专利名称：亲和颗粒和亲和分离方法
技术领域：
本发明涉及亲和颗粒和亲和分离方法。更具体的说，涉及利用了 无机颗粒的亲和颗粒和可高精度且容易地分离目标物质的亲和分离 方法。对于可高精度且容易地检测目标物质的免疫沉淀法、胶乳凝集 法等为代表的各种分离、纯化、4佥测方法也极为有用。
背景技术：
以往，生物体物质的分离纯化是采用柱层析。但是，柱分离中有 以下(])-(3)所示的致命的问题。
(1) 为了获得目标物质，必须使用多种柱，纯化效率差。
(2) 必须进行确认实验，以确认分离成分中是否含有目标物质，因此 纯化需要较多时间。
(3) 纯化时的损失大，需要大量的样品。
为解决上述问题，在目标物质的分离纯化中采用了担栽有配体的 亲和柱或亲和颗粒(专利文献、专利文献2)。
但是，通过亲和柱进行分离纯化有以下的问题。
(1) 所需目标物质无法选择性分离。即，除被配体捕获的目标物质之 外，不希望的目标物质也吸附在柱上。
(2) 捕捉效率低，需要大量的液体试样。
另外，在将亲和颗粒分散在液体试样中进行分离的亲和分离方法 中，要使用琼脂糖等(非专利文献1),这有以下问题。(1) 所需目标物质无法选择性分离。即，除被配体捕获的目标物质之 外，不希望的目标物质也吸附于亲和颗粒上。
(2) 比重轻，难以分离亲和颗粒。
(3) 容易发生载体的崩解，耐久性低。
域技术人员并没有想到利用无机颗粒作为亲和颗粒。 专利文献1:日本特公平8-26076号公报 专利文献2:日本特表2002-5U]41号公报 非专利文献1: Bioconjugate Cliem.; 2002; 13(2); 163-16
发明内容
发明所要解决的课题
本发明提供具有划时代意义的亲和分离方法，该方法通过利用了 便宜的无机颗粒的亲和颗粒，可简便且高精度地分离目标物质。另外， 对于以可高精度且容易地检测目标物质的免疫沉降法、胶乳凝集法等 为代表的各种分离、纯化、检查方法极为有用。
解决课题的方法
即，本发明提供亲和颗粒，其特征在于无机颗粒的表面以共价 键的形式具有下述式(l)所示磷酰胆碱基。 [化4]
A O—P一O
(1)
本发明还提供亲和颗粒，其特征在于无机颗粒的表面以共价键 的形式具有下述式(l )所示的磷酰胆碱基，无机颗粒的表面以共价键或 吸附的形式具有可与对某种目标物质具有特异亲和性的配体结合的
5反应基团或吸附基团。 [化5]
<formula>formula see original document page 6</formula>
(1)
本发明又提供亲和颗粒，其特征在于无机颗粒的表面以共价键 的形式具有下述式(])所示的磷酰胆碱基，无机颗粒的表面以共价键或 吸附的形式具有与某种目标物质具有特异亲和性的配体。 [化6]
<formula>formula see original document page 6</formula>(1)
本发明还提供上述亲和颗粒，其特征在于上述无机颗粒为选自 二氧化硅、氧化钛、锌白、氧化铝、氧化铁、滑石粉、云母、绢云母、 胶体金的一种或多种无机颗粒，其平均粒径为20nm-500 ^m，比重为 ].O g/cm3以上。
本发明又提供上述亲和颗粒，其特征在于上述配体为选自各种 抗体、抗原、酶、底物、受体、凝集素、肽、DNA、 RNA、核酸配体、 蛋白A、蛋白G、抗生物素蛋白、生物素、螯形化合物、各种金属离 子的一种或多种配体。
本发明还提供通过无机颗粒进行的目标物质的亲和分离方法，其 特征在于包含以下步骤(1)使权利要求1或2的亲和颗粒与任意的 配体结合的第]步骤，(2)使第1步骤中制造的亲和颗粒分散于液体 试样中的第2步骤，其中液体试样含有被任意的配体选择性捕获的目 标物质，(3)回收由亲和颗粒捕获的目标物质的第3步骤。
本发明又提供通过无机颗粒进行的目标物质的亲和分离方法，其特征在于包含以下步骤(])使权利要求3的亲和颗粒分散于液体试 样中的第1步骤，其中所述液体试样含有被任意的配体选择性捕获的 目标物质，(2)回收由亲和颗粒捕获的目标物质的第2步骤。将本发 明的亲和颗粒应用于免疫沉淀法或胶乳凝集法等抗体或蛋白的检测 时，不需要(2)的回收步骤，可通过目视，通过其分散状态的变化容易 地进行确认。
发明效果
本发明的亲和颗粒通过配体只捕获某种目标物质(希望分离的目 标物质)，并抑制其它物质吸附于颗粒上，因此分离选择性极高。由于 其优异的分散性和极容易从液体试样中分离，通过利用了便宜的无机 粉末颗粒的亲和颗粒，即可简便且高精度地分离目标物质。
也就是说，本发明的目标物质的分离方法可以在短时间且有效、 简便地分离以分离为目的的目标物质。通常，物质具有吸附异物的性 质，以往的亲和颗粒难以有效地只分离目标物质，但通过用磷酰胆磁， 基修饰颗粒表面，可极有效地防止其它物质与亲和颗粒的非特异性吸 附，可提高纯化效率。
另外，磷酰胆碱基具有极高的亲水性，在含有水的液体试样中， 也具有使亲和颗粒的分散性提高的功能。
并且，通常的颗粒具有因盐而凝集的倾向，例如要从血清中分离 目标物时，由于血清中的各种盐而发生凝集，纯化效率降低，但本发 明的亲和颗粒在盐存在下也很少凝集，可有效地回收目标物质。
本发明使用的亲和颗粒由无^/L颗粒构成，因此比重高，通过静置 或轻度离心即可容易地回收。另外将该颗粒作为载体装柱，也可以以 亲和柱的形式用于目标物质的回收。
附图简述
图〗是表示本发明的亲和颗粒与以往的亲和颗粒在捕获蛋白质时。
图2是合成例]制造的化合物的结构式和NMR波语。 图3是合成例2制备的化合物的结构式和NMR波语。 图4是使用合成例5制备的PC颗粒(A)、 (B)、 (C)和合成例6制
备的Af颗粒(A)、 (B)、 (C)进行P定量的结果。
图5是参考例1制备的PC颗粒(A)的31P-CPMAS波谱。
图6是参考例1制备的PC颗粒(A)的FT-IR波语。
图7是参考例3制备的PC颗粒(C)的]3C-CPMAS波谱。
图8是对参考例1、 2、 3制备的PC颗粒(A)、 (B)、 (C)抑制蛋白
质非特异吸附的评价。
图9是实施例1中进行的使用Af颗粒(A)的对抗牛白蛋白抗体、
