专利名称：亲和色谱基质的制作方法
技术领域：
本发明涉及亲和色谱法领域，且更具体涉及含有配体的分离基质，所述配体含有一个或多个蛋白A结构域(E、D、A、B、C)或蛋白Z，具有在至少一个单体中最接近C末端的脯氨酸残基(C-terminal most proline residue)的氨基酸取代。本发明还涉及用具有增加能力(capacity)的优势的前述基质分离目标蛋白质的方法。
_2]
背景技术：
免疫球蛋白为全球范围内生产或研发中最普遍的生物制药产品。其特定治疗市场的高度商业化需求和由此带来的价值已导致制药公司将重点放在将其各自的mAb生产过程的生产力最大化，同时控制相关的成本。大多数情况下使用亲和色谱法作为这些免疫球蛋白分子(例如单克隆或多克隆抗体)纯化中的关键步骤之一。特别有意义的一类亲和试剂是能特异性结合免疫球蛋白分子的恒定部分的蛋白质，这样的相互作用不依赖于抗体的抗原结合特异性。这样的试剂可广泛用于从不同样本中用亲和色谱法回收免疫球蛋白，所述样本例如但不限于血清或血浆制备物或得自细胞培养物的原料。这样的蛋白质的一个实例为葡萄球菌蛋白A，其含有能与不同物种的IgG免疫球蛋白的Fe和Fab部分相结合的结构域。基于葡萄球菌蛋白A (SpA)的试剂因为其高度亲和力和选择性在生物技术领域已经发现了广泛的用途，例如用于捕获和纯化抗体以及检测的亲和色谱法。目前，基于SpA的亲和介质可能是最广泛使用的从不同样本中分离单克隆抗体及其片段的亲和介质，所述样本包括来自细胞培养物的工业原料。因此，各种包含蛋白A配体的基质可市购获得，例如以天然蛋白 A 的形式(例如Protein A SEPHAROSE , GE Healthcare, Uppsala, Sweden),还可由重组蛋白A组成(例如rProtein A SEPHAROSE , GE Healthcare)。更具体地说,在市售的重组蛋白A产品中进行的基因操作的目的在于促进其附着至支持物。这些应用，与其他亲和色谱法应用类似，需要充分注意一定要去除杂质。这样的杂质可例如为色谱程序中吸附在固定相或基质上的非洗脱分子，例如不期望的生物分子或微生物，包括例如蛋白质、碳水化合物、脂质、细菌和病毒。通常在所期望产品的第一次洗脱之后从基质上去除这样的杂质，以便于在后续使用之前使基质再生。这样的去除通常涉及称为原位清洗(cleaning-1n-place, CIP)的程序,其中使用能从固定相上洗脱杂质的试剂。经常使用的一类这样的试剂为流过所述固定相的碱性溶液。目前最广泛使用的清洗和清洁试剂为NaOH，其浓度范围可为0.1M直到例如I M，这依赖于杂质的程度和种类。这个策略涉及将基质暴露于超过13的pH值中。对许多含有蛋白性质的亲和配体的亲和色谱基质来说，这样的碱性环境为非常苛刻的条件，因此由于配体对有关高PH的不稳定性而导致能力下降。因此，广泛的研究已集中在工程改造蛋白质配体的研制上，所述蛋白质配体显示出耐受碱性pH值的能力提高。例如，Giilich等 (Susanne Giilich, Martin Linhult,Per-Ake Nygrenj Mathias Uhlenj Sophia Hoberj Journal of Biotechnology 80(2000), 169-178)提出了蛋白质工程改造，以在碱性环境中提高葡萄球菌白蛋白结合结构域(ABD)的稳定性。GUlich等创建了 ABD的突变体，其中所有的4个天冬酰胺残基被亮氨酸(I个残基)、天冬氨酸(2个残基)和赖氨酸(I个残基)置换。此外，GUlich等报道了其突变体显示类似于天然蛋白的靶蛋白结合特性，并且在重复暴露于碱性环境后，含有工程改造的配体的亲和柱比用亲本未改造的配体制备的亲和柱显示出更高的结合能力。因此，从中推断出可置换所有的4个天冬酰胺残基而对结构和功能没有任何明显的影响。近期研究表明也可改变蛋白A (SpA)来影响类似的性质。