合分子(即，测试分子)或 荧光指示剂染料或分子加入系统中。
监测器216显示由微流体装置产生的数据，例如，从结合测试产
55生的热特性曲线。任选，如所示的，计算机204控制监测器216。此 外，将计算机204连接并指引其他部件，如打印机、电子数据存储设 备等。
可以用于图2系统中的特定微流体装置100的实例显示于图10 中。该微流体装置能够进行连续流动PCR和熔化曲线分析。装置的连 续流动PCR部分的操作详细描述于U. S.公开的申请No. 2002/0197630 和2005/0042639中。简而言之，连续流动PCR过程涉及使用图1和2 的芯片设计示意图中所示的微流体吸移管管理器芯片来携带DNA样品 (例如，基因组DM)至芯片100上，使用压力梯度通过吸移管管理 器进入分布通道105。在连续流动下，以装配线的方式，首先将样品 与来自芯片上的试剂存储器中的共用试剂通过共用试剂通道106混 合，然后分成8等份，分配至8个独立的分析通道110-118中。将每 个等份试样与来自通道特异性芯片存储器的基因座特异性试剂混合， 以形成反应混合物，然后流过加热区域130，该区域包括接近扩增微 通道110-118的金属轨道，以提供芯片100的受控加热区域。用于通 道特异性试剂进入通道110-118的试剂添加提供了一流的微流体方 法，其提供了芯片上的"热启动"，其中就在扩增前，将所有试剂加 入分析通道中。大致地循环区域的温度(控制温度设定点和各自的停 留时间)，用于加热区域130的通道中的PCR条件。选择加热通道长 度和流体速度，使得总PCR循环满足所需的数量，通常为25至40个 循环，尽管也可以使用具有短循环时间和高循环数目的无效PCR方法。
PCR扩增后，可以通过检测区域135内的八个通道长度内的熔化 曲线分析来表征扩增子。在一些实施方案中，可以通过停止通道横向 检测区域135内的流动，然后通过使用任一种之前所述的温度控制方 法在检测区域135内跳跃温度来进行熔化曲线分析。可以使用任一种 之前所述的可检测特性来监控变性的程度。在可替换的实施方案中， 使用沿着横过检测区域135的八个通道的每一个的长度进行的连续流 动形式熔化曲线分析来进行熔化曲线分析。如图9A-9C中所示实施方 案中所说明的，可以在连续流动过程中进行扩增子的熔化曲线分析，通过将含有扩增子的流体流过微流体通道，该通道沿着其长度具有施
加于其的热梯度。因此，可以在图io中所示的装置中，通过沿着横过
检测区域135的八个通道的长度使用温度梯度进行连续流动形式熔化 曲线分析。
在 一个说明性的实施方案中，在图10所示的微流体装置中进行连 续流动形式熔化曲线分析，通过将装置置于包括图IIA-D中所示的接 口模件1100的集成系统中来进行。接口模件1100包括基础部分1105 和蛤壳型盖子1110。配置接口模件1100以在基础部分1105的接收区 域内接收图IO的微流体装置，基础部分1105通常在图IIA的圆形区 域1120内。一旦将微流体装置置于基础部分的接受区域1120的顶部， 将盖子1110密封，使得各个通道(例如，110-118)末端的至少一些 孔(例如，160、 170、 180)与盖子上的接口元件1115啮合。这些接 口部件提供了驱使流体通过微流体装置的通道的驱动力，如电压或压 力。盖子1110上的其他接口部件115使得电接触金属轨道的末端150, 金属轨道是用作微流体装置的加热区域130中的电阻加热元件。基础 平板1105的接收区域1120可以包括多个独立操纵微流体装置不同区 域温度的温度控制系统。在图11B-11D中以详细的递增水平显示了图 11A-11D的实施方案中的温度控制系统。 一种温度控制系统包括流体 通路1130，将微流体装置置于接收区域1120之上并通过盖子1110的 密封保持于适当位置时，该通路形成封闭的流体通路。配置接口模件 1100,使得流体通道1130直接在微流体装置的加热区域130的下面。 