抗人血红蛋白的选择性的评价。
图10是实施例2中进行的使用Af颗粒(B)的对抗牛白蛋白抗体、
抗人血红蛋白的选择性的评价。
图11是实施例3中进行的使用Af颗粒(C)的对抗牛白蛋白抗体、
抗人血红蛋白的选择性的评价。
图12是实施例]、3中进行的使用Af颗粒(A)、 (C)的对山羊抗血
清的选择性的评价。
图13是实施例1、 3中进行的使用Af颗粒(A)、 (C)的对山羊血清
中抗人血红蛋白的选择性评价。
图14是比较例中进行的使用氨基颗粒的对抗牛白蛋白抗体、
抗人血红蛋白的选择性的评价。
实施发明的最佳方式
以下详细说明本发明。 "无机颗粒"
本发明中，对于构成亲和颗粒的无机颗粒没有特别限定。无机颗 粒通常是指平均粒径为20 nm-500 pra左右的无机物体。具体的颗粒例如有滑石粉、高呤土、云母、绢云母、白云母、金云母、合成云母、 红云母、黑云母、蛭石、碳酸镁、碳酸鈣、硅酸铝、硅酸钡、硅酸4丐、 硅酸镁、硅酸锶、钨酸金属盐、镁、二氧化硅、沸石、硫酸钡、烧结 硫酸钙(烧石膏)、磷酸钙、氟化4,灰石、羟基磷灰石、陶资粉末、金 属急(例如肉豆蔻酸锌、棕榈酸钙、硬脂酸铝)、氮化硼、氧化铈、胶 体金等无机颗粒。
特别优选的颗粒是二氧化硅、氧化钛、锌白、氧化铝、氧化铁、 滑石粉、云母、绢云母、胶体金等。与多孔质的无机颗粒相比，优选 无孔质的无^/L颗粒。
上述(l)式的磷酰胆碱基和配体可结合的反应基团或吸附基团通 过共价键导入颗粒表面，因此优选其表面具有氨基的颗粒。
还优选无^L颗粒的平均粒径为20 m力-500 ^mi，比重为1.0 g/cm3 以上。
例如有二氧化硅、氧化钛、锌白、氧化铝、氧化铁、滑石粉、云 母、绢云母、胶体金等。
"配体可结合的反应基团或吸附基团"
只要配体可结合即可，没有特别限定。例如共价键形态中，优选 酰胺、酯、聚氨酯、醚、仲胺、脲键、二硫键等。因此，优选配体可 以形成这些共价键形态的反应基团，优选氨基、羟基、羧基、硫醇基、 醛基等。吸附形态优选抗生物素蛋白-生物素、金属-螯形化合物等。 因此优选配体可以形成这些吸附形态的吸附基团，优选抗生物素蛋 白、生物素、螯形化合物等。
"配体"
本发明中，配体是与某种目标物质特异性结合的物质，是各种抗 体、抗原、酶、底物、受体、肽、DNA、 RNA、核酸配体、蛋白A、 蛋白G、抗生物素蛋白、生物素、螯形化合物、各种金属离子等。例如，各种抗体有IgG、 IgM、 IgA、 IgD、 IgE、 IgY，抗原有蛋白质、 多糖类，酶有谷胱甘肽-S-转移酶，底物有谷胱甘肽，受体有激素受体、 细胞因子受体，螯形化合物有氮川三乙酸、各种金属离子有Ni2+、Co2+、
"本发明的亲和颗粒的制造方法"
无机颗粒的表面以共价键的形式具有式(1 )所示的磷酰胆碱基，无 机颗粒的表面以共价键或吸附的形式直接存在可以与对某种目标物
质具有特异亲和性的配体结合的反应基团或吸附基团，这是本发明的 本质，因此其制备方法没有限定，可以通过任何方法結合。
不过，如上所述，使用预先具有磷酰胆碱基和配体可结合的反应 基团或吸附基团的聚合物、没有化学键、只是被覆在颗粒表面的方案 不包含在本发明中。这是由于被覆的聚合物可能发生剥离，出现由于 被覆聚合物产生的影响。
本发明的亲和颗粒可通过下述方法等制备。
步骤1:向颗粒导入下述式(])所示的磷酰胆碱基和配体可结合的 反应基团或吸附基团。对反应基团或吸附基团没有限定，可以是氨基 或羟基、羧基、醛基等。
步骤2:对于使式(l)所示的磷酰胆碱基和配体与导入颗粒的反应 基团或吸附基团结合。在磷酰胆石威基或配体与反应基团或吸附基团之 间存在的化学结构(间隔基团)是任意的。例如任意的间隔基团除亚甲 基链、氧乙烯基链等之外，还可以是含有一个或多个氨基的亚烷基链。
"存在于颗粒表面的反应基团或吸附基团为氨基时"
步骤]:可通过公知的方法或今后开发的方法将氨基导入任意的 颗粒中。氨基可直接导入颗粒表面。氨基为伯胺或仲胺。
步骤2:由甘油磷酰胆碱的氧化性开裂反应得到醛体或水合物， 将其与具有氨基的颗粒进行还原性氨基化反应，将磷酰胆碱基直接附
10加于颗粒表面。
不使磷酰胆碱基与全部氨基结合(调节反应量)，残留的氨基成为 配体可结合的取代基。
或者，由甘油磷酰胆碱的氧化开裂反应得到羧基体，将其与具有 氨基的颗粒进行酰胺化反应，将"辨酰胆i威基直接附加于颗粒表面。
不使磷酰胆碱基与全部氨基结合(调节反应量)，残留的氨基成为 配体可结合的取代基。
"颗粒表面导入氨基的方法"
将氨基导入颗粒的公知的方法(步骤l)如下所述。 1.通过等离子体处理的表面反应导入氨基
在氮气气氛下，通过低温等离子体向颗粒表面导入氨基。具体来 说，将颗粒装入等离子体反应容器内，用真空泵将反应容器内抽真空， 然后导入氮气。接着可通过辉光》文电向颗粒表面导入氨基。也可以将 经等离子体处理的无机材粒进行才几械制粒。关于等离子体处理的文献 如下所示。
1. M. Muler, C. oehr
Plasma aminofunctionalisation of PVDF microfiltration membranes: comparison of the in plasma modifications with a grafting method using ESCA and an amino-selective fluorescent probe Surface and Coatings Technology 116-1 ] 9 (]999) 802-807
2. Lidija Tusek, Mirko Nitschke, Carsten Werner, Karin Stana-Kleinschek, Volker Ribitsch
Surface characterization of NH3 plasma treated polyamide 6 foils Colloids and Surfaces A: Pliysicochem. Eng. Aspects95 (2001) 81-95