美国专利申请公布US2005/0143566公开了当至少I个天冬酰胺残基突变成非谷氨酰胺或天冬氨酸时，与亲本SpA (例如SpA的B结构域)或蛋白Z (源自SpA的B结构域的合成构建体(US 5，143，844))相比，该突变赋予了在高达约13-14的pH值下增加的化学稳定性。作者证明当这些突变的蛋白质用作亲和配体时，预想的分离介质可更好地耐受使用碱性试剂的清洗程序。US2006/0194955显示突变的配体可更好地耐受蛋白酶从而减少配体在分离过程中的漏失。另外一个公布US 2006/0194950显示可进一步修饰碱稳定的SpA结构域以使配体缺失对Fab的亲和力但保留对Fe的亲和力，例如通过G29A突变。在过去，含有5个IgG结合结构域的天然蛋白A用于生产所有的蛋白A亲和介质。使用重组技术，已经产生出许多蛋白A的构建体，它们都含有4个或5个IgG结合结构域。近期研究表明，与四聚体配体相比较，二聚体配体有类似或增加的结合能力(W02010/080065)。在该领域仍有需要获得包含具有增加的结合能力的蛋白质配体的分离基质。发明概沭
本发明的一个目标是提供能结合免疫球蛋白的蛋白质配体，所述免疫球蛋白例如IgG、IgA和/或IgM,优选通过其Fe片段结合。这些配体具有在至少I个蛋白A的单体结构域(E、D、A、B、C)或蛋白Z中第三个α螺旋后最接近C末端的脯氨酸残基的取代，因此与没有取代的配体相比较有更高的结合能力。配体优选为多聚体，即含有超过一个选自蛋白A的单体结构域(E、D、A、B、C)和蛋白Z。本发明的另一目标是提供亲和分离基质，其包含能结合免疫球蛋白的配体，所述免疫球蛋白例如IgG、IgA和/或IgM，优选通过其Fe片段结合，如上所述。本发明的又一目标是提供用本发明亲和基质分离一种或多种含有免疫球蛋白的蛋白质的方法。通过使用具有取代的亲和配体，出乎意料的是，本方法实现对靶分子的结合能力增加。因此，本发明提供了一种方法用以产生纯化的产物，例如纯化的免疫球蛋白分离物或除掉免疫球蛋白后剩余的液体，或者用以检测样本中免疫球蛋白的存在。本发明的配体显示增加的能力，这使配体成为节省成本且大规模实施的有吸引力的候选。按所附权利要求所述可实现一个或多个上述目标。附图简沭
图1显示蛋白Z的氨基酸序列，第57位的脯氨酸用粗体显示(SEQ ID NO: 2)。图2a显示假设的四聚体配体结构，每个单体是蛋白A的结构域(E、D、A、B、C)或蛋白Z，由于每个单体中最接近C末端的脯氨酸的存在，因此在每个结构域之间含有60°的转角。
图2b显示配体和IgG之间的假设的结合，其中一个IgG结合两个单体结构域(两个Fe链由圆环表示，分别结合一个单体结构域)。图2c显示在单体结构域之间假设的更线性和柔性的多聚体配体结构，其归因于在每个结构域中最接近C末端的脯氨酸取代为其他氨基酸残基。图2d显示蛋白A的5个结构域的氨基酸序列的比对。图3显示动力学结合能力试验的代表性色谱结果。发明详沭 定义
术语“蛋白质”在本文用以描述蛋白质及其片段。因此，术语“蛋白质”包括显示三维结构的任何氨基酸链，并且相应地包括蛋白质片段。术语蛋白质的“功能性变体”在本文意指变体蛋白质，其中与本发明所定义的亲和力和稳定性有关的功能被基本保留。因此与所述功能不相关的一个或多个氨基酸可能被替换。术语“亲本分子”在本文指在本发明的突变引入前形式的相应蛋白质。术语“结构稳定性”指分子的三维形状的完整性，而“化学稳定性”指耐受化学降解的能力。术语“Fe片段结合”蛋白意指蛋白质能够结合免疫球蛋白的Fe片段。然而，并不排除Fe片段结合蛋白还能结合其他区域，例如免疫球蛋白的Fab区。在本说明书中，如果没有通过其全称提及氨基酸，那么用惯例的单字母符号表示 氨基酸。突变在本文中用被替换的位置的编号来定义，野生型或非突变的氨基酸在前，突变的氨基酸在后。因此，例如在第23位上天冬酰胺突变成苏氨酸表示为N23T。