通过使用不混溶中间流体进行分子反应的方法
【专利摘要】本发明涉及用于在装置中进行分子反应的方法，包括如下步骤:(a)将一或多种试剂溶液和不混溶中间流体引入所述装置中，其中所述装置包含其上固定有化学或生化可识别实体的基材；(b)在所述固定的化学或生化可识别实体与所述试剂溶液之间进行分子反应；或者在存在所述试剂溶液时在所述固定的化学或生化可识别实体上进行分子反应；(c)用所述不混溶中间流体替换存在于所述基材上的试剂溶液；(d)分离所述不混溶中间流体和所述试剂溶液；和重利用所述试剂溶液和/或不混溶中间流体进行一或多次步骤(a)至(e)的重复。本发明还涉及用于进行分子反应的装置，包含反应区，储存器和液体连接件，以及其中所述不混溶中间流体和所述试剂溶液可由重力分离来分离的收集和再生区、或者其中将不混溶中间流体和试剂溶液分离的重导向和分配模块。本发明还涉及不混溶中间流体用于替换微观流体装置的反应区中存在的试剂溶液的用途，以及相应的装置用于进行测序反应或核酸合成反应的用途。
【专利说明】通过使用不混溶中间流体进行分子反应的方法
发明领域
[0001]本发明涉及用于在装置中进行分子反应的方法，包括如下步骤:(a)将一或多种试剂溶液和不混溶中间流体引入所述装置中，其中所述装置包含其上固定有化学或生化可识别实体的基材；(b)在所述固定的化学或生化可识别实体与所述试剂溶液之间进行分子反应；或者在存在所述试剂溶液时在所述固定的化学或生化可识别实体上进行分子反应；(C)用所述不混溶中间流体替换存在于所述基材上的试剂溶液；(d)分离所述不混溶中间流体和所述试剂溶液；和重利用所述试剂溶液和/或不混溶中间流体进行一或多次步骤(a)至(e)的重复。本发明还涉及用于进行分子反应的装置，包含反应区，储存器和液体连接件，以及其中所述不混溶中间流体和所述试剂溶液可由重力分离来分离的收集和再生区、或者其中将不混溶中间流体和试剂溶液分离的重导向(redirection)和分配模块。本发明还涉及不混溶中间流体用于替换微观流体装置的反应区中存在的试剂溶液的用途，以及相应的装置用于进行测序反应或核酸合成反应的用途。
[0002]发明背景
[0003]现代分子反应装置往往是基于离散的液体小滴或单位大小的液体包(packet)的微操控。这些包可以用一组基本指令以离散的方式进行转移、储存、混合、反应、和/或分析。为建立所述液体的包装特性并防止相邻小滴的聚结，可使用不混溶载体液(Chen等，2007，Langmuir, 23, 2255-2260)。此类不混溶载体液通常是稳定的具有高沸点、高密度、高粘度和显著降低的水溶性的基于碳氟化合物的流体。根据Chen等，2007，包括FC-3283和FC-40在内的基于碳氟化合物的流体可用作间隔液以用于在分离的试剂栓(plug)中的蛋白结晶反应。然而，此方法的施行仅被显示用于少量的情况，包括微粒的合成(Xu等，2005, Angew.Chem.1nt.Ed., 44, 724-728)或双重乳化(double emulsion) (Utada 等，2005，Science,308，537-541)。
[0004]在其它分子【技术领域】，例如DNA测序领域，目前的方法是基于在大阵列中以相对短的读取长度进行的高度并行的分子反应。这是因为向DNA链添加碱基需要大约少于I小时每碱基对。因而，添加大约100个碱基对需要大约3.5至4天的运行时间，构成了目前测序机器中通常I周测序运行时间的大部分。测序速度低的一个原因是并入核苷酸时受限的反应速率，其由于成本原因而受限于酶或者反应混合物中其它反应物的浓度。更重要的是，由于在每步并入核苷酸之后需要洗涤整个表面，通常会浪费所有的试剂。因而，总的试剂消耗主要与读取长度成比例并且构成了主要的成本因素。这继而导致倾向于尽可能地降低试剂浓度而具有反应时间较长的缺点。
[0005]因而需要新的方法学，其使得能在装置中进行分子反应而不浪费试剂溶液，并且同时有助于总成本的降低和反应速率的提高。
[0006]发明概述
[0007]本发明解决了此种需求并提供了手段和方法，其使得能以降低的总成本和潜在提高的速率来进行分子反应。具体而言，该目标是通过提供试剂溶液的重利用而实现的，更具体地是通过在装置中进行分子反应的方法来实现的，所述方法包括如下步骤:[0008](a)将一或多种试剂溶液和不混溶中间流体引入所述装置中，其中所述装置包含其上固定有化学或生化可识别实体的基材；
[0009](b)在所述固定的化学或生化可识别实体与所述试剂溶液之间进行分子反应；或者在存在所述试剂溶液时在所述固定的化学或生化可识别实体上进行分子反应；
[0010](c)用所述不混溶中间流体替换存在于所述基材上的试剂溶液；
[0011](d)分离所述不混溶中间流体和所述试剂溶液，优选在收集和再生区进行；和
[0012](e)重利用所述试剂溶液和/或不混溶中间流体进行一或多次步骤(a)至(e)的重复。
[0013]此方法提供了若干优势:利用不混溶中间流体使得能防止分子反应中通常使用的试剂的污染和/或稀释，并从而为有效重利用这些试剂铺平了道路。另外，由于重利用所述试剂的可能性，可以提高反应物的浓度，特别是限速化合物如酶或标记的核苷酸的浓度。这继而可以在某些情形中使反应以数量级加速，且由于重复循环反应而仍受益于降低的总试剂成本。在测序反应的范围，这意味着测序反应运行地更便宜和更快并使得整个测序过程(包括样品制备和生物信息学分析)能在一天内完成。类似的改善在其它分子反应情形中也是可能的，例如在核酸或蛋白合成方法中。
[0014]在本发明另外的优选实施方案中，上文所述的方法另外包括用洗涤缓冲液洗涤所述基材的步骤，其中通过所述不混溶中间流体使所述洗涤缓冲液与所述试剂溶液分开。
[0015]在另一个优选实施方案中，上文所述的方法另外包括测量所述分子反应的状态或结果的步骤。在特别优选的实施方案中，可以通过光学和/或电子手段进行所述测量。
[0016]在本发明另一个优选的实施方案中，上文所述方法的所述替换步骤(C)是通过气动流体驱动(pneumatic fluid driving)、螺动传动(peristaltic actuation)、活塞和传动膜驱动、或应用定向真空(vectored vacuum)来进行的。
[0017]在本发明另一个优选的实施方案中，上文所述方法的所述分离步骤(d)是通过用重力分离将所述试剂溶液与所述不混溶中间流体分离来进行的。
[0018]在另一方面，本发明涉及用于进行分子反应的装置，包括:
[0019](a)反应区，包含其上固定有化学或生化可识别实体的基材；
[0020](b)储存器和液体连接件，其使得试剂溶液、不混溶中间流体以及任选存在的洗涤缓冲液能通过所述反应区，其中所述不混溶中间流体能够从所述反应区替换所述试剂溶液；和