3. Fabierme Poncin-Epa川ard, Jean-Claude Brosse， Thierry Fall，er Reactivity of surface groups formed onto a plasma treated poly (propylene) film
Macromol. Chem. Phys. 200. 989-996 (999)2. 通过表面改性剂导入氨基
使用具有氨基的烷氧基硅烷、氯硅烷、硅氨烷等表面改性剂，对 含有硅烷醇的颗粒等无机颗粒表面进行处理。
例如，通过具有伯氨基的3-氨基丙基三曱氧基硅烷，对二氧化硅 颗粒进行处理，导入氨基。具体来说，将二氧化硅浸入水-2-丙醇混合 液中，添加3-氨基丙基三甲氧基石圭烷，然后加热至]O(TC，反应6小 时。冷却至室溫后，用曱醇将二氧化硅洗涤，千燥，可得到氨基直接 导入到二氧化硅表面的颗粒。优选所处理的颗粒除二氧化硅以外，还 有玻璃、氧化铝、滑石粉、粘土、云母、石棉、氧化钛、锌白、氧化 铁等颗粒。
3. 通过有机硅气相处理导入氨基(参照日本特公平1-54379号公报、 曰本特公平1-54380号公报、日本特公平卜54381号公报)
首先通过1,3,5,7-四甲基环四硅氧烷对颗粒表面进行处理，使导入 到表面的Si-H基与具有氨基的单体反应，得到氨基化的表面。例如， 将云母和1,3,5,7-四甲基环四硅氧烷装入干燥器中，用吸气机进行脱 气。在80。C下反应6小时，然后取出云母，在20"C下千燥。将所 得云母分散于乙醇中，添加烯丙胺，接着添加氯铂酸的乙醇溶液，在 6(TC下搅拌2小时，反应终止后过滤，用乙醇洗涤，减压千燥，得到 氨基化云母。这适合对各种无机颗粒(云母、滑石粉、高岭土、氧化铝、 氧化钛、氧化锌、氧化铁、各种无机颜料)进行处理。
胺，只要具有氨基和可聚合的乙烯基、丙烯基等反应性部位即可。氨 基可被丁氧基羰基、千氧基羰基等保护。
另外，即使不是胺系单体，如环氧基那样，也可以是具有例如通 过与二胺的反应可简单地导入氨基的官能团的单体。"向具有氨基的颗粒导入磷酰胆-威基的方法"
下面，如下表示向氨基化颗粒表面导入磷酰胆碱基的方法(步骤2)。
将颗粒浸泡于甲醇中，添加磷脂酰甘油醛，在室温下放置6小时。 然后在O"C下添加氰基硼酸钠，加热搅拌过夜，向氨基加成磷酰胆碱 基。将颗粒用甲醇洗净后，干燥，可得到表面直接具有磷酰胆碱基的 颗粒。反应溶剂除甲醇外，只要是乙醇、2-丙醇等质子性溶剂均可使 用，使用甲醇时的导入率较高。
使用3-氨基丙基三甲氧基硅烷作为表面改性剂，将氨基导入二氧 化硅、接着导入磷酰胆碱基(简称PC)的方法的方案如下所示。 [化7]
<formula>formula see original document page 13</formula>
如上所述，制备具有氨基的颗粒，由甘油磷酰胆碱的氧化性开裂 反应得到醛体或水合物，通过其与具有氨基的颗粒的还原性氨基化反 应，可以制备磷酰胆石成基直接附加在颗粒表面的颗粒。
该方法具有磷酰胆碱基的导入率高，而且可以修饰各种无机颗粒的表面的优点。
上述含有醛的化合物，是通过公知的方法将公知的甘油磷酰胆碱 进行氧化性开裂得到的，是极简单的步骤。例如使用高碘酸、高碘酸
盐或三氧化铋等氧化剂，对l,2-二醇进行氧化，使键开裂，得到醛体。 反应通常在水中或含有水的有机溶剂中进行，反应温度为0。C至室温。 醛体在水中经过平衡反应可成为水合物，这对于接下来的与胺的反应 没有影响。以下表示制备含有磷酰胆碱基的单官能醛体的方案的 一 个 例子。 [化9]
<formula>formula see original document page 14</formula>
使由甘油磷酰胆碱的氧化性开裂反应得到的醛体(或水合物)与颗 粒的氨基结合的还原性氨基化反应可通过将两者在溶剂中搅拌而容 易地进行。该反应是将两者溶解或分散于水或醇中(可以混合第三成分 的有机溶剂)，形成亚胺，然后通过还原剂将其还原，得到仲胺。还原 剂优选氰基硼酸钠等溫和的还原剂，只要磷酰胆碱稳定，也可以使用
其它还原剂。反应通常在o"c至室温下进行，也可以根据情况加热。
可以使式(2)所示的化合物以任意的量、按照常规方法与上述氨基 反应，也可以将残留的氨基作为配体可结合的反应基团或吸附基团。 [化IO]<formula>formula see original document page 14</formula>(2)
n=]-12的整数具体方法如下例如可将式(2)的化合物与亚硫酰氯在N，N，-二甲 基甲酰胺中反应，制成酰氯化物，在N,N，-二甲基甲酰胺中与具有氨 基的颗粒反应，通过酰胺键导入式(l)所示的磷酰胆碱基。
式(2)的化合物可通过下述方案合成。
上述反应中，不使磷酰胆碱基与全部氨基结合(调节反应量)，残 留的氨基成为配体可结合的反应基团或吸附基团。该颗粒为权利要求 2的亲和颗粒，是式O)所示的磷酰胆碱基和配体可结合的反应基团或 吸附基团直接存在于无机颗粒的表面的颗粒。配体与该残留的氨基结 合的颗粒是权利要求3的亲和颗粒，是式(l)所示的磷酰胆碱基和配体 直接存在于无机颗粒的表面的颗斗立。
权利要求2的亲和颗粒是使用者根据要捕获的物质(目标物质)， 可使其与任意的配体结合的制品形式。权利要求3的亲和颗粒是预先 与使其与配体结合了的制品形式。权利要求1的亲和颗粒是至少式O)
的磷酰胆碱基存在于颗粒表面的亲和颗粒，不管有否配体或可与其结 合的反应基团或吸附基团，使用者根据要捕获的物质(目标物质)，可 以使其与任意的配体结合的制品形式。只要至少式(l )所示的磷酰胆碱 基存在于颗粒表面，则包含任何形式的亲和颗粒，例如也包含权利要 求2和权利要求3的形式。
上述反应中，使氨基残留以作为配体可结合的反应基团或吸附基 团，这可通过使3-氨基丙基三甲氧基硅烷和导入了磷酰胆碱基的3-氨基丙基三甲氧基硅烷进行竟争反应的方法或调节反应量等来进行。
也可以使任意的具有官能团的化合物与该氨基反应，使该官能团 成为配体可结合的反应基团或吸附基团。例如可以是戊二醛、二亚氨 酸烷基酯、酰基叠氮基类、异氰酸酯类等。