一方面，本发明涉及从液体中分离一种或多种含有免疫球蛋白的蛋白质的方法，所述方法包括(a)使液体与含有固定在支持物上的配体的分离基质接触；(b)通过与配体相互作用使含有免疫球蛋白的蛋白质吸附到基质上；(c)清洗被吸附的含有免疫球蛋白的蛋白质的任选步骤；和(d)通过使基质与释放蛋白质的洗脱液接触以回收含有免疫球蛋白的蛋白质。本方法通过使用配体提供配体对免疫球蛋白分子增加的结合能力，每个配体包含一个或多个葡萄球菌蛋白A (SpA) (E、D、A、B、C)或蛋白Z或其功能性变体的结构域(SP，单体)，其中在所述一个或多个结构域中的至少一个中最接近C末端的脯氨酸被取代为其他氨基酸。免疫球蛋白结合蛋白(即，配体)可以是具有天然的免疫球蛋白结合能力的任何蛋白质，例如葡萄球菌蛋白A (SpA)或葡萄球菌蛋白G (SpG)，或含有这些蛋白质的IgG结合结构域的重组蛋白质。其他这样的蛋白质的综述可参见例如Kronvall, G., Jonsson,K.Receptins: a novel term for an expanding spectrum of natural and engineeredmicrobial proteins with binding properties for mammalian proteins, J.MoLRecognit.1999 Jan-Feb; 12 (I): 38-44。配体可包含一个或多个 SpA 的 E、D、A、B 和 C 结构域。配体更优选包含蛋白A的结构域B或工程改造的蛋白Z。每一个蛋白Z或蛋白A结构域包含靠近C末端的脯氨酸(P57)(参见例如图1、图2d和SEQ ID N0.1-8)。已知脯氨酸由于其结构(即侧链连接在α氮上)可在蛋白质中提供转角。这种连接限制为Φ =约60°的成键角度，因此在蛋白质中产生转角。经典实例可参见IgG的铰链，其中可存在脯氨酸。因此，当脯氨酸存在于C末端时，蛋白A的每个结构域或蛋白Z以60°键角结束，在结构域之间产生转角(图2a-2c)。最接近C末端的脯氨酸既不涉及Fe 结合(Graille 等，PNAS 2000, 97 (10): 5399-5404; Deisenhofer, Biochemistry1981，20 (9): 2361-2370)，也不是α螺旋的一部分(脯氨酸不可能形成α螺旋)。因此，因为结构限制，由每个结构域中C末端脯氨酸的存在可导致蛋白A/蛋白Z配体的单体结构域的利用率很低(在总过载下二中之一被使用)，即位阻现象。有可能在配体中两个结构域结合一个IgG分子，因此阻碍了 IgG接近所有其他的结构域(图2b)。这样的结合还可暗示了 IgG与配体的结合更强。本发明的某些实施方案取代了在每个结构域中最接近C末端的脯氨酸(SEQ ID NO:1或2的P57)，以实现每个结构域的利用率更高从而增加的配体能力，这可能归因于单体结构域之间更线性和/或柔性的多聚配体结构(图2c)。如图2d所示，蛋白A的5个结构域之间的序列高度相关。没有缺失或插入，且许多取代是对蛋白质的结构或功能引起最小可能变化的保守改变。例如，在整个58个氨基酸的多肽内在B结构域和C结构域之间只有4个改变。因此，在每个这些结构域中C末端脯氨酸对蛋白A或含有所述结构域的配体具有类似的结构/功能贡献。同样地，脯氨酸的改变对含有这种改变的配体的结构/功能产生类似的影响。在某些实施方案中，脯氨酸被取代为优选形成β折叠的氨基酸。脯氨酸优选被取代为大体积氨基酸或产生“刚性”的氨基酸，例如Y、W、F、M、1、V、T。取代更优选为P57I。在另外的实施方案中，脯氨酸被取代为易于形成α螺旋的氨基酸，例如E、A、L、H、M、Q、K。在某些优选实施方案中，亲本分子包含由SEQ ID NO: 1_8所定义的序列或其任何功能性变体。在某些实施方案中，在多聚体配体的至少一个单体结构域中最接近C末端的脯氨酸残基被取代。