[0021](C)收集和再生区，其中所述不混溶中间流体和所述试剂溶液可由重力分离来分离，使得能通过将所分离的液体引导回所述反应区而再利用所述不混溶中间流体和所述试剂溶液。在一特别优选的实施方案中，所述收集和再生区包含一个与反应区连接的入口，且在一进一步优选的实施方案中，额外地包含两个分别与试剂溶液的储存器和不混溶中间流体的储存器连接的出口。
[0022]在另一方面，本发明涉及用于进行分子反应的装置，包括:
[0023](a)反应区，包含其上固定有化学或生化可识别实体的基材；
[0024](b)储存器和液体连接件，其使得试剂溶液、不混溶中间流体以及任选存在的洗涤缓冲液能通过所述反应区，其中所述不混溶中间流体能够从所述反应区替换所述试剂溶液；和[0025](c)重导向和分配模块，其中检测从所述不混溶中间流体至所述试剂溶液的转换并分离所述流体和溶液，使得能通过将所分离的液体引导回所述反应区而再利用所述不混溶中间流体和所述试剂溶液。在一特别优选的实施方案中，所述重导向和分配模块任选包含一个与反应区连接的入口，且在一进一步优选的实施方案中，额外地包含两个分别与试剂溶液的储存器和不混溶中间流体的储存器连接的出口。
[0026]在本发明优选的实施方案中，上文所述的装置是微观流体装置。在特别优选的实施方案中，所述装置是集成微观流体盒(integrated microfluidic cartridge)。
[0027]在另外的优选实施方案中，上文所述的分子反应是测序反应或者核酸合成反应。
[0028]在另一方面，本发明涉及不混溶中间流体的用途，其用于从微观流体装置的反应区基材替换所述反应区中存在的试剂溶液，其中所述反应区包含具有化学或生化可识别实体的基材，并用于使得所述化学或生化可识别单元活化或具有反应性((re_)active)。
[0029]在本发明优选的实施方案中，所述化学或生化可识别实体是核酸、肽、多肽、碳水化合物、其修饰的形式，核酸、肽、多肽、碳水化合物、其修饰的形式的阵列，或者其任意组
入
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[0030]在本发明另一个实施方案中，上文所述的不混溶中间流体包含或由(全)氟化烃和/或(全)氟化硅酮(silicone)组成。在特别优选的实施方案中，所述不混溶中间流体包含或由(全)氟化饱和烃组成。
[0031]在本发明另外的优选实施方案中，上文所述不混溶中间流体具有所述不混溶中间流体具有低于大约0.1Pa.S的粘度，高于大约1100kg/l的密度，高于大约50°C的沸点和低于大约1%的水溶性。
[0032]在本发明另外的特别优选的实施方案中，上文所述的不混溶中间流体是Fluorinert Electronic Liquid FC_40o
[0033]在另一方面，本发明涉及上文定义的装置用于进行测序反应或用于进行核酸合成反应的用途。
[0034]附图简述
[0035]图1显示实施本发明方法的流控方案的侧视图，其中1=洗涤缓冲液(WB)储存器，2=试剂溶液(RS)和不混溶中间流体(IF)储存器，3=反应室，4=试剂溶液(RS)和不混溶中间流体(IF)收集和再生室，5=废物室以及X=阀。
[0036]图2显示实施本发明方法的流控方案的俯视图，其中1=洗涤缓冲液(WB)储存器，2=试剂溶液(RS)和不混溶中间流体(IF)储存器，3=反应室，4=试剂溶液(RS)和不混溶中间流体(IF)收集和再生室，5=废物室以及X=阀。
[0037]图3显示FC40的化学结构。
[0038]图4显示FC-40对杂交信号的作用。
[0039]图5显示FC-40对末端修复(end_repair) PRC反应的作用。
[0040]实施方案详述
[0041]本发明人开发了手段和方法，其使得能够基于试剂溶液的重利用而以提高的速率和降低的总成本来进行分子反应。
[0042]虽然本发明将以特定的实施方案来进行描述，本说明书不应理解为限定意义。
[0043]在具体描述本发明的示例性实施方案之前，提供了对于理解本发明而言重要的定义。
[0044]如本说明书中以及所附的权利要求书中所用的单数形式的〃 一个(a和an) 〃也包括相应的复数，除非上下文清楚地给出另外的指示。
[0045]在本发明的背景中，术语〃大约〃和〃约〃表明本领域技术人员会理解的准确度的区间以确保所涉及的特征的技术效果。该术语通常表示从所表示的数量值偏差±20%，优选±15%，更优选±10%，且更优选±5%。
[0046]应理解术语〃包含〃是非限制性的。对于本发明的目的，术语〃由……组成〃被认为是术语"包含"的优选实施方案。如果下文中的组被定义为包含至少某数目的实施方案，这也意味着涵盖了优选仅由这些实施方案组成的组。
[0047]此外，说明书和权利要求书中的术语〃第一 〃，〃第二 〃，〃第三〃或〃 (a) 〃，〃 (b) 〃，〃(c)〃，"(d) 〃以及类似的等，是用于区别类似的要素且并不必然用于描述次序或时间先后顺序。应理解如此使用的术语在适当情况下是可互换的，并且本文所描述的本发明的实施方案能以本文所描述或演示的之外的其它次序操作。
[0048]如果术语〃第一 〃，〃第二 〃，〃第三〃或〃 (a) 〃，〃 (b) 〃，〃 (C) 〃，〃 (d) 〃等涉及方法或用途的步骤，则在步骤之间没有时间或时间间隔的相干性(coherence)，也即步骤可以同时进行或者此类步骤之间可以有秒、分钟、小时、天、周、月或者甚至年的时间间隔，除非在上文或下午所述的本申请中另有指明。
[0049]应理解本发明并不局限于本文所描述的特定的方法学、方案、试剂等，因为这些可以变化。还应理解本文所用的措辞仅仅是用于描述特定的实施方案的目的，而并不是要限制本发明的范围，该范围将仅有所附的权利要求来限定。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语都具有本领域技术人员通常所理解的相同含义。
[0050]如上文所述，本发明一方面涉及用于在装置中进行分子反应的方法，包括如下步骤:
[0051](a)将一或多种试剂溶液和不混溶中间流体引入所述装置中，其中所述装置包含其上固定有化学或生化可识别实体的基材；
[0052](b)在所述固定的化学或生化可识别实体与所述试剂溶液之间进行分子反应；或者在存在所述试剂溶液时在所述固定的化学或生化可识别实体上进行分子反应；
[0053](c)用所述不混溶中间流体替换存在于所述基材上的试剂溶液；
[0054](d)分离所述不混溶中间流体和所述试剂溶液，优选在收集和再生区进行；和
[0055](e)重利用所述试剂溶液和/或不混溶中间流体进行一或多次步骤(a)至(e)的重复。
[0056]如本文所用，术语"装置"是指允许或适宜于分子反应进行的构件，例如盛器(receptacle)、室或容器、或者仪器。所述装置可相应地装配有一或多个入口和/或出口元件，其可以包含一或多个表面，例如反应表面或者具有具体功能性的表面，其可以包含反应区、洗涤区、混合区、等待区、测量区、废物区、储存器区、再收集和再生区、或者再收集或再生区等，或者其任意的子部分或组合。其还可以包含这些元件之间的连接件，例如管或接头(joint);和/或其可包含要在装置中使用的液体、流体、化合物、成分、样品或任意其它实体的储存器和存放处。