在使用3-氨基丙基三甲氧基硅烷作为上述表面改性剂时的方案 中，调节表面改性剂的反应量，使存在于颗粒表面的羟基(OH)残留，
团或吸附基团"可以利用残留的OH基作为配体可结合的反应基团或吸附基团。
"配体与具有氨基的颗粒的结合方法"
配体为蛋白质时，可以使戊二醛的一个酪基与无机颗粒上的氨基 反应，使蛋白质中的氨基与另一个醛基反应，从而结合蛋白质。
"存在于颗粒表面的反应基团或吸附基团为羟基时"
大多数无机颗粒的表面存在羟基，因此无需新导入象上述氨基那 样的配体可结合的反应基团或吸附基团，可直接利用存在于颗粒表面
附基团。本发明的亲和颗粒优选通过该方法制备。
"向具有羟基的颗粒导入磷酰胆-威基的方法"
从下述式(3)或(4)的化合物的Si-OMe脱水，与颗粒表面的羟基形 成化学键。该化学反应通过在几乎所有的有机溶剂中进行加热.回流 来进行，可极容易地定量进行。通过该脱水反应，可以导入化学性、 物理性极其稳定的磷酰胆碱基，因而优选。下述式(3)或式(4)所示的含 有磷酰胆碱基的化合物为新型化合物。
+
(3)-4。 OMe可以是OEt、 Cl。另外与Si结合 的OMe或OEt或Cl中最多两个可以是甲基、乙基、丙基、异丙基、 丁基、异丁基。
"式(3)的含磷酰胆碱基化合物的制备方法"
将下述式(5)所示的磷酰胆碱衍生物溶解于蒸馏水。下述式(5)的磷 酰胆^咸衍生物为公知的化合物，可购自市场。 [化13]<formula>formula see original document page 17</formula>
(5)
将式(5)的化合物的水溶液在冰水浴中冷却，加入高碘酸钠，搅拌 5小时。减压浓缩反应液，减压千燥，通过甲醇萃取下迷式(6)所示的 具有醛基的磷酰胆碱衍生物。 [化14]
<formula>formula see original document page 17</formula>(6)
接着，向式(6)的曱醇溶液中添加0.5当量的3-氨基丙基三甲氧基 硅烷。将该混合溶液在室温下搅拌规定时间，然后冰冷却，适量添加 氰基硼氢化钠，回复至室温，搅拌16小时。其间继续向反应容器中 通入千燥氮气。过滤沉淀后，得到式(3)和/或(4)的甲醇溶液。
即使式(3)或(4)所示化合物中的m、 n改变，也按照上述顺序完全 同样地进行。这里所示的顺序是m=3 、 n=2的情况。对反应溶剂没有 特别限定，除上述甲醇之外，可以使用水、乙醇、丙醇、丁醇等醇， DMF或DMSO等非质子性溶剂。不过，为防止反应中的聚合，优选脱水溶剂，其中优选脱水甲醇。
(3)或(4)中的甲氧基(OMe)为乙氧基(OEt)时，可以将甲醇改为乙醇 进行反应，为C1时，可只变更为二甲基曱酰胺或二甲基亚砜。
并且，与Si结合的OMe或OEt或Cl中，2个或、个被甲基、乙 基、丙基、异丙基、丁基、异丁基的其中之一取代时，也可以与上述 方法完全同样地制备。
方法"
将下述式(5)所示的磷酰胆碱衍生物溶解于蒸馏水和乙腈的混合 液中。下述式(5)的磷酰胆碱衍生物是公知的化合物，可从市场购入。 [化15]
<formula>formula see original document page 18</formula>
将式(5)的化合物的水溶液在冰水浴中冷却，添加高碘酸钠和三氯 化钌，搅拌3小时。减压浓缩反应液，减压千燥，通过甲醇萃取下述 式(7)所示的具有羧基的磷酰胆碱^^'f生物。 [化16]
<formula>formula see original document page 18</formula>
接着，在N，N，-二甲基曱酰胺中向式(7)中添加亚硫酰氯，制成酰 氯化物，接着添加0.5当量3-氨基丙基三曱氧基硅烷和2当量三乙胺。 将该混合溶液在室温下搅拌规定时间，得到式(4)的N，N，-二甲基甲酰 胺溶液。
即使式(4)中所示的化合物中的m、 n改变，也完全按照上述顺序同样地进行。这里所示的顺序是111=3、 n=2的情况。对反应溶剂没有 特别限定，除上述N,N，-二甲基甲酰胺之外，还可以使用乙腈，四氬 呋喃、二甲基亚砜等非质子性溶剂。为防止反应中的聚合，优选脱水 溶剂。
另外，与Si结合的OMe或OEt或C中2个或]个被甲基、乙 基、丙基、异丙基、丁基、异丁基其中之一取代时，也可以与上述方 法完全同样地制备。
"关于配体可结合的反应基团或吸附基团"
上述反应中，不使磷酰胆碱基与所有的羟基反应(调节反应量)， 则残留的羟基成为配体可结合的反应基团或吸附基团。该颗粒为权利 要求2的亲和颗粒，是式(l)所示的磷酰胆碱基和配体可结合的反应基 团或吸附基团直接存在于无机颗4i表面的颗粒。使该残留的羟基与配 体结合得到的颗粒则是权利要求3的亲和颗粒，是式(l)所示的磷酰胆 》咸基和配体直4喜存在于无机颗粒的表面的颗粒。
权利要求2的亲和颗粒是使用者根据要捕获的物质(目标物质)，
可使其与任意的配体结合的制品形式。权利要求3的亲和颗粒是预先 与配体结合了的制品形式。权利要求1的亲和颗粒是至少式(l)的磷酰 胆碱基存在于颗粒表面的亲和颗粒，是不管有否配体或配体可结合的 反应基团或吸附基团，使用者根据要捕获的蛋白质(某种目标物质)， 可使其与任意的配体结合的制品形式。另外，只要是至少式()的磷酰 胆碱基存在于颗粒表面，则本发明包含任何形式的亲和颗粒，例如也 包含权利要求2和权利要求3的形式。
"配体与具有羟基的颗粒的结合方法"
配体为蛋白质时，使用溴化氰活化颗粒上的羟基。使蛋白质中的 氨基与其反应，以此结合蛋白质。
使任何具有官能团的化合物与该羟基反应，可以使该官能团成为配体可以结合的反应基团或吸附基团。
"导入到颗粒中的反应基团或吸附基团为羧基时"
步骤通过公知的方法或今后开发的方法氺
意颗粒
中。羧基可直接导入颗粒表面。
步骤2:通过常规方法使下述式(2)所示的含有磷酰胆碱的化合物 与具有羧基的颗粒反应，使磷酰胆碱基形成酰胺键，使残留的羧基作 为配体可结合的反应基团或吸附基团。
不使磷酰胆碱基与所有羧基结合(调节反应量)，则残留的羧基成 为配体可结合的反应基团或吸附基团。