在另外的实施方案中，在多聚体配体的所有单体结构域中最接近C末端的脯氨酸残基被取代。在一个实施方案中，配体还呈现碱稳定性，例如通过将SpA结构域B或蛋白Z的至少一个单体结构域的至少一个天冬酰胺残基突变为非谷氨酰胺的氨基酸来实现。如早期所讨论，US专利申请公布US 2005/0143566公开了当至少一个天冬酰胺残基被突变为非谷氨酰胺或天冬氨酸的氨基酸时，该突变赋予配体在高PH下增加的化学稳定性(例如，N23T)。此外，包含这些配体的亲和介质能更好地耐受使用碱性试剂的清洗程序。US 2006/0194955显示突变的配体还能更好地耐受蛋白酶，从而减少在分离过程中的配体漏失。因此，这些申请的公开内容通过引用其整体而结合到本文中。在另一实施方案中，这样制备的配体对抗体的Fab部分缺少任何显著的亲和力，而对Fe部分有亲和力。因此，在某些实施方案中，配体的至少一个甘氨酸被丙氨酸取代。US2006/0194950显示碱稳定的结构域可被进一步修饰从而使配体缺少对Fab的亲和力而保持Fe亲和力，例如通过G29A突变来实现。因此，该申请的公开内容通过引用其整体而结合到本文中。本文所用的氨基酸编号方式为本领域常规使用的方式，以蛋白A的结构域B上的位置为例，且本领域的技术人员可容易地识别每个E、D、A、B、C结构域或蛋白Z的突变位置。
在一个有利的实施方案中，配体被制成结构域B的多聚体拷贝，并且通过将至少一个天冬酰胺残基突变为非谷氨酰胺的氨基酸(例如N23T)以获得结构域B的碱稳定性；并且含有在碱稳定的结构域B的第29位上的氨基酸残基的突变，例如G29A突变。在另一个实施方案中，将配体制成蛋白Z的多聚体拷贝，其中通过将至少一个天冬酰胺残基突变为非谷氨酰胺的氨基酸以获得碱稳定性。在一个有利的实施方案中，通过将至少第23位天冬酰胺残基突变为非谷氨酰胺的氨基酸以获得碱稳定性。如本领域技术人员易于理解，可用常规的分子生物学技术以任何的次序进行P57的取代、提供碱稳定性的突变以及G到A的突变。此外，可用含有编码突变的蛋白配体的核酸序列的载体表达配体。或者，可通过蛋白质合成技术制备配体。合成预先确定序列的肽和蛋白质的方法为本领域所熟知且普遍可被使用。因此，在本发明中，术语“葡萄球菌蛋白A的碱稳定结构域B”意指基于SpA的结构域B的碱稳定蛋白质，例如在US专利申请公布US 2005/0143566和US 2006/0194950中描述的突变蛋白质；还指其他来源但具有功能上等效的氨基酸序列的其他碱稳定蛋白质。如技术人员所理解，表达的蛋白质在固定到支持物上之前应被纯化到适当的程度。这样的纯化方法为本领域所熟知，且使用标准方法可容易地将基于蛋白质的配体固定到支持物上。适当的方法和支持物将在下面更详细地讨论。因此，在一个实施方案中，本发明的突变蛋白质包含至少约75%，例如至少约80%或优选至少约95%的SEQ ID NO:1或2所定义的序列，前提是在第21位没有天冬酰胺突变。在本说明书中，SEQ ID NO:1定义了 SpA的B结构域的氨基酸序列:
Ala Asp Asn Lys Phc Asn Lys Glu Otn Gtn Asn Ala Phc Tyr Glu flc
Lcu His Lcu Pro` Asn Lcu Asn Glu Glu Gtn Arg Asn Cily Phc Jle Gln
Scr Lcu Lyh Asp Asp Pro Scr GIn Scr Aki Asii Lcu Leo Ak Glu Ala Ιλ% Lys Lcti Asn Αψ Ala Gln AIn Pai Lys。SEQ ID NO: 2定义了称为蛋白Z的蛋白质:
VaI Asp Asn Ly.s Phe Asn Ly.s GIu GIn GIn Asn Ala Phe TyrGlu He Lcu Hw Leu Pro Asn Lcu A^rt Glti GIu Gtn Arg Asn Ala Phc He GIn