通过将电流穿过金属轨道来加热通过加热区域130的通道110-118的 部分来完成PCR所需要的热循环，而将接触微流体装置背面的流体可 替换地用于快速冷却该部分的通道。使用第二温度控制系统来分开控 制微流体装置中进行热熔化分析的部分135和含有废物孔180的微流 体装置部分的温度。第二温度控制系统包括接触与废物孔180相对的 微流体装置背面部分的第一热模块1140，和接触微流体装置的分析部 分135下面的微流体装置背面部分的笫二热模块1145。从图11D的分 解图可以最好地看到，第一热模块11"与第一热电冷却装置1144(即，珀耳帖装置)热接触，而第二热模块1145与笫二热电冷却装置1142 热接触。可以独立控制两个热电冷却装置1142， 1144，因此给微流体 装置的分析部分135和废物孔180部分提供了独立的温度控制。
在说明性的实施方案中，将第一热电冷却装置1144用来将微流体 装置的废物孔180区域的温度控制在25'C的恒温。第二热电冷却装置 1142用来将微流体装置的分析区域135的温度从60。C跳跃至95°C， 以0. 1。C/秒至1. 0匸/秒的范围内的速率，包括端点，使得可以对分析 区域135中的通道内存在的扩增子进行停流型热熔化分析、
帮助微流体装置的废物孔和分析区域的独立温度控制的接口模件 1100的一个特征是通过气隙隔开第一 1140和第二 1145热模块，该气 隙防止了第一和第二热模块之间的热转移。尽管两个热模块1140， 1145通过气隙分开，两个热电加热器1142， 1144都连接在共用的散 热器1150上。共用散热器1150的使用提供了优于使用分开的散热器 的益处，在使用分开的散热器的实施方案中，分析区域135的温度设 定点高于废物孔180区域的温度设定点。这些益处是因为为了维持微 流体装置的废物孔部分中的25°C恒温热量通常从该部分移出而引起 的，而必须将热量加入微流体装置的分析部分，以便达到进行热熔化 分析所需的温度。由于散热器1150从一个热电冷却器移出热量并将热 量加入另一个热电冷却器中，温度趋于稳定在3(TC左右。由于最小化 加热或冷却物体和散热器之间的热梯度时，热电冷却器能最好地工作， 这提高了整个系统的效率。当运行图11A-11D中所示的系统时，可以 独立地控制微流体装置的两个区域的温度。尽管使用共用的散热器特 别有利，但对不同的热电冷却器使用分开的散热器也与本发明的实施 方案相容。
将图11A-11D中所示的设备和图IO中所示的微流体装置用来扩增 来自基因组DNA的85bp目标物，在DM结合染料SYBR Green I的存 在下进行，该染料结合双链DNA时是荧光的。在微流体装置中，将扩
增产物以大约o. rc/s的速率接受从60x:至95t:的热梯度。图12A
显示了随着时间的热跳跃(下图)和荧光信号的变化(上图)。图12A上部分中框出的区域是DNA热熔化的区域。图12B中绘制了荧光的负 变化(dF)除以温度变化(dT)作为温度的函数，用于图12A中框出 的区域。该曲线中单峰的温度表示85bp目标物的DNA变性曲线中点的 温度或L值。 测试套装
本发明还提供了用于进行本发明的结合测试的套装。特别地，这 些套装通常包括用于进行本发明测试的微流体装置、系统、模块和工 作站。套装通常含有用于本发明的多模块工作站的装配和/或操作的其 他部件，包括但不限于，机器人元件(例如，追踪机器人、机器人电 枢等)、平板操纵装置、流体操纵装置和计算机(包括，例如，输入 装置、监测器、CPU等)。
通常，任选将在此所述的微流体装置包装，以包括用于执行装置 功能的试剂。例如，试剂盒可以任选包括所述的任何微流体装置和测 试组分、緩冲剂、试剂、酶、血清蛋白、受体、样品物质、抗体、底 物、对照物质、间隔物、緩冲剂、不混溶液体等，用于进行本发明的 测试。在包装的试剂的情况中，套装任选包括预先测量的或预先定量 的试剂，随时可以将其引入测试方法中，而不需要测量，例如，预先 测量流体等份试样，或预先称重或预先测量固体试剂，其可以通过套 装的最终使用者容易地重建。