"向颗粒表面导入羧基的方法"
向颗粒中导入羧基的公知的方法(步骤1 )如下所述。 ].通过表面改性剂导入羧基
使用具有羧基的烷氧基硅烷、氯硅烷、硅氨烷等表面改性剂，对 含有硅氨醇的颗粒等无机颗粒表面进行处理。
例如通过三乙氧基甲硅烷基丙基琥珀酸酐对二氧化硅颗粒进行 处理，导入羧基。具体来说，将三乙氧基甲硅烷基丙基琥珀酸酐溶解 于N,N-二甲基甲酰胺，添加蒸馏水和4-二甲基氨基吡。定，在室温下搅 拌]6小时，得到下述式(3)所示的具有羧酸的硅烷偶联剂。本反应是 通过4-二甲基氨基吡咬进行的琥珀酸酐的水解反应。
通过具有羧酸的硅烷偶联剂，对二氧化硅颗粒进行处理，导入羧 基。具体来说，将二氧化硅浸泡在水-2-丙醇混合液中，添加具有羧酸 的硅烷偶联剂，然后加热至]O(TC ，反应6小时。冷却至室温，然后
20用曱醇洗涤二氧化硅，干燥，可得到羧基直接导入到二氧化硅表面的颗粒。优选采取该处理的颗粒除二氧化硅之外，还有玻璃、氧化铝、滑石粉、粘土、云母、石棉、氧化钛、锌白、氧化铁等颗粒。
曰本特公平1-54380号公报、日本特公平1-54381号公报)
首先通过，3,5,7-四甲基环四硅氧烷对颗粒表面进行处理，使导入到表面的Si-H基与具有羧基的单体反应，得到羧基化表面。优选对各种无机颗粒(云母、滑石粉、高岭土、氧化铝、氧化钛、氧化锌、氧化
本方法中使用的单体可以使用羧基系单体。羧基系单体只要具有羧基和可聚合的乙烯基、丙烯基等反应性部位即可。
"向具有羧基的颗粒中导入磷酰胆碱基的方法"
接着，以下表示向羧基化颗粒表面导入磷酰胆碱基的方法(步骤2)。
将表面具有羧基的颗粒浸泡在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺的溶液中，颗粒的表面被活性酯基覆盖。向其中加入式(7)所示的具有氨基的磷酰胆碱衍生物溶液，导入磷酰胆碱基。
"关于配体可结合的反应基团或吸附基团"
上述反应中，不使磷酰胆碱基与全部的羧基结合(调节反应量)，则残留的羧基成为配体可结合的反应基团或吸附基团。该颗粒为权利要求2的亲和颗粒，是式(l)所示的磷酰胆碱基和配体可结合的反应基
合的反应基团或吸附基团结合，则成为权利要求3的亲和颗粒，是式(1 )所示的磷酰胆碱基和配体直接存在于无机颗粒的表面的颗粒。权利要求2的亲和颗粒是使用者根据要捕获的物质(目标物质)，
参照日本特公平-54379号公报、可使其与任意的配体结合的制品形式。权利要求3的亲和颗粒是事先与配体结合的制品形式。权利要求1的亲和颗粒是颗粒表面至少存在式(1)的磷酰胆碱基的亲和颗粒，是不管有否配体或配体可结合的反应基团或吸附基团，使用者根据要捕获的物质(目标物质)，可以使其与任何配体结合的制品形式。只要是颗粒表面存在至少式(l)的磷酰胆碱基，则本发明包含任何形式的亲和颗粒，例如也包含权利要求2和权利要求3的形式。
上述反应中，使羧基作为配体可结合的反应基团或吸附基团残留，这可通过调节导入到磷酰胆碱基中的具有羧酸的硅烷偶联剂的反应量来进行。
使任意具有官能团的化合物与该羧基反应，该官能团可以作为配体可结合的反应基团或吸附基团。
"配体与具有羧基的颗粒的结合方法"
配体为蛋白质时，无机颗粒上的羧基浸泡在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺的溶液中，使颗粒表面形成活性酯。使蛋白质中的氨基与其反应，以此结合蛋白质。使任意的具有官能团的化合物与该羟基反应，则该官能团可以作为蛋白质可结合的反应基团或吸附基团。
"目标物质的亲和分离方法"
使用上述所得本发明的亲和颗粒，可以进行本发明的目标物质的亲和分离方法。
本发明方法利用无机颗粒，可简便的进行高精度的分离，从这点来讲，是具有划时代意义的目标物质的分离纯化方法。
本发明的方法包含以下三个步骤。当为配体预先结合的亲和颗粒时(权利要求2),第1步骤已经进行，因此省略。1.使任意的配体与亲和颗粒化学结合的第1步骤，其中，亲和颗粒
22的特征在于无机颗粒的表面以共价键的形式具有式(l)所示的磷酰胆碱基的亲和颗粒，或者无机颗粒的表面以共价键的形式具有式(l)所示的磷酰胆碱基且无机颗粒的表面以共价键或吸附的形式具有配体，该配体与某种目标物质具有特异亲和性。
例如，无机颗粒的表面具有式(l)所示的磷酰胆碱基和配体可结合的反应基团或吸附基团，其中前者以共价键结合，后者以共价键或吸附形式结合，将这样的亲和颗粒和lml任意的配体PBS溶液装入2ml微量离心管中，在4"C下緩慢振荡30分钟。以5000 rpm离心5分钟，倾去上清。为了清洗，加入1 ml PBS溶液，緩慢振荡，以5000 rpm离心5分钟，倾去上清。将该清洗操作重复三次。
2. 将第一步骤中制备的亲和颗粒分散于液体试样中的第2步骤，其中所述液体试样含有可通过任意的配体选择性捕获的目标物质。
例如，将第]步骤中制备的亲和颗粒分散于液体试样中，其中液体试样含有可通过任意的配体选^^性地捕获的目标物质，在4"C下緩慢振荡30分钟。以5000 rpm离心5分钟，倾去上清。为了清洗，加入1 ml PBS溶液，缓慢振荡，以5000 rpm离心5分钟，倾去上清。将该清洗操作重复三次。
3. 从分离出的亲和颗粒中回收捕获的目标物质的第3步骤。
例如，为了从亲和颗粒中回收捕获的目标物质，加入1 ml洗脱緩冲液，在4"C下緩慢振荡30分钟，从颗粒中洗脱目标物质，回收上清。加入1 ml洗脱缓沖液，緩慢振荡，以5000 rpm离心5分钟，回收上清。将该操作重复两次。
图]是表示通过本发明的亲和颗粒与以往的亲和颗粒捕获目标物质的选择性的差异的模式图。
实施例
下面根据实施例进一步详细说明本发明。本发明不受这些实施例的限定。导入到颗粒表面的磷酰月旦碱基可通过FT-IR和元素分析进行确认、定量。
"合成例1"
"含有磷酰胆碱基的醛化合物"
将6.29 g l-a-甘油磷酰胆碱溶解于210 ml蒸馏水，在冰水浴中冷却。添加10.23 g高石典酸钠，搅4半5小时。减压浓缩反应液，减压干燥，通过甲醇萃取目标物。下述^:合物(6)表示其结构。