[0057]优选地，其可包含反应区。此〃反应区〃可以是封闭的实体，其仅包含与该区的尺寸相比尺寸较小的入口和/或出口构件并且被理解为〃反应室〃；或者其可以是开放的构件，与装置中存在的其它实体自由连接。反应区可以适宜于使所述的分子反应进行，或者在某实施方案中可以装配有或包含元件使反应在所述实体中发生。为了适宜于使反应进行，可以在反应区中设定或调节一或多个参数。例如，可将反应区中的温度调节为本领域技术人员已知的适宜值。该值可主要取决于要选择的靶分子和发生的反应或相互作用的类型，并且可以根据反应物类型、反应类别、所设想的速率、反应终止点考量及本领域技术人员已知的其它参数而有不同。
[0058]使反应发生的元件可以是基材，化学、生化、生物或其它实体的阵列，催化剂等。另夕卜，反应区可以由适宜于测量或移动活动的区域所组成，例如其可包含可移动的表面使所封闭的空间缩小，和/或其可包含导电区或电容区等和/或其可包含一或多个允许光学检测的透明表面。在某些实施方案中，反应的尺度和/或形式可以适于一种上述的功能。在另外的实施方案中，所述装置可另外地或者可选地包含一或多个检测区。此区可以等同于其它区，或者可以与其它区例如反应区或混合区等分开。在本发明含义之内的检测区可包含传感器或检测器元件，例如用于通过电子、光学、嗅觉、或听觉来检测反应产物、反应结果或者用于检查反应步骤是否已经完结。这些区可以包括，例如导电区或电容区等，或者其可以包含一或多个透明表面以允许对例如反应结果进行光学检测，如标记反应的进行或者强
/又寸。
[0059]在本发明另外的实施方案中，所述装置可另外地或者可选地包含加热模块或调节单元以用于控制和/或调节温度，例如其中可将温度保持恒定在期望值或者可以依据反应类型或反应循环等而设定为期望值的加热区。在另外的实施方案中所述装置可另外地或可选地包含冷却模块，例如其中可将温度保持恒定在期望值或者可以依据反应类型或反应循环等而设定为期望值的冷却区。这些区还可进一步装配有适宜的传感器元件使得能测量温度改变或温度梯度。
[0060]所述装置可另外地或可选地含有单元、元件或装备，使得能进一步改变参数，如带电实体的存在、离子的存在，或者可以传递机械或剪切力等。例如，所述元件可适宜于建立电流或电泳电流，所述元件可适宜于提供具体的PH或者化学或物理实体的具体存在，例如某些酸、盐、溶剂等的存在，和/或所述元件可适宜于提供强烈的介质移动。任意上述的另外的设备可用于装置的任何部分，例如在反应区或反应室中。
[0061]在另外的具体实施方案中，所述装置可另外地或可选地含有使得可以对流速、粘度或密度值、一种状态至另一状态的转换、试剂的存在或不存在、中间不混溶流体的存在或不存在等进行检测的模块。
[0062]如本文所用的术语"分子反应"是指在分子基础上(在某些实施方案中时在大分子的基础上)的化学、生化、生物学、或物理相互作用，或者其任意组合，优选是指化学或生化反应。在某些实施方案中还虑及了亚分子相互作用(sub-molecular interaction),例如涉及分子的部分、或单个原子或离子的相互作用。所述反应可在所述装置的表面发生，其可在所述装置内的实体中发生而不与其表面有联系，或者其可在装置的两个部分(sector)都发生。例如，分子反应优选地，所述分子反应可在上文所述的反应区或反应室中发生。
[0063]在步骤(a)中，将一或多种试剂溶液和不混溶中间流体引入所述装置中，其中所述装置包含其上固定有化学或生化可识别实体的基材。如本文所用，术语"试剂溶液"是指包含一或多种反应物的液体或流体，所述反应物对于溶液本身的组分之间的反应、或者对于溶液的组分与装置的构件、元件或形式(例如反应区或反应室的构件、元件或形式)之间的相互作用是必需的或者使其可进行。所述试剂溶液可以例如是，包含化学、生化或生物学实体的水性溶液，如核酸或其片段，肽，多肽，如抗体、酶等，核苷酸，化学标记，特定浓度的盐或离子，一或多种缓冲液或缓冲组分等，或者大分子结构元件如可移动珠，聚合结构等。另外，所述试剂溶液可任选包含可检测的染料，其可以例如用于检测试剂溶液和不混溶中间流体之间的转换，或者检测两种或更多种类型的试剂溶液之间的转换。根据本发明，可使用单一的试剂溶液。或者，可以使用2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同的试剂溶液。如本文所用，术语"不同的试剂溶液"是指上述成分的任何差异，例如核酸、肽、多肽、离子、盐、缓冲组分、染料等的存在或不存在、或者浓度的差异。浓度的差异可以例如是大约5%、10%、20%、50%、100%、500%、1000%或更多或者其间的任意值的提高或者降低。另外，差异也可以是所述试剂溶液温度的差异，其粘度、密度、电传导、或本领域技术人员知道的流动参数的差异。不同的试剂溶液可以例如包含退火溶液、变性溶液、封闭溶液、去封闭溶液等或其任意组合。
[0064]如本文所用，术语〃不混溶中间流体〃是指与上文所述试剂溶液基本上不混溶或完全不混溶的流体。〃基本上不混溶〃的中间流体可包含高达大约0.01,0.02,0.05,0.07、0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8或高达1%的不同流体，特别是试剂溶液，例如如本文所述的水性试剂溶液。优选地，不混溶中间流体包含比例为少于1%、更优选少于0.5%、更优选少于0.1%的水或水性溶液。通常，所述不混溶中间流体在与试剂溶液(例如本文所定义的水性溶液)形成接触时形成分离的相。不混溶中间流体和试剂溶液之间的分离优选可以是基本完全的或者是完全的，例如导致所述不混溶中间流体与至少99%、99.5%、99.9%,99.99%,99.999%,99.9999%或100%的所述试剂溶液分离。具体而言，本发明优选的实施方案中所述不混溶中间流体显示出所述试剂溶液组分在所述中间流体中的不可溶性、或所述试剂溶液组分在所述中间流体中的基本不可溶性。如本文所用，术语"试剂溶液组分的不可溶性"是指所述试剂溶液的组成在与所述中间流体接触时不改变。如本文所用，术语"试剂溶液组分在所述中间流体中的基本不可溶性"是指所述中间流体可含有至多大约 0.01,0.02,0.05,0.07,0.08,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8% 或至多 1% 的所述试剂溶液的一或多种组分。在另外的实施方案中，所述不可溶性特别是指表面区域，其中试剂溶液的组成可基本不变，由此使得可以重利用。在本发明特别优选的实施方案中，基材上反应位点的比率，例如化学或生化可识别实体的比率，可以是在溶液中大量过量的。