这样的套装通常还包括合适的使用装置和试剂的说明书，并且在 试剂没有预先置于装置自身中的情况中，具有将试剂引入装置的通道 和/或腔室中的合适说明书。在后一种情况中，这些套装任选包括特定 的辅助装置，用于将物质引入微流体系统中，例如，合适配置的注射 器/泵等(在一个实施方案中，装置自身包括吸移管管理器元件，如用 于将物质引入装置内通道和腔室中的电吸移管管理器)。在前一种情 况中，这样的套装通常包括具有预先置于装置的通道/腔室内的必需试 剂的微流体装置。通常，以稳定的形式提供这样的试剂，以便在延长 的存储过程中防止降解或其他损失例如渗漏。各种稳定方法广泛用于 待储存的试剂，如包括化学稳定剂(即，酶抑制剂、杀微生物剂/抑菌剂、抗凝血剂)、材料的物理稳定，例如，通过固定于固体支持物上、 捕获于基质中(即，珠子，凝胶等)、冻干等。
本发明套装的元件通常在单个包装或一套相关包装中包装在一 起。包装任选包括书面的说明书，用于进行一个或多个根据在此所述 方法的目标独立测试。套装还任选包括用于容納装置、系统或试剂成 分的包装材料或容器。
以上的讨论通常适用于在此所述的本发明的各个方面和实施方 案。此外，通常对在此所述的方法和装置进行改进，而没有脱离所要 求的本发明的精神和范围，并且任选使本发明具有多种不同的用途，
包括以下的
使用含有至少第一底物并具有第一通道和横穿第一通道的第二通 道、至少一个具有至少一个横截面大小为0.1至500 um的通道的微流 体系统，以便测试多个测试化合物中的每一种对包括一个或多个聚焦 细胞或颗粒的生物化学系统的作用。
使用如在此所述的微流体系统，其中生化系统基本上连续地流过 所述通道之一，提供例如多个测试化合物的按序测试。
使用如在此所述的微流体装置来调节微通道内的反应。
使用如在此所述的微流体装置中的动电学注射来调节或获得通道 中的流动。
使用如在此所述的微流体装置中的灯芯、动电学注射和基于压力 的流动部件的组合来调节、聚焦或获得例如装置的通道中的物质流动。 使用在此所述的任一种微流体系统或底物的测试。 尽管为了清楚和理解的目的，之前已经以一定的详细程度描述了 本发明，本领域技术人员从阅读该公开内容将清楚可以形成各种形式 和详细内容的变化，而没有脱离本发明的真实范围。例如，可以以各 种组合使用上述的所有技术和装置。本申请中引用的所有出版物、专 利、专利申请或其他文献在此以其整体引入作为参考，用于所有目的， 至如同每个单独的出版物、专利、专利申请或其他文件单独表示引入 作为参考用于所有目的的相同程度。
权利要求
1. 在微流体装置中进行核酸的热熔化分析的方法，该方法包括提供具有至少一个微流体通道的微流体装置，该至少一个微流体通道具有上游部分和下游部分，将包括核酸和扩增试剂的流体引入微流体通道中，使得流体从通道的上游部分流入下游部分，循环上游部分中的温度，使得核酸经历扩增，使流体在下游部分中接受一系列温度，其中该系列温度包括足够高以致能够引起核酸变性的温度，和测量从流体中发出的可检测特性，该特性指示下游部分中核酸的变性程度。
2. 权利要求l的方法，其中核酸是DM。
3. 权利要求1的方法，其中将流体引入微流体通道中的步骤包括 引导流体通过从微流体装置延伸出来的吸移管管理器。
4. 权利要求1的方法，其中通过施加于微流体通道的压力差促使 流体从上游部分流至下游部分。
5. 权利要求1的方法，其中循环上游部分中温度的步骤包括将上 游部分的不同区域控制于不同的温度，由此随着流体流过上游部分的不 同区域来循环流体的温度。
6. 权利要求5的方法，其中将上游部分的不同区域控制于不同温体来焦耳加热上游部分，由此电流将不同的区域加热至不同的温度。
7，权利要求5的方法，其中将上游部分的不同区域控制于不同温 度的步骤包括安置不同温度的热模块，使其与上游部分的不同区域热接触。
8.权利要求1的方法，其中循环温度的步骤包括循环整个上游部 分的温度，由此通过流体穿过上游部分花费的时间量来测定流体流过上 游部分时接受的热循环数。