式(6)的化合物在重水中的1H NMR波谱如图2所示。式(6)的化合物在水中与式(9)成平衡状态，因此实际的波谱反应了式(6)和式(9)双方。[化1S]<formula>formula see original document page 24</formula>
"合成例2"
"含有磷酰胆碱基的羧酸化合物，，
在200 ml烧并瓦内加入5 g甘油磷酰胆石成、]7 g高碘酸钠、81 mg三氯化钌'n水合物以及70。/。离子交换水、30 g乙腈。在室温下搅拌2小时，然后过滤，从滤液中除去溶剂。用甲醇从所得固体物质中萃取目标化合物，接着通过除去甲醇得到目标化合物(7)。
24式(7)的化合物在重水中的1HNMR波语如图3所示,[化20]
<formula>formula see original document page 25</formula>
(7)
"合成例三"
"式(10)的化合物"
使5.0 g合成例1的化合物溶解于55 ml脱水曱醇中，用干燥氮气置换容器内气体。接着向化合物1的甲醇溶液中添加2.84g3-氨基丙基三甲氧基硅烷。将该混合溶液在室溫下搅拌过夜，然后冰冷却，添加1.39g氰基硼氢化钠，回复至室温，搅拌5小时。其间反应容器中继续通入干燥氮气。过滤沉淀，然后得到含有作为目标物质的下述式(IO)的甲醇溶液。[化21]
<formula>formula see original document page 25</formula>
(10)
"合成例4"
"式(l])的化合物"
使9.0 g合成例4的化合物分散于300 ml N,N，-二曱基甲酰胺中，用干燥氮气置换容器内气体。接着添加4.5g亚硫酰氯，搅拌15分钟，然后添加2.84 g3-氨基丙基三甲氧基硅烷、9.5g三乙胺。将该混合溶液在室温下搅拌过夜，过滤沉淀，然后得到含有目标物质一一下述式(n)的化合物的N,N'-二曱基曱酰胺溶液。
OMe
MeO—Si ^/\^N
OMe
O
广o一r
o o—
(11)
"参考例1"
"无机颗粒的表面以共价键的形式具有磷酰胆碱基的磷酰胆44颗粒
(PC颗粒(A))"
取97.7 ^含有50 pmol合成例3中制备的式(]0)的化合物的甲醇溶液，加入47.5 ml甲醇、2.5 ml蒸4留水，再添加5 g平均粒径为1.5 pm、比表面积为6 m2/g的硅胶。使该颗粒分^:溶液在8CTC下回流过夜，进行偶联。回流后用甲醇离心清洗，得到权利要求1的PC颗粒(以下称为PC颗粒(A))。按照以上顺序、用合成例3的表面改性剂处理的PC颗粒(A)的P定量测定如图4所示。由此求出的PC导入量为3.1 pmol/g的颗粒，可以确认PC基团导入了颗粒表面。
"参考例2"
"无机颗粒的表面以共价键的形式具有磷酰胆碱基的磷酰胆碱颗粒(PC颗粒(B))"
取27.8 ^含有50 pmol合成例4中制备的式(l ])的化合物的二甲基甲酰胺溶液，加入50ml 二甲基甲酰胺，再添加5g平均粒径为1.5pm、比表面积为6 m2/g的珪力交。〗吏该颗粒分,i溶液在16(TC下回流过夜，进行偶联。回流后用甲醇离心清洗，得到权利要求的PC颗粒(以下称为PC颗粒(B))。按照以上顺序，用合成例4的表面改性剂处理的PC颗粒(B)的P定量测定如图4所示。由此求出的PC导入量为3.4pnol/g的颗粒，可以确认PC基团导入了颗粒表面。"参考例3"
"无机颗粒的表面以共价键的形式具有磷酰胆石咸基的磷酰胆^5咸颗粒
(PC颗粒(C))"
取27.8 (il含有50 fimol合成例4中制备的式(l l)的化合物的二甲 基甲酰胺溶液，加入47.5 nil 二甲基甲酰胺、2.5ml蒸馏水，再添加5 g平均粒径为1.5 pm、比表面积为6 m2/g的硅胶。使该颗粒分散溶液 在160。C下回流过夜，进行偶联。回流后用甲醇离心清洗，得到权利 要求1的PC颗粒(以下称为PC颗粒(C))。按照以上顺序，用合成例4 的表面改性剂处理的PC颗粒(C)的P定量测定如图4所示。由此求出 的PC导入量为7.3 jimol/g的颗粒，可以确认PC基团导入了颗粒表面。
参考例的PC颗粒(A)的13C-CPMAS波镨和13C-PSTMAS波谌 如图5所示。PSTMAS波谱是选一李性地获得自由运动的分子链的波语 的方法，是广泛用于颗粒表面的^奮饰链分析的方法。图5中，在54.2 ppm处观测到来自磷酰胆碱基的碳的波语。
图6所示的参考例1的PC颗粒(A)的31P-CPMAS波语中，在作 为对象进行测定的NaH2Pa几乎相同的化学位移值处检测出峰值，由 此可以确认磷酸基的存在。以上结果可以认为可以将磷酰胆石咸基导入 载体硅胶表面。
图5中在9 ppm、 23 ppm附近观测到来自间隔基团丙基的碳的波 语，在60 ppm、 69 ppm附近观测到来自磷酰胆碱内的乙基的波谱。 由以上可知式(10)和(1)的结构未被破坏即可导入到硅胶中。
图7表示参考例3的PC颗粒(C)的FT-IR波语。在1650cm-1附近
可观测到酰胺键特有的吸收。
"磷酰胆碱颗粒与蛋白质的非特异吸附评价"
分别取25mg参考例]中使用的未导入磷酰胆碱基、未处理的硅 胶颗粒(简称未处理颗粒)和参考例1、 2、 3中制备的PC颗粒(A)、 (B)、(C)，加入1 ml蒸馏水，进行]分钟超声波处理。离心除去蒸馏水， 加入l ral00 pg/ml白蛋白或00 |ig/ml溶菌酶，在室温下反应1小时， 用PBS进行5次离心 纯化(5000 g)，洗涤。接着加入1 ml 1% SDS, 在室温下反应1小时，离心(5000 g),用MICRO BCA法对上清进行 定量，其结果如图8所示。与未处理颗粒相比，用磷酰胆碱基处理的 PC颗粒(A)强烈抑制白蛋白、溶菌酶的吸附。PC颗粒(B)、 (C)与未处 理颗粒或PC颗粒(A)相比，白蛋白、溶菌酶均进一步被抑制吸附。
"实施例1"
"无机颗粒的表面以共价键的形式具有磷酰胆碱基和氨基的亲和颗
粒(Af颗粒(八;o"
取87.9 ^含有45 ，iol合成例3中制备的式(10)的化合物的甲醇