[0065]不混溶中间流体可包含单一化学特征(例如单一结构或构象)的分子，和/或单一物理性质(例如单一的沸点、单一的粘度、单一的密度、单一的导电性)的分子，或者其可包含两种或更多种分子类型或类别，例如不同化学特征的分子类型。优选地，此类不同分子类型具有类似的或相当的物理性质，例如类似的沸点、类似的粘度、类似的密度、或类似的导电性。还优选的是其化学和/或物理性质以这样的方式类似的分子类型，所述方式使得两种分子能够组合以提供组合的不混溶中间流体，具有平均的沸点、粘度或密度。
[0066]如本文所用，在〃不混溶中间流体〃的背景中的术语〃中间〃是指该流体的功能是让所述一或多种试剂溶液或其它流体实体彼此互相分离或不接触。例如，如果提供了两种不同的试剂溶液或流体实体，例如以小滴、流体单元或栓(Plug)的形式，根据本发明的所述中间不混溶流体可以在这些试剂溶液单元或流体单元之间，例如填充两个小滴或栓之间的空间。因而，所述不混溶流体可以使根据本发明的所述一或多种试剂溶液不接触，其因此构成了所述试剂溶液之间的中间流体、或装置中不与所述不混溶中间流体混溶的任意其它类型流体成分之间的中间流体。通过进行此操作，不混溶中间流体以流体单元、小滴、或栓本身的形式分离。在本发明具体的实施方案中，由不混溶流体所分开或分离的相同试剂溶液的单元可以穿过或穿越反应区。优选地，所述分开导致第一种试剂溶液与所述不混溶流体完全不混溶或完全不混合和/或导致第一种试剂溶液与第二种或随后的试剂溶液完全不混溶或完全不混合。在另外的具体实施方案中，此类试剂溶液单元可包含不同的成分、不同浓度的成分，可具有不同的温度、不同的粘度、不同的导电性，颜色不同，具有不同的pH、不同的酶浓度，显示封闭材料、去污剂、离子、盐的存在或不存在，或者具有任意适宜的参数差异。此类另外的参数会是本领域技术人员知晓的，或者可以得自适宜的教科书。
[0067]在本发明另外的具体实施方案中，引入所述装置的第一种试剂溶液可引起装置的部分的分子修饰，例如基材区域，特别是如本文所述的反应区或反应室的区域。或者，此种修饰还可以由随后引入的试剂溶液所引起。相应的分子修饰可以例如是，结合位点、相互作用结构域、活性位点或结构域的占据，或者基材表面区域的湿润，优选是由薄膜或液体湿润，更优选由薄水膜湿润。以上述的方式修饰，则所述不混溶中间流体的存在可能不会完全地提供试剂溶液第一和第二单元的部分的不相混溶性，例如，由于结合至结合位点的因子或实体，或者由于薄流体膜可保留在原位并因而会与第二种或随后的试剂溶液混合。
[0068]在另外的具体实施方案中，不混溶中间流体可包含另外的成分，即包含超过一种分子类型或类别，而包含化合物如表面活性剂、去污剂、染料或适宜的稳定剂。
[0069]术语〃引入〃如本文所用是指将试剂溶液和/或不混溶中间流体提供给上述的装置。可以通过将所述试剂溶液和/或不混溶中间流体注射至所述装置中来进行此提供。例如，在装置的混合物或T-型区，可从外部或内部的储存器、或者从注射器或其它适宜的盛器注射试剂溶液。类似地，在装置的此种混合物或T-型区，可从外部或内部的储存器、或者从注射器或其它适宜的盛器注射不混溶流体。优选地，这些实体的引入轮流发生或交替发生。
[0070]术语〃基材〃如本文所用是指本领域技术人员已知的任意适宜的基材。所述基材可具有任意适宜的形式或样式，例如其可以是平的、弧形的，例如朝向发生相互作用的区中凸地或中凹地呈弧形，其可以是卷曲的或者包含波状的样式。其还可以被组织为环状结构，或者其可以被组织为珠样元件或珠的形式(可例如安排至阵列中)。所述珠可布满基材平面或者通过链接元件如杆、接头等固定在反应区域，或者可以包含含有捕获分子的磁颗粒，被特定的封闭试剂覆盖等。
[0071]在另外的具体实施方案中，可使用本领域技术人员已知的包被的珠。在另外的实施方案中，所述基材可包含或由微结构表面、包被、或移动载体(其可优选被保持在反应区或反应室内)、或珠样元件所组成，但却有不同的形状。
[0072]通常，所述基材是固体支持物，即包含主要有非液体坚固性的支持材料并由此使得能精确且可追踪地对所述支持材料上的实体进行定位。基材的实例有固体材料或者包含功能性化学基团的基材，例如胺基或胺官能化的基团。本发明所虑及的另外的基材实例有多孔支持材料或多孔基材如尼龙，例如Nytran N或Nytran SPC*"* Biodyne G?。另外的典型支持材料或基材有非多孔基材。在非多孔基材中优选的有玻璃、硅酮(silicone)、融合硅石(包被有具有官能化基团的硅烷层如聚乙二醇、胺、环氧化物、异硫氰酸酯等)、聚-L-赖氨酸包被的材料、硝化纤维、聚苯乙烯、环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物物(COP)、聚丙烯、聚乙烯和和聚碳酸酯。对于肽/多肽实体的固定特别有用的另外的基材实例包括藻酸钙或其修饰的形式。通常，核酸可偶联至聚合的或无机的表面基材，例如上文所述的，其中有共价偶联；而肽、多肽或蛋白质实体偶联至聚合的或无机的表面基材，例如上文所述的，其中有或无共价偶联。
[0073]术语"可识别实体"如本文所用是指实体，特别是分子或大分子，其能够与其它分子、缓冲液、离子、盐或其它化合物相互作用并由此导致其与起始情形或与先前状态的区另O，例如共价键的建立、活性中心的占据、对适宜的区域或结构域的结合、构象或表面结构的变化、化学实体的并入(例如核苷酸、染料)、或本领域技术人员已知的任何其它区别。
[0074]如本文所用，"化学可识别实体"是指化学基团，例如有机分子、或者无机元件或分子、或者生化或生物分子的反应性基团，其适宜于化学相互作用、反应、结合相互作用、或任何其它类型的相互作用(提供了在化学上与起始情形、或先前状态不同的情形)。例如，此类实体可以对特定的化学反应而言是反应性的，或者其可以能使得化学结合相互作用、催化、转换、或化学产物的产生得以进行。如本文所用，术语"生化可识别实体"是指实质上大分子的相互作用，例如配体和相应受体之间的结合相互作用，或者酶及其底物之间的相互作用，或者封闭试剂等。这些相互作用主要涉及生化或生物学相关实体，如核酸、肽、多肽、蛋白质、抗体、酶及其底物、辅因子、结合因子等。在某些实施方案中，化学和生化可识别实体可以是相似的或基本相同的，或者生化相互作用可以是基于化学可识别实体或者反之。
[0075]术语〃固定的〃如本文所用是指化学或生化可识别实体通过分子相互作用而结合至支持性基材，所述分子相互作用将所述实体定位在所示基材的特定区域并同时阻止该实体的脱离(例如在洗涤、漂洗替换或相互作用步骤等期间)。通常，此类分子相互作用是基于所述支持材料和所要固定的化学或生化可识别实体的结构元件或官能团之间的共价化学键，例如核酸、肽/多肽、碳水化合物、或其经修饰形式的相应官能团，或者其组合。此类官能团以及使用适宜的化学来将其用于固定过程将会是本领域技术人员所熟知的。