9. 权利要求8的方法，其中整个上游部分的温度循环包括改变用 于焦耳加热上游部分的电流。
10. 权利要求8的方法，其中整个上游部分的温度循环包括使用非 焦耳加热方法改变上游部分的温度。
11. 权利要求10的方法，其中非焦耳加热方法包括使上游部分热 接触热模块，其中通过改变热模块的温度来循环温度。
12. 权利要求10的方法，其中非焦耳加热方法包括使电流通过热 接触上游部分的电阻加热元件，其中通过改变穿过电阻加热元件的电流 来循环温度。
13. 权利要求12的方法，其中将电阻加热元件配置于微流体装置 的表面上。
14. 权利要求12的方法，其中非焦耳加热方法进一步包括安置散 能装置，使其与上游部分热接触。
15. 权利要求1的方法，其中扩增包括使用PCR。
16. 权利要求15的方法，其中扩增试剂包括引物、热稳定聚合酶 和核苷酸。
17. 权利要求l的方法，其中扩增包括使用LCR。
18. 权利要求l的方法，其中在下游部分使流体接受一系列温度的 步骤包括在下游部分中停止流体的流动，并改变下游部分内所含静止流 体的温度。
19. 权利要求18的方法，其中改变流体的温度包括连续提高流体 的温度。
20. 权利要求i9的方法，其中以o. rc/秒至rc/秒范围的速率连 续提高流体的温度。
21. 权利要求19的方法，其中以o. orc/秒至o. rc/秒范围的速率连续提高流体的温度。
22. 权利要求19的方法，其中以1X:/秒至10。C/秒范围的速率连续提高流体的温度。
23. 权利要求19的方法，其中使用焦耳加热连续提高流体的温度。
24. 权利要求19的方法，其中使用非焦耳加热连续提高流体的温度。
25. 权利要求24的方法，其中非焦耳加热包括使用与下游部分热 接触的热模块来加热下游部分。
26. 权利要求l的方法，其中可检测特性包括荧光。
27. 权利要求26的方法，其中通过FRET或分子信标来产生荧光。
28. 权利要求27的方法，其中通过荧光染料产生荧光，并且其中 由荧光染料产生的荧光量指示核酸的热变性程度。
29. 权利要求28的方法，其中荧光染料是插入染料。
30. 权利要求29的方法，其中荧光染料是溴化乙锭。
31. 权利要求28的方法，其中荧光染料是小沟结合染料。
32. 权利要求31的方法，其中荧光染料是SYBR绿色染料。
33. 权利要求l的方法，其中在下游部分中将流体接受一系列温度 的步骤包括将流体连续流过下游部分，其中下游部分内的温度沿着其长 度连续变化，由此流过下游部分的流体的温度沿着下游部分的长度连续 变化。
34. 权利要求33的方法，其中沿着下游部分的长度变化温度包括 沿着通道的长度连续提高温度。
35. 权利要求34的方法，其中沿着下游部分长度的温度变化是线 性的。
36. 权利要求35的方法，其中调节沿着下游部分长度的线性温度变化和流体流速，使得以o.rc/秒至rc/秒范围的速率连续提高沿着 下游部分长度流动的流体温度。
37. 权利要求35的方法，其中调节沿着下游部分长度的线性温度变化和流体流速，使得以o. orc/秒至o. 1。c/秒范围的速率连续提高沿 着下游部分长度流动的流体温度。
38. 权利要求35的方法，其中调节沿着下游部分长度的线性温度变化和流体流速，使得以rc/秒至10。c/秒范围的速率连续提高沿着下 游部分长度流动的流体温度。
39. 权利要求33的方法，其中将下游部分与热模块热接触，该热 模块在对应于通道下游部分长度方向的方向上连续改变温度。
40. 权利要求39的方法，其中通过将热模块的第一位置和第二位 置分别与第一珀耳帖装置和第二珀耳帖装置热接触来产生热模块的温 度变化，其中将第一珀耳帖装置控制于第一温度，而将第二珀耳帖装置 控制于笫二温度，由此第一位置和第二位置之间的温度在第一温度和第 二温度之间连续变化。