溶液和50 ^含有5 pmol 3-氨基丙基三曱氧基硅烷的甲醇溶液，加入 47.5 ml甲醇、2.5 ml蒸馏水，再添加5 g平均粒径为.5 pm、比表面 积为6 m2/g的硅胶。使该颗粒分^:溶液在8(TC下回流过夜，进行偶联。 回流后用甲醇离心清洗，得到权利要求1的亲和颗粒(以下称为Ai'颗 粒(A))。按以上的顺序，用合成例3的表面改性則进行处理的Af颗粒 (A)的P定量测定如图4所示。由此求出PC导入量为2.7卩m，ol/g的颗 粒，可以确认PC基团导入了颗粒表面。
"实施例2"
"无机颗粒的表面以共价键的形式具有磷酰胆碱基和氨基的亲和颗 粒(Af颗粒(B))"
取250夂il含有45 pnol合成例4中制备的式(l l)的化合物的二曱 基甲酰胺溶液和50〖il含有5〖unol 3-氨基丙基三曱氧基硅烷的二甲基 甲酰胺溶液，再添加5 g平均粒径为1.5 pm、比表面积为6 m2/g的硅 胶。使该颗粒分散溶液在16(TC下回流过夜，进行偶联。回流后用甲 醇离心清洗，得到权利要求1的亲和颗粒(以下称为Af颗粒(B》。按以上的顺序，用合成例4的表面改性剂处理的Af颗粒(B)的P定量测 定如图4所示。由此求出的PC导入量为3.3 pmol/g的颗粒，可以确 认PC基团导入了颗粒表面。
"实施例3"
"无机颗粒的表面以共价键的形式具有磷酰胆石威基和氨基的亲和颗 粒(Af颗粒(C》"
取250 ^tl含有45 pmo合成例4中制备的式(ll )的化合物的二甲 基甲酰胺溶液和50 ^含有5 prao3-氨基丙基三曱氧基硅烷的二甲基 曱酰胺溶液，加入47.5 ml 二甲基甲酰胺、2.5 ml蒸馏水，再添加5 g 平均粒径为1.5 [im、比表面积为6 m2/g的硅胶。使该颗粒分散溶液在 16CTC下回流过夜，进行偶联。回流后用甲醇离心清洗，得到权利要 求1的亲和颗粒(以下称为Af颗粗(C》。按以上的顺序，用合成例4 的表面改性剂处理的Af颗粒(C)的P定量测定如图4所示。由此求出 的PC导入量为6.3 |Limol/g的颗粒，可以确认PC基团导入了颗粒表面。
"亲和颗粒的选择性评价1"
接着给出权利要求6中所示的亲和分离方法。向25 mg实施例1 、 2、 3中制备的Af颗粒(A)、 (B)、 (C)中加入1 ml蒸馏水，进行1分钟 超声波处理。通过离心除去蒸馏水，加入lml 8%戊二醛溶液和10 mg 用于稳定席夫碱的氰基硼氢化钠(少7 乂卜卩匕卜、、口水々酸大卜ij々 厶)，在室温下反应5小时，用MQ水离心.纯化(5000 g) 5次。得到 戊二醛为配体可结合的反应基团或吸附基团的权利要求2的亲和颗 粒。接着加入1 mlmg/ml牛白蛋白或1 mg/ml人血红蛋白和10mg硼 氢化钠，在室温下反应1天，用PBS进行4次离心 纯化(5000 g)。 该牛白蛋白或人血红蛋白为配体。以下是权利要求7所示的亲和分离 方法。为了使残留的戊二醛基失活，加入]ml乙醇胺盐酸盐(0.5 M、 pH 7.1)和10 mg硼氢化钠(卜卩匕卜、'口水々酸大卜卩々厶)，在室温下反应]小时，用PBS进行4次离心.纯化(50(X) g)，得到权利要求3 的亲和颗粒。接着加入1 ml HEJP标记抗牛白蛋白抗体(IO ^g/ral)或 HRP标记抗人血红蛋白抗体(IO (ig/ml),在室温下反应1小时，用PBS 离心 纯化(5000 g) 5次。再加入1 ml PBS，搅拌，将0 pl转移至96 孔板，用底物TMBZ进行显色实验，用450 nm进行测定。其结果如 图9、图10、图]]所示。Af颗4立(A)对人血红蛋白-HRP标记抗人血 红蛋白抗体具有选择性。Af颗粒(B)、 Af颗粒(C)对牛白蛋白-HRP标 记抗牛白蛋白抗体、人血红蛋白-HRP标记抗人血红蛋白抗体均具有 选择性。
"亲和颗粒的选择性评价2"
使用抗人血红蛋白的山羊抗血清进行选择性实验。向25 mg实施 例]、3中制备的Af颗粒(A)、 (C)中加入]ml蒸馏水，进行1分钟超 声波处理。离心除去蒸馏水，加入ml 8%戊二醛溶液和10 mg用于 稳定席夫碱的氰基硼氢化钠，在室温下反应5小时，用MQ水离心-纯 化(5000 g)，清洗5次。得到戊二醛为配体可结合的反应基团或吸附基 团的权利要求2的亲和颗粒。接着加入1 ml 1 mg/ml人血红蛋白和10 mg硼氢化钠，在室温下反应]天，用PBS离心.纯化(5000 g)4次。 该人血红蛋白为配体。以下为权利要求7所示的亲和分离方法。为了 使残留的戊二醛基失活，加入1 m.l乙醇胺盐酸盐(0.5 M、 pH7.1)和10 mg硼氢化钠，在室温下反应1小时，用PBS进行4次离心'纯化(5000 g),得到权利要求3的亲和颗粒。接着加入1 ml稀释为100倍的山羊 抗血清，在室温下反应1小时。4妾着离心(5000 g)，得到上清(上清组 分)。用PBS进行5次离心.纯化(5000 g)。接着加入ml Gly-HCl緩 冲液(0.2M、 pH2.5)，在室温下反应1小时，洗脱抗人血红蛋白抗体， 离心(5000 g)，得到上清(洗脱组分)。将该上清组分和洗脱组分过 SDS-PAGE,进行银染，结果如图12所示。对于Af颗粒(A)、 (C), 都可见色深的洗脱组分中抗体的重链条带，未见其它条带，因此可知是高选择性地捕获抗体的颗粒。
"亲和颗粒的选择性评价3"