[0076]在一个具体的实施方案中，可以通过由热或光交联化学或生化可识别实体来实现所述固定，即通过在由能量源如热或光提供的能量的影响和推动下，形成连接两者结构元件的分子相互作用或键，或者是通过化学固定。通常，经热交联的固定是通过在某温度干燥并随后烘烤基材上的化学或生化可识别实体来进行的。此方法优选用核酸的固定。据认为干燥和烘烤会导致分子通过疏水相互作用而附着至所述基材。此过程可被分类为物理吸附的亚形式。术语〃物理吸附〃涉及一种方法，其包括初始的分离和吸引步骤，由此所述化学或生化可识别实体接近反应性基团，这是基于物理吸附的方法。生物分子(例如核酸)被吸附至固体支持物上实际上可以用任何支持材料来进行，因为已观察到任何此类支持材料都会与几乎任何表面相互作用。
[0077]通常，支持材料和待固定化学或生化可识别实体之间的相互作用水平，会根据所述支持材料的性质和形式以及所述化学或生化可识别实体的大小和化学/物理/生物学性质而改。所述相互作用通常是五个阶段的过程，包括如下步骤:(i)将所述化学或生化可识别实体转移至所述基材的表面，(ii)吸附至所述表面，(iii)重排所吸附的化学或生化可识别实体，(iv)对所吸附的化学或生化可识别实体进行潜在的脱附，和(V)将脱附的化学或生化可识别实体从表面转移走。虽然该过程在某种程度上意味着脱附的潜力是固有的，但是基于所述化学或生化可识别实体的大小而言所述结合通常是不可逆的。脱附相互作用背景中的术语"化学或生化可识别实体的大小"，与存在的结合位点的数目有关。虽然原则上任意一个结合位点可以在任何时候从基材的表面解离，但是大量结合位点的作用是，包含化学或生化可识别实体的分子作为整体将保持结合。通过应用热形式的能量，例如在大约40至150°C的温度，优选50至120°C，更优选60至110°C，更优选70至100°C及最优选80至90°C，可增强所述化学或生化可识别实体物理吸附至支持物材料，并且有效固定所需的时间则可被缩短。可以将热交联进行任意本领域技术人员已知的适宜时间段，例如2min中12小时，优选1-3小时。可以通过本领域技术人员已知的任意适宜的手段来进行加热或烘烤交联，例如使用干燥箱或烤箱。在温度之外，还可以将其它参数调节至本领域技术人员已知的适宜值，如湿度、通风或换气。加热或烘烤交联还可以与其它形式的固定组合，如光交联或化学交联。
[0078]为诱导化学或生化可识别实体和支持物材料之间的相互作用，通常通过对所述化学或生化可识别实体应用典型波长的光来进行光交联，例如在150至550nm的范围内，优选在200至500nm的范围内。通常，所述化学或生化可识别实体和支持物材料之间所诱导的相互作用是所述化学或生化可识别实体的共价结合，例如结合至核酸，结合至所述材料。可以例如通过使用UV光来进行光交联。对于核酸的情况，键接经核酸分子的碱基进行，例如胸腺嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶残基，其与支持物材料上相应的和适宜的化学官能团反应，如本领域技术人员所知的那样。可以通过适宜的化学活化方法来控制和调整支持物材料之上或内部的化学官能团的存在和数目。此类活化方法可以例如在支持物材料之上或之内提供具体定位的官能团并促进所述化学或生化可识别实体和所述材料之间就这些定位的官能团而言的特定相互作用。所述支持物材料之上或内部的化学官能团的存在和数目还可以影响所固定的化学或生化可识别实体的朝向和自由度。
[0079]如本文所述的"化学固定"可以是所述支持物材料和所述化学或生化可识别实体之间基于化学反应的相互作用。此种化学反应通常不依赖于经热或光的能量输入，但是却可以被加热(例如化学反应的某最适佳温度)、或某波长的光所增强。例如，支持物材料上的官能团和所述化学或生化可识别实体的相应功能性元件之间可以发生化学固定。所述化学或生化可识别实体中的此类相应功能性元件可以是所述分子化学清单(inventory)的一部分，或者可以是额外引入的。此种官能团的实例有胺基。通常，所要固定的化学或生化可识别实体，例如核酸或肽/多肽，包含胺官能团或者是经化学修饰的以便包含胺官能团。此种化学修饰的手段和方法是本领域技术人员已知的。
[0080]或者，可直接在所示基材上合成所述化学或生化可识别实体。用于此过程的方法是本领域技术人员熟知的。核酸方面的实例有Agilent Inc.、Affymetrix Inc.、NimblegenInc.或Flexgen BV所开发的制备技术,其中例如Affymetrix Inc.使用经光网(reticle)的照射(illumination),而 Nimblegen Inc.使用像素化镜(pixilated mirror)以及Agilent Inc.提供了在适当位置印压四种不同核苷酸的技术。Flexgen BV使用扫描激光束。通常，使用对要发生核苷酸添加的点进行特异性活化的激光和镜组。此方法可提供，例如，大小在5和100 μ m之间的点，例如大约30 μ m或更大。化学或生化可识别实体，例如核酸，因而可具有高达约80个核苷酸的长度。在不同的也经虑及的技术中，可以使用非接触性喷墨(inkjet)打印方法来沉积所述化学或生化可识别实体沉积。在本发明具体的实施方案中，可将核酸(优选聚合物)均匀地沉积在特制的载玻片上。此原位合成技术通常可以产生60-聚体长的寡核苷酸探针，这是通过在合成方法中一个碱基接一个碱基合成，或者是通过打印预合成的寡聚物并将其共价偶合至表面。
[0081]对于肽、多肽或蛋白质的固定，例如对于酶的固定，优选通过共价结合至基材，例如以通过化学反应的基质的形式。可以通过使用适宜的间隔分子来对此技术进行补充或支持。此间隔分子的实例为聚乙二醇，其通常降低基材元件的空间位阻。
[0082]在步骤(b)中，在所述固定的化学或生化可识别实体与所述试剂溶液之间进行分子反应；或者在存在所述试剂溶液时在所述固定的化学或生化可识别实体上进行分子反应。术语"进行"如本文所用是指，在装置中所述固定的化学或生化可识别实体所在的区或区域(优选在反应区或反应室中)，将一或多种试剂溶液与经固定的上文所定义的化学或生化可识别实体接触。所述接触可以进行任意适宜的时间段，例如lsecjsecUOsec、30sec、lmin、2、min、5min、30min、lh、或几小时、甚至几天、或者这些值之间的任意时间。所述时间段可取决于所要进行的分子反应的类型，试剂溶液中成分的量和/或浓度，例如酶底物、核苷酸、标记、染料等的浓度，所使用的温度，封闭试剂的存在或缺失，反应的动力学，以及本领域技术人员已知的任意其它参数。所述接触还可以在其它适宜的条件下进行，例如在特别设定的PH或特定的pH范围，在特定的温度或特定的温度范围，以特定的成分浓度，例如反应液中特定的离子浓度、特定的多肽/肽浓度，优选特定的酶浓度等。此类条件会是本领域技术人员已知的并且可以根据反应类型和/或所设想的反应结果而进行调适。在本发明具体的实施方案中，可以将酶的浓度、更优选DNA聚合酶的浓度设定为大大高于目前测序反应中所使用的DNA聚合酶的量的值，例如高达目前所使用的1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、或50倍。在具体的实施方案中，也可使用其它成分浓度的类似提高，例如核苷酸、底物等。