o
Scr Leu Lys Asp Α,ψ Pai Ser Gln Ser Ala Am L-cu 1-.cn Ah Glii Ala Lv*s L\rs Lcii Asn Asp Ala Ciln Ala Pro Lvs
f ' if ——- ' '' I'— ' ' 'a蛋白Z为源自SpA的B结构域的合成构建体，其中在第29位的甘氨酸被置换为丙氨酸，参见例如生物过程技术百科全书:发酵、生物催化和生物分离(The Encyclopediaof Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation), M.C.Fleckinger 和 S.W.Drew 编辑，John Wiley and Sons Inc., New York, 8-22 中的Stihl等，1999:生物技术中的亲和融合:聚焦蛋白A和蛋白G (Affinity fusions inbiotechnology: focus on protein A and protein G)。
在一个实施方案中，上述突变蛋白质包含SEQ ID NOs:1或2定义的氨基酸序列，或为其具有P57取代的功能性变体。在另一实施方案中，上述突变蛋白质包含SEQ ID NOs:4-8定义的氨基酸序列，或为其具有P57取代的功能性变体。本文中所用的术语“功能性变体”包括任何类似的序列，其包含一个或多个氨基酸位置上的进一步变异，所述变异不影响突变蛋白质对免疫球蛋白的亲和力，或不影响其在增加的PH值环境中所改进的化学稳定性。在一个有利的实施方案中,本发明的P57取代选自大体积氨基酸或产生“刚性”的氨基酸，例如Y、W、F、M、1、V、T ;且其中亲本分子包含由SEQ ID NO: 1_8定义的序列，或其任何功能性变体。在另一实施方案中，P57被易于形成α螺旋的氨基酸取代，例如E、A、L、
H、M、Q、K，且其中亲本分子包含由SEQ ID NO: 1-8定义的序列，或其任何功能性变体。取代更优选为P57I。如上所述，为获得用作在碱性条件下具有长时间的高度结合能力配体的突变蛋白质，应避免在第21位上的天冬酰胺残基的突变。在一个实施方案中，在第3位上的天冬酰胺残基没有突变。在某些实施方案中，在多聚体配体的至少一个单体中最接近C末端的脯氨酸残基被取代。在另外的实施方案中，在多聚体配体的所有单体中最接近C末端的脯氨酸残基被取代。 在一个有利的实施方案中，位于亮氨酸残基和谷氨酰胺残基之间的天冬酰胺残基还被突变为例如苏氨酸残基。因此，在一个实施方案中，由SEQ ID NO: 2定义的序列的第23位上的天冬酰胺残基被突变为例如苏氨酸残基。在一个具体的实施方案中，由SEQ IDNO: 2定义的序列的第43位上的天冬酰胺残基还被突变为例如谷氨酸。在第43位氨基酸被突变的实施方案中，最有利的是与至少一个其他的突变联合，例如N23T。因此，本发明包括以上论述的单体突变蛋白质。然而，这样的蛋白质单体可组合成多聚体配体,例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体等。因此,本发明的另一方面为包含至少一个本发明的突变蛋白质及一个或多个其他单元的多聚体，其他单元优选同样为本发明的突变蛋白质。因此，本发明为例如由两个重复单元组成的二聚体，或由四个重复单元组成的四聚体。在某些实施方案中，多聚配体包含两个或更多个(例如2-4个)拷贝的相同单体结构域，所述结构域来自蛋白A的结构域E、D、A、B、C或蛋白Z或任何功能性变体。在另外的实施方案中，多聚体配体包含两个或更多个(例如2-4个)不同的单体结构域，其选自蛋白A的结构域E、D、A、B、C或蛋白Z或任何功能性变体