使用混合了抗人血红蛋白的山羊抗血清进行选择性实验。向25 mg实施例1、 3中制备的Af颗斗立(A)、 (C)中加入lml蒸馏水，进行1 分钟超声波处理。离心除去蒸馏7j^，加入]ml 8%戊二醛溶液和10 mg 用于稳定席夫碱的氰基硼氢化钠，在室温下反应5小时，用MQ水离 心.纯化(5000 g),清洗5次。得到戊二醛为配体可结合的反应基团或 吸附基团的权利要求2的亲和颗4立。接着加入1 mlmg/ml人血红蛋 白和10mg硼氢化钠，在室温下;t应1天，用PBS离心.纯化(5000 g) 4次。该人血红蛋白为配体。以下为权利要求7所示的亲和分离方法。 为了使残留的戊二醛基失活，加入1 ml乙醇胺盐酸盐(0.5M、 pH7.1) 和]Omg硼氢化钠，在室温下反应1小时，用PBS进行4次离心'纯 化(5000 g)，得到权利要求3的亲和颗粒。接着加入1 ml混合了 50叱 抗人血红蛋白的稀释为100倍的山羊血清，在室温下反应小时。接 着离心(5000 g),得到上清(上清组分)。用PBS进行5次离心'纯化(5000 g)。接着加入1 ml Gly-HC1緩冲液(0.2 M、 pH 2.5),在室温下反应1 小时，洗脱抗人血红蛋白抗体，离心(5000 g)，得到上清(洗脱组分)。 将该上清组分和洗脱组分过SDS-PAGE,进行银染，结果如图3所 示。对于Af颗粒(A)、 (C),都可见色深的洗脱组分中抗体的重链条带， 其它只可见色浅的条带，因此可知是高选择性地捕获抗体的颗粒。从 条带的浓度看，抗体捕获量为10-20 (ig左右。通过夹层ELISA确认洗 脱组分的抗体活性，可知Af颗粒(A)为13.0 jxg、 Af颗粒(C)为10.l叱 左右的活性。
"比较例1"
"无机颗粒的表面以共价键的形式具有氨基的亲和颗粒(氨基颗粒)" 取500 pl含有50 ,，ol 3-氨基丙基三甲氧基硅烷的甲醇溶液，加入47.5ml甲醇、2.5ml蒸馏水，再添加5 g平均粒径为1.5 pm、比表 面积为6m"g的珪胶。使该颗粒分散溶液在8(TC下回流过夜，进行偶 联。回流后用甲醇离心清洗，得到氛基颗粒。向25mg该氨基颗粒中 加入1 ml蒸馏水，进行1分钟超声波处理。通过离心除去蒸馏水，加 入lml 8%戊二醛溶液和10 mg用于稳定席夫碱的氰基硼氢化钠，在室 温下反应5小时，用MQ水离心.纯化(5000 g)，清洗5次。戊二醛 为配体可结合的反应基团或吸附基团。接着加入l ml lmg/ml牛白蛋 白或lmg/ml人血红蛋白和10mg硼氬化钠，在室温下反应1天，用 PBS进行4次离心 纯化(5000g)。该牛白蛋白或人血红蛋白为配体。 为使残留的戊二趁基失活，加入lml乙醇胺盐酸盐(0.5M、 pH7.1)和 10mg硼氬化钠，在室温下反应1小时，用PBS进行4次离心.纯化 (5000 g)，得到权利要求3的亲和颗粒。接着加入lml 10 pg/ml的HRP 标记抗牛白蛋白抗体或IO pg/ml的HRP标记抗人血红蛋白抗体，在 室温下反应1小时，用PBS进行5次离心'纯化(5000 g)。再加入1 ml PBS，搅拌，将10 fil转移至96孔板，使用底物TMBZ进行显色实验， 用450nm进行测定。其结果如图14所示。蛋白质的非特异性吸附多， 选择性低。
产业实用性
本发明的亲和颗粒只捕获要分离的目标蛋白质，因此选择性极 高。另外分散性优异，极容易从液体试样中分离。通过利用了便宜的 无机颗粒的亲和颗粒，可简便且高精度地分离目标物质，因此可用作 要求高精度分离目标物质的生物体相关产业。
对附图12中各泳道的说明 泳道1:山羊抗血清(稀释100倍) 泳道2: Af颗粒(A)的上清组分 泳道3: Af颗粒(A)的上清组分泳道4:Af颗粒(A)的洗脱组分
泳道5:Af颗粒(A)的洗脱组分
泳道6:Af颗粒(C)的上清组分
泳道7:Af颗粒(C)的上清组分
泳道8:Af颗粒(C)的洗脱组分
泳道9:Af颗粒(C)的洗脱组分
对附图13中各泳道的说明
1 :山羊血清中抗人血红蛋白抗体(稀释100倍)
2: Af顆粒(A)的上清组分
3: Af颗粒(A)的上清组分
4: Af颗粒(A)的洗脱组分
5: Af顆粒(A)的洗脱組分
6: Af顆粒(C)的上清组分
7: Af顆粒(C)的上清组分
8: Af顆粒(C)的洗脱组分
9: Af顆粒(C)的洗脱组分
道道道道道道道道道
,水,^s' ,f *水,水*参,水*水*水
、y 、v ,A 、v 5 、y 、y 、> 、v
权利要求
1.一种亲和颗粒，其特征在于无机颗粒的表面以共价键的形式具有下述式(1)所示的磷酰胆碱基，无机颗粒的表面以共价键或吸附的形式具有可与对某种目标物质具有特异亲和性的配体结合的反应基团或吸附基团
2. —种亲和颗粒，其特征在于无机颗粒的表面以共价键的形式 具有下述式(l)所示的磷酰胆i成基，无机颗粒的表面以共价键或吸附的 形式具有与某种目标物质具有特异亲和性的配体<formula>formula see original document page 2</formula>
3. 权利要求l或2的亲和颗粒，其特征在于上述无机颗粒为选 自二氧化硅、氧化钛、锌白、氧化铝、氧化铁、滑石粉、云母、绢云 母、胶体金的一种或多种无机颗粒，其平均粒径为20nm-500卩im,比 重为1.0g/cm3以上。
4. 权利要求1或2的亲和颗粒，其特征在于上述配体为选自各 种抗体、抗原、酶、底物、受体、凝集素、肽、DNA、 RNA、核酸配 体、蛋白A、蛋白G、抗生物素蛋白、生物素、螯合化合物、各种金 属离子的一种或多种配体。
5. —种通过无机颗粒进行的目标物质的亲和分离方法，其特征在于包含以下步骤(l)使权利要求]的亲和颗粒与任意的配体结合的第 1步骤，(2)使第1步骤中制造的亲和颗粒分散于液体试样中的第2步 骤，其中液体试样含有被任意的配体选择性捕获的目标物质，。)回 收由亲和颗粒捕获的目标物质的第3步骤。
6. —种通过无机颗粒进行的目标物质的亲和分离方法，其特征在 于包含以下步骤(])使权利要求2的亲和颗粒分散于液体试样中的第 1步骤，其中所述液体试样含有被任意的配体选择性捕获的目标物质， (2)回收由亲和颗粒捕获的目标物质的第2步骤。
全文摘要
本发明的目的在于提供亲和颗粒，其特征在于无机颗粒的表面以共价键的形式具有式(1)所示的磷酰胆碱基，无机颗粒的表面以共价键或吸附的形式具有与某种目标物质具有特异亲和性的配体。本发明的目的还在于提供亲和分离方法，该方法通过利用了便宜的无机颗粒的亲和颗粒，可简便且高精度地分离目标物质。
文档编号B01J20/22GK101513606SQ20081019030
公开日2009年8月26日 申请日期2005年5月18日 优先权日2004年5月24日
发明者前野克行, 宫泽和之, 石原一彦, 石洼章 申请人:株式会社资生堂;石原一彦