[0083]在本发明的某些实施方案中，可以通过外部活动来控制所述分子反应的进行。例如，可以通过使用如上文所述的适宜的加热或冷却模块来设定、提高或者降低温度。另外，可测量pH、和/或通过所述装置中(优选反应区或反应室中)存在的适宜的pH设备来改变pH。
[0084]分子反应(优选完整的分子反应)的进行，可以依赖于一种试剂溶液的存在或者可以基于两种或更多种试剂溶液的使用。例如，第一试剂溶液可提供第一反应步骤、或准备步骤(例如去封闭步骤或封闭步骤等)所需的成分。第二或随后的试剂溶液可提供第二或随后的步骤中所需的成分，例如用于相互作用的成分如特定的酶、或酶底物、或特定的标签或染料等。
[0085]所述分子反应可以在所述固定的化学或生化可识别实体(例如核酸、肽/多肽、碳水化合物)和所述试剂溶液之间进行，其通常可导致所述固定的实体的化学或生化修饰，例如将化学基团添加至所述固定的实体，和/或所述试剂溶液的化学或生化修饰。或者，在存在所述试剂溶液时在所述固定的化学或生化可识别实体上进行所述分子反应。例如，所述试剂溶液可以提供催化成分，例如在所固定的化学或生化可识别实体上进行反应所需的酶活性，但却不会改变或基本上不会改变所述试剂溶液。所述分子反应优选通过移动动作而起始和/或终止，所述移动动作导致所述化学或生化可识别实体与所述试剂溶液的接触和/或导致所述化学或生化可识别实体与所述试剂溶液的所述接触的终止。此种起始或终止可以基于所述试剂溶液的经过反应区或反应室的移动，特别是上文所述的试剂溶液单元或栓。优选通过使用本发明的不混溶中间流体来进行所述移动。由此，通过控制所述移动，例如流速，或者通过在所述装置的特定区或区域开始、加速、减慢、暂停或停止所述移动，可以控制分子反应，其速度可以被改变，反应产物的量可以被改变等。在本发明具体的实施方案中，所述分子反应的起始以及特别是终止可以基于对反应产物的测量结果来进行。例如，此种基于测量的终止方法可以通过微电流来施行，例如计算机化模块，其与反应状态、反应阶段或反应过程的适宜参数的存在或缺乏相关联。在步骤(C)中用本发明的不混溶中间流体替换存在于所述基材上的试剂溶液。术语"替换"如本文所用是指试剂溶液单元或栓从所述装置的特定区或区域的排出，例如引入到上文所述的装置中。优选地，所述替换可导致所述试剂溶液从装置的反应区的基材排出。另外或者可选地，反应溶液、或任何其它与所述不混溶中间流体不同且不混溶的溶液单元的替换，不仅可以在反应区/在反应室内发生，还可以在该装置的任意其它位点或区域发生，例如在管中，在连接件处，在等待或储存区等。
[0086]在本发明具体的实施方案中，所述替换可以是完全的或基本完全的替换，例如导致99%、99.9%,99.99%或100%的所述试剂溶液或任何其它溶液从所述基材(例如反应区的基材)去除，或者是从该装置的任意其它位点被完全或基本完全替换。在另外的可选的实施方案中，所述替换可以不是完全的或者基本完全的。可以将一定量的先前存在的溶液特别是先前存在的试剂溶液保留在所述基材上，而不进行替换动作。在优选的实施方案中，可以将液体的薄膜，例如试剂溶液的薄膜，或者水薄膜保留在所述基材上，而并不由所述不混溶中间流体替换。在所述替换动作期间，同时，可以将所述试剂溶液或者任意其它溶液或流体的另外的成分保留在所述基材上。
[0087]在本发明另外的优选实施方案中，不混溶中间流体残余或薄膜可不被保留在基材表面或该装置的任意其它区域或位点。因而可通过跟随穿过该装置的某区或区域的试剂溶液单元而实现不混溶中间流体残余的替换。
[0088]本发明所述方法的替换步骤可导致所述试剂溶液以及所述替换不混溶中间流体移动至装置中远离其先前所在区域或部分的区域或部分。可通过本领域技术人员已知的任意适宜手段来进行此种移动，其可使试剂溶液单位或栓以及所述不混溶中间流体转移至装置的不同区，例如等待区、测量区、废物区、储存区、回收和再生区或者回收和再生室等。所述移动可以由适宜的手段来控制和影响，例如阀、门、锁、节点、合流等。可通过机械手段、电子手段或其它任意适宜的手段来进行控制。
[0089]在步骤(d)中，分离所述不混溶中间流体和所述试剂溶液。术语“分离”如本文所用是指对不混溶中间流体单位和试剂溶液单位的混合物所进行的动作。在另外的实施方案中，所述分离还在任何该装置中存在的其它液体或流体单位之间进行。因此，所述分离可导致装置中存在的液体或流体单元的次序或顺序的瓦解，其中本发明所述的不混溶中间流体在试剂溶液或其它溶液之前和/或之后。此分离优选导致相同的或类似的液体或流体单元的收集，例如不混溶中间流体的收集、试剂溶液的收集、特定类型试剂溶液的收集、或者装置中存在的任意其它类型的流体单元的收集。
[0090]在本发明优选的实施方案中，可在收集和再生区进行所述分离。术语“收集和再生区”如本文所用是指对试剂溶液和不混溶中间流体进行捕集或收集的装置的部分、或位于装置之外的元件。通常，此收集和再生区可具有收集和再生室的形式、或者收集和再生容器或盛器的形式。在收集所述试剂溶液和不混溶中间流体之后，可进行分离，例如通过任意适宜的手段，如使用重力、使用离心、电分离措施、电泳分离技术、密度梯度分离等。
[0091]经分离后，可将所述试剂溶液和不混溶中间流体转移回装置中发生上文所述分子反应的区，例如通过收集和再生区经适当定位的出口而引流回反应区，或者通过任意其它适宜的循环技术。
[0092]如本文所述的分离可以使两种或超过两种液体或流体分离，例如两种或更多种不同的不混溶中间流体与试剂溶液之间，或者两种或更多种试剂溶液和其它溶液与不混溶中间流体之间。超过两种的这些流体分离的前提是在上文所述的任意分离手段之后产生不同的相。
[0093]在优选的实施方案中，所述分离是完全的或基本完全的分离。例如，两种或更多种流体之间的分离，特别是本发明的反应溶液和不混溶中间流体之间的分离可以是90%、95%、99%,99.9%,99.99%,99.999%或100%。如果进行了上文所述的分离过程并且在两种或更多种流体相之间留下了不可分离的区，则此不可分离的区可被废弃，或者其可进行其它不同的分离过程，例如，在首先进行重力过程之后通过离心来增强分离等。
[0094]在本发明另外的具体实施方案中，所述试剂溶液和所述不混溶中间体经分离之后，可再生所述试剂溶液和/或所述不混溶中间流体，例如通过调节pH、调节速率、调节成分的浓度等，这是在其被转移回装置中发生上文所述分子反应的区之前，例如例如通过收集和再生区经适当定位的出口而引流回反应区，或者通过任意其它适宜的循环技术。