在一个实施方案中，本发明的多聚体包含连接有一段氨基酸(优选长度为0-15个氨基酸，例如0-10或5-10个氨基酸)的单体单元。这类连接物的性质应优选不会蛋白质单元的空间构像不稳定。此外，所述连接物还应优选为在碱性环境中足够稳定，不削弱突变的蛋白质单元的性质。在另一实施方案中， 本发明的二聚体配体包括SEQ ID NO: 3的序列:
权利要求
1.从液体中分离一种或多种含有免疫球蛋白的蛋白质的方法，所述方法包括: (a)使所述液体与含有固定在支持物上的配体的分离基质接触； (b)通过与配体相互作用，使所述含有免疫球蛋白的蛋白质吸附到基质上； (c)洗涤被吸附的含有免疫球蛋白的蛋白质的任选步骤； (d)通过使基质与释放蛋白质的洗脱液接触回收所述含有免疫球蛋白的蛋白质； 改进之处在于每种所述的配体含有一个或多个葡萄球菌蛋白A (SpA)的结构域(单体)(E、D、A、B、C)或蛋白Z或其功能性变体，其中在至少一个结构域中最接近C末端的脯氨酸被取代为任何其他的氨基酸。
2.权利要求1的方法，其中所述的一个或多个蛋白A的结构域或蛋白Z为两个或更多个来自相同结构域E、D、A、B、C或蛋白Z的拷贝。
3.权利要求1的方法，其中所述一个或多个蛋白A的结构域或蛋白Z为两个或更多个选自结构域E、D、A、B、C或蛋白Z的结构域。
4.权利要求1的方法，其中所述一个或多个蛋白A的结构域或蛋白Z选自结构域B、结构域C或蛋白Z。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中在多聚体配体的至少一个单体中最接近C末端的脯氨酸被取代为其他的氨基酸。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中在多聚体配体的所有单体中最接近C末端的脯氨酸被取代为其他的氨基酸 。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中在至少一个单体中最接近C末端的脯氨酸被取代为选自Y、W、F、M、1、V、T的氨基酸。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中在至少一个单体中最接近C末端的脯氨酸被取代为异亮氨酸。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中在至少一个单体中最接近C末端的脯氨酸被取代为选自E、A、L、H、M、Q、K的氨基酸。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述配体通过将至少一个天冬酰胺残基突变成非谷氨酰胺的氨基酸而具有碱稳定性。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中所述配体具有对免疫球蛋白的Fe部分的亲和力，但缺乏对免疫球蛋白的Fab部分的亲和力。
12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述配体的至少一个甘氨酸被取代为丙氨酸。
13.权利要求11或12的方法，其中对应于蛋白A的B结构域的第29位的甘氨酸残基被替换为丙氨酸。
14.前述权利要求中任一项的方法，其中所述配体为蛋白Z，其中通过将至少一个天冬酰胺残基突变成非谷氨酰胺的氨基酸而获得碱稳定性。
15.权利要求14的方法，其中通过将至少第23位的天冬酰胺残基突变成非谷氨酰胺的氣基酸而获得蛋白Z的喊稳定性。
16.前述权利要求中任一项的方法，其中所述多聚体为二聚体。
17.前述权利要求中任一项的方法，其中所述多聚体为四聚体。
18.前述权利要求中任一项的方法，其中所述含有免疫球蛋白的蛋白质为单克隆抗体。
19.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述含有免疫球蛋白的蛋白质为多克隆抗体。