41. 权利要求33的方法，其中通过连续改变下游部分的沿着其长 度的横截面并使电流通过流过下游部分的流体来产生沿着下游部分长 度的温度变化。
42. 权利要求33的方法，其中测量可检测特性的步骤包括测量沿 着下游部分长度的多个位置的可检测特性，由此测量从多个温度的流体 发出的可检测特性。
43. 权利要求l的方法，其中可检测特性是荧光偏振。
44. 权利要求l的方法，其中可检测特性是UV吸光率。
45. 权利要求l的方法，其中可检测特性选自热容量、电阻和介电 特性。
46. 测定微流体装置通道内对应于基准温度的物理参数值的方法， 该方法包括将包括已知L的分子的流体流过通道， 改变与通道内温度相关的物理参数，通过测量作为参数函数的分子可检测特性值来产生该分子的热特 性曲线；和在对应于分子Tm的热特性曲线的点测定可检测特性和参数的值。
47. 权利要求46的方法，其中已知L的分子是具有已知序列的核酸。
48. 权利要求47的方法，其中核酸是DNA。
49. 权利要求46的方法，其中物理参数是与通道热接触的热模块 的温度。
50. 权利要求46的方法 力口于流体的电流。
51. 权利要求46的方法 电阻加热元件的电流。
52. 权利要求51的方法 的表面上。
53. 权利要求46的方法 体流过通道。
54. 权利要求46的方法，
55. 权利要求46的方法，
56. 权利要求54的方法其中物理参数是为了焦耳加热流体而施 其中物理参数是施加于与通道热接触的 其中将电阻加热元件配置于微流体装置 其中通过施加于通道的压力差来引导流其中可检测特性包括焚光。 其中通过FRET或分子信标来产生荧光。 其中通过荧光染料来产生荧光，并且其 中由荧光染料产生的焚光量指示已知L的分子的热变性程度。
57. 权利要求56的方法，其中荧光染料是插入染料。
58. 权利要求56的方法，其中荧光染料是溴化乙锭。
59. 权利要求56的方法，其中荧光染料是小沟结合染料。
60. 权利要求59的方法，其中荧光染料是SYBR绿色染料。
61. 权利要求46的方法，其中分子选自生物素、生物素-4-荧光素、 荧光素生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性链亲和素。
62. 测定微流体装置的热惯性的方，，该方法包括将含有荧光物质的流体流过微流体装置内的通道，其中由荧光物质 产生的荧光量随着温度而改变，改变微流体装置外表面的温度，其中变化包括具有可识别特征的模 式，其中外表面的温度变化在通道内产生相应的温度变化，并且其中通 道内的温度变化产生了由荧光物质产生的荧光量的相应变化，测量通道内由荧光物质产生的荧光，和通过测量外表面上可识别特征的施加和由荧光物质产生的荧光可 识别特征出现之间的时间延迟来测定外表面的温度变化和荧光量变化 之间的时间偏差，由此该时间偏差指示热惯性。
63. 权利要求62的方法，其中模式是正弦波。
64. 权利要求63的方法，其中可识别特征是正弦波的最大值。
65. 测定微通道中的流体是流动的或是静止的方法，该方法包括 施加 一 定范围的驱动力使流体以 一 定范围的流速流过微通道，其中该流体含有荧光物质，并且其中流速范围包括零流速， 用足够强度的光激发荧光物质，使荧光物质光褪色， 在所述流速范围中的多个流速下测量微通道内的荧光物质发出的荧光量，测定从焚光物质发出的荧光量最小时的流速，由此该流速是零流
全文摘要
本发明提供了使用微流体技术来产生分子熔化曲线的新方法和装置。特别地，根据本发明的装置和方法在提供PCR扩增产物的分析中是有用的。
文档编号B01J19/00GK101426933SQ200780012761
公开日2009年5月6日 申请日期2007年2月9日 优先权日2006年2月9日
发明者A·博兰凯, A·法班斯, A·鲁里森, D·J·伯勒斯, E·多隆, I·T·奈特, M·R·纳普, M·斯拉特, R·莫逖, S·A·桑德伯格, W·B·董 申请人:凯乐普生命科学公司;佳能美国生命科学公司