[0095]在本发明具体的实施方案中，所述分离可跳过收集或回收的步骤而导致所述不混溶中间流体(特别是所述不混溶中间流体单元或栓)与所述试剂溶液(特别是所述试剂溶液单元或栓)、或其它任何溶液或流体栓直接空间分离，使得其可以通过适宜的手段如引流动作等而直接被再利用。例如，可在本发明的装置中，将不混溶中间流体单元或栓、和/或试剂溶液单元或栓的改向、分流或偏转至分离的通道、管或区。
[0096]在步骤(e)中，重利用试剂溶液和/或所述不混溶中间流体。由此，在一个实施方案中，在装置中不混溶中间流体和试剂溶液单元或栓的次序或顺序瓦解之后，例如在装置的通道部分，根据步骤(d)，如上文所述，所述分离的流体单元在本发明要求保护的方法中可被用于第二次或者随后的应用。可以在重利用所述流体单元之前将其再集合起来，或者可以以其现在的形式作为单元进行应用。由于所述不混溶中间流体和所述试剂溶液的不可混溶性，本发明的所述试剂溶液或试剂溶液单元将不会被装置中存在的任何其它流体或液体(例如不同的试剂溶液、或者洗涤或漂洗缓冲液等)所稀释也不会被其弄脏或污染。通常，包含一定量成分的试剂溶液可重利用若干次，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40,50或更多次，例如通过将其引流回装置中发生分子反应的区(例如上文所述的反应区或反应室)。在一些实施方案中，试剂溶液的重利用可取决于一或多种成分的浓度，其可以例如通过装置中特定部分的适当手段来确定。或者，重利用可取决于本发明分子反应的质量和/或速率，例如，如上文所述根据反应产物等的测量所确定的。在另外的实施方案中，可以向反应溶液提供缺乏的成分，例如，可以提高离子、蛋白质例如酶、核苷酸、染料或任何其它化合物的浓度，这是在一定量的时间或一定次数的重利用后、或者在测量了所述成分的浓度后或者测量了反应结果后(如上文所述)。随着适宜性的下降，即成分的浓度下降、分子反应的质量和/或速率的下降，可以废弃所述试剂溶液，例如某试剂溶液单元。此类废弃的单元优选被重新引入的试剂溶液(例如试剂溶液单元)所替代。
[0097]上文所述的不混溶中间流体可以重利用若干次，例如5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、100、150、200或更多次，例如通过将其引流回装置中发生分子反应的区，例如上文所述的反应区或反应室、或者如上文所述在装置中引入所述流体的区。不混溶中间流体的重利用可取决于所述流体的不混溶性质量、其粘度、其密度和其它本领域技术人员已知的适宜参数。可以在反应区中或者装置中其它任何适宜的测量区测量这些参数。随着适宜性的下降，即不混溶性质量的下降、粘度和密度的改变，可以废弃所述不混溶中间流体，例如某些不发挥作用的或者质量降低的不混溶中间流体单元。此类废弃的单元优选被重新引入的不混溶中间流体所替代。
[0098]在本发明具体的实施方案中，可跳过上文所述的步骤(d)并将不混溶中间流体单元之前和/或之后的试剂溶液单元的序列(在其已经穿过反应区或反应室后)以其原次序或以改变的次序(例如通过引入另外的溶液和/或不混溶中间流体的单元)直接引流回所述反应区或反应室。试剂溶液和/或不混溶中间流体可优选如上文所述通过重复方法步骤(a)至(d)而重利用。在本发明可选的实施方案中，重利用可基于这些步骤的亚集的重复，例如可以跳过分离步骤并将流体单元的序列可以直接引流至反应区、或者该装置的任何其它区。
[0099]如上文所述的步骤重复可以进行任意适宜的次数。这可以取决于所要进行的反应的类型和数目、反应溶液中成分的质量和浓度、反应步骤的速率、装置中的流动参数或者本领域技术人员已知的任何其它适宜的参数。例如，所述方法步骤可以重复1、2、3、4、5、6、7、
8、9、10、15、20、30、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、170、180、190、200 或更多次。
[0100]在另外的实施方案中，可将试剂溶液和/或不混溶中间流体收集并储存在装置中、装置的区或室中或者外部的盛器中，而其上固定有化学或生化实体的基材则被替换或修饰。由此，本发明还虑及了重利用所述试剂溶液和不混溶中间流体以用于在超过一种基材或基材类型上进行反应。
[0101]在本发明另一个优选的实施方案中，上文所述的方法还可以包括用洗涤缓冲液洗涤所述基材的步骤。所述基材的洗涤可以用适宜的洗涤缓冲液来进行，例如包含一或多种去污剂、和/或缓冲组分、和/或盐，和/或稳定剂的水性液。例如，洗涤缓冲液可包含TRIS-碱、Tween、甲酰胺、NaCl和稳定剂，具有大约7.0的pH。适宜洗涤缓冲液的另外的实例包括 IOX PBS (0.1M PBS，pH7.4), 20X PBS, (0.2M PBS，pH7.4)，IOX PBS-Tween 20(0.1MPBS,0.5%Tween 20，ρΗ7.4)或 20X PBS-Tween 20 (0.2Μ PBS, l%Tween 20，ρΗ7.4)。另外的洗涤缓冲液及其在特定反应和情形中的应用是本领域技术人员已知的，或者可以得自适当的教科书。[0102]所述洗涤缓冲液优选通过上文所述不混溶中间流体而与上述试剂溶液脱离。由此，在用不混溶中间流体替换试剂溶液单元或者两种或更多种试剂溶液单元(例如上文所述的不同成分或功能的单元)之后，可将洗涤缓冲液引入到装置中并使其穿过或移过所述装置中包含上述基材的区。在本发明特别优选的实施方案中，所述洗涤缓冲液单元之后可跟随有不混溶中间流体，例如另外的不混溶中间流单元。这种跟随的不混溶中间流体单元可继而从所述基材替换所述洗涤缓冲液，例如从位于反应区或反应室的基材替换。所述替换优选可以是完全的或者基本完全的替换。
[0103]在本发明另外的优选实施方案中，可通过上文所述的分离过程而重利用所述洗涤缓冲液。或者，可以废弃所述洗涤缓冲液，例如在上文所述的分离方法或重导向方法之后将其去除。
[0104]在本发明另外的具体实施方案中，可以通过反转(revert)移动方向(即流体单元的移动方向)来增强洗涤缓冲液的活性，反应区中的此种流向的反转可以改善洗涤活性。在本发明另外的具体实施方案中，可以调节洗涤缓冲液的流速(例如为了实现适宜的严格性)，优选与设定一定的温度组合进行。