20.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述含有免疫球蛋白的蛋白质为含有与其他蛋白质融合的免疫球蛋白Fe部分的融合蛋白。
21.用于分离含有免疫球蛋白的蛋白质的配体，所述配体包含一个或多个葡萄球菌蛋白A (SpA)的结构域(单体)(E、D、A、B、C)或蛋白Z或其功能性变体，其中在至少一个结构域中最接近C末端的脯氨酸被取代为任何其他氨基酸。
22.权利要求21的配体，其中所述一个或多个蛋白A的结构域或蛋白Z为两个或更多个来自同样的结构域E、D、A、B、C或蛋白Z的拷贝。
23.权利要求1的配体，其中所述一个或多个蛋白A的结构域或蛋白Z为两个或更多个选自结构域E、D、A、B、C或蛋白Z的结构域。
24.权利要求1的配体，其中所述一个或多个蛋白A的结构域或蛋白Z选自结构域B、结构域C或蛋白Z。
25.权利要求21-24中任一项的配体，其中在多聚体配体的至少一个单体中最接近C末端的脯氨酸被取代成其他氨基酸。
26.权利要求21-25中任一项的配体，其中在多聚体配体的所有单体中最接近C末端的脯氨酸被取代成其他氨基酸。
27.权利要求21-26中任一项的配体，其中在至少一个单体中最接近C末端的脯氨酸被取代为选自Y、W、F、M、1、V、T的氨基酸。
28.权利要求21-27中任一项的配体，其中在至少一个单体中最接近C末端的脯氨酸被取代成异亮氨酸。`
29.权利要求21-28中任一项的配体，其中在至少一个单体中最接近C末端的脯氨酸被取代为选自E、A、L、H、M、Q、K的氨基酸。
30.权利要求21-29中任一项的配体，其中所述配体通过将至少一个天冬酰胺残基突变成非谷氨酰胺的氨基酸而具有碱稳定性。
31.权利要求21-30中任一项的配体，其中所述配体具有对免疫球蛋白的Fe部分的亲和力，而缺乏对免疫球蛋白的Fab部分的亲和力。
32.权利要求21-31中任一项的配体，其中所述配体的至少一个甘氨酸被取代成丙氨酸。
33.权利要求31或32的配体，其中对应于蛋白A的B结构域的第29位的甘氨酸残基被替换成丙氨酸。
34.权利要求21-33中任一项的配体，其中所述配体为蛋白Z，其中通过将至少一个天冬酰胺残基突变成非谷氨酰胺的氨基酸而获得碱稳定性。
35.权利要求34的配体，其中通过将至少第23位的天冬酰胺残基突变成非谷氨酰胺的氣基酸而获得蛋白Z的喊稳定性。
36.权利要求21-35中任一项的配体，其中所述多聚体为二聚体或四聚体。
37.包含至少一个权利要求21-36中任一项的配体的分离基质，所述配体被偶联在固体支持物上。
38.权利要求37的分离基质，其中所述固体支持物包括多糖，例如琼脂或琼脂糖。
39.权利要求37-38中任一项的分离基质，其中所述固体支持物是交联的。
40.权利要求37-39中任一项的分离基质，其中所述配体通过硫醚键偶联。
41.权利要求37-40中任一项的分离基质，其中所述基质的配体含量为5-15mg/ml，例如 5-1 0 mg/ml。
全文摘要
本发明涉及从液体中分离一种或更多种含有免疫球蛋白的蛋白质的方法。本方法包括首先将液体与含有固定在支持物上的配体的分离基质接触；使含有免疫球蛋白的蛋白质通过与配体相互作用吸附到基质上；然后进行洗涤被吸附的含有免疫球蛋白的蛋白质的任选步骤；和通过使基质与释放蛋白质的洗脱液接触而回收所述的含有免疫球蛋白的蛋白质。本方法改进了以前的分离方法，其中每个配体包含一个或多个蛋白A结构域(E，D，A，B，C)或蛋白Z或其功能性变体，其中至少一个单体具有第三个α-螺旋后最接近C末端的脯氨酸残基的取代。
文档编号B01D15/38GK103228328SQ201180056577
公开日2013年7月31日 申请日期2011年11月28日 优先权日2010年11月29日
发明者T.毕约克曼, G.罗德里戈 申请人:通用电气健康护理生物科学股份公司