[0105]在本发明另一个优选的实施方案中，上文所述的方法还可包括测量所述分子反应的状态和结果的步骤。如本文所用，术语“测量所述分子反应的状态和结果”是指测定来自上文所述分子反应的终产物和/或中间产物。例如，可以测量标记的或未标记的分子的存在，溶液中颜色或染料的存在或缺失，PH的改变，核酸、肽、多肽等的浓度，电导或任何其它适宜的参数。此测量可以在上文所述的反应区或室内进行，和/或在本发明装置的特地测量或检测区中进行。测量的位点可以例如取决于反应类型，例如反应是否在基材上固定的实体之内或之上发生导致其可检测的修饰，或者其是否在试剂溶液中发生导致其可检测的修饰。如果所述固定的实体被修饰，可以在原位进行测量，而对于试剂溶液中的分子反应的状态或结果的测量，则可以在反应区或反应室内发生，或者在该装置的任何位点发生，例如在与反应区分离的特定的测量或检测区中。
[0106]可以通过光学手段进行相应的测量。例如，为了检测溶液中或基材处的光学变化、和/或为了确定此种光学变化的质量，可使用CCD照相机或其它适宜的光学设备。可选或者另外地，可使用电气手段来进行相应的测量，例如基于在本发明装置的位点处或区中对导电性、电容(capacity)或离子强度、pH、和/或电泳参数的测定。可以将相应的测量模块连接至集成平台，例如可以对分子反应的阶段、速率或施行进行评估的计算机、计算机化模块或微电子装置。此种集成平台还可装配有适宜的软件或程序，使得可以进行控制活动和评估。此种评估还可用于施行校正步骤，例如速率或流动参数的提高或降低、另外的试剂溶液组分的引入、反应温度的提高或降低、分配给反应步骤的时间段的增加或减少等。
[0107]在本发明特别优选的实施方案中，相应的光学测量可用于在测序反应的情况中检测序列，例如通过发光的颜色或者在某个点反应的存在或缺失。
[0108]在本发明另外的优选实施方案中，上文所述方法中的替换步骤(C)是通过气动流体驱动、螺动传动、活塞和传动膜驱动或者应用定向真空来进行的。
[0109]可以施行气动流体驱动，例如，通过在装置的不同部分使用空气流或气流模块。所述模块可以将空气或气体泵压至装置中。可以在装置的小管或链接部分提供相应的模块和装置区块。优选使用基本上与所述试剂溶液和/或所述不混溶中间流体不混溶的、和/或可以容易地从其中去除的气体化合物。此技术另外的细节和变化是本领域技术人员熟知的或者可以得自适当的教科书。在本发明具体的实施方案中，所述气体化合物可以是或者具有不混溶流体的形式。此处可使用的可选不混溶流体的另外实例包括铁磁流体(ferrofIuid)。
[0110]可以施行蠕动传动，例如，通过在装置中提供柔性的连接件或管道，或者通过将装置设定为具有一或多个柔性的或可移动的侧面或隔片，使得可进行蠕动性移动。可通过任意适宜的手段来进行所述蠕动活动，例如，在所述柔性的管道或隔片上的滚动装置或传动装置，通过以方向相反的方式(contradirectional fashion)组合两种此类管道或隔片,通过在所述管道或隔片上应用液体介导的压力，例如提供直接与本发明的所述管道或隔片接触的充满水的管道，和/或通过使用蠕动泵。此技术另外的细节和变化是本领域技术人员熟知的或者可以得自适当的教科书。
[0111]可以施行活塞和传动膜驱动，例如，通过在装置使用至少一个可移动表面，或者在所述装置的特定区使用至少一个可移动表面，例如反应区或反应室，或者上文所述的混合或储存区。此可移动表面因而可以是柔性膜的形式并且可以用作活塞以降低所述装置内、或所述装置的区内的体积，从而导致所述区或区域外的相邻材料的转移。可移动表面或活塞构件可以与适宜的扩充(expansion)储存器或区组合，使得装置内的流体可以移动。此技术另外的细节和变化是本领域技术人员熟知的或者可以得自适当的教科书。
[0112]可以施行定向真空，例如，通过使用适宜的定向真空泵将空气或液体吸入本发明装置的特定区中，例如吸入扩充储存器或目标储存器，或者吸入特定的方向，从而导致试剂溶液和/或不混溶中间流体单元或栓在装置中的移动。例如，压缩的空气或真空可用于移动与内部的流体接触的膜。此技术另外的细节和变化是本领域技术人员熟知的或者可以得自适当的教科书。
[0113]根据本发明具体的实施方案，可以根据适宜性来调节替换活动的方向、流速以及速率。具体而言，装置可以在所述装置内的不同位置装配有两个或更多个上文所述的移动或驱动模块，使得能够(i)对替换进行良好的调整、和(ii)将替换方向反转。
[0114]在本发明另一个优选的实施方案中，通过使上文所述试剂溶液、或多种试剂溶液、或任意其它溶液例如洗涤缓冲液、和所述不混溶中间流体经重力分离来进行所述分离步骤
(d)。术语“重力分离”如本文所用是指将当前的、未增强的重力应用于试剂溶液、或多种试剂溶液、或任意其它溶液例如洗涤缓冲液，与所述不混溶中间流体的混合物达一定的时间。由于中间流体的特性特别是其不混溶性的特性，重力会导致在特定的区、室或管内产生两个或更多个相。对于一种试剂溶液和一种不混溶中间流体的情况，应用重力可产生两个相的液体或流体，一个相是所述试剂溶液而另一个相是所述不混溶中间流体。如果使用了水性试剂溶液，则上层相可以是试剂溶液相，而下层相可以是不混溶中间流体。
[0115]在优选的实施方案中，可以通过在填充适宜的区、管或盛器后避免扰动来增强所述重力分离。这可以例如通过从任何入口构件移除(例如通过旋转器或移送构件)所述区、管或盛器来施行。通过机械分离不同试剂溶液和不混溶中间流体的组合或其它此类试剂溶液和不混溶中间流体组合的混合物，可实现不同试剂溶液之间的简单区分。相应移除的区、管或盛器随后可再与装置连接，例如在引入端口处或经过入口构件，使得可以有效重利用所分离的流体。[0116]对于重力分离超过两种不同溶液/流体的情况，可以提供或使用超过两个出口构件，例如位于接近相应的相处，使得可以有效重利用所分离的流体。
[0117]难以分离的流体可另外通过增强的重力分离来进行分离，如使用离心力、加热或冷却所述流体、摇动动作或任意其它的适宜动作。
[0118]在本发明另外的具体实施方案中，通过重导向和/或分配上文所述试剂溶液、或多种试剂溶液、或任意其它溶液例如洗涤缓冲液、或所述不混溶中间流体来进行所述分离步骤(d)。术语“重导向和/或分配”如本文所用是指上文所述的流体单元改向至不同的方向例如装置的分支管或区，以及此类单元的相应分配，例如在装置的此类管或通道的网络内分配。可以通过在装置中于特定测量点确定从不混溶中间流体到试剂溶液或其它溶液的转换来施行此动作。随后，在检测了例如不混溶中间流体之后，可使相应的流体单元向分支的管、通道或盛器移动或改向、或者移动或改向至分支的管、通道或盛器内。类似地，在检测了试剂溶液之后，可将相应的流体单元移动或改向至不同的方向，例如向着分支的管、通道或盛器或者进入其内。所述分支的管、通道或盛器中的类似流体单元可重新集结或保持分离，并进一步被转移或弓I导回本发明装置的反应区。
[0119]可以通过颜色、粘度、pH、电特性或其它适宜参数来检测上文所述的流体单元之间的转换。可将传感器或测定模块加至所述装置，例如在分支的管附近。
[0120]在另一方面，本发明涉及用于进行分子反应的装置，包括:(a)反应区，包含其上固定有化学或生化可识别实体的基材；(b)储存器和液体连接件，使试剂溶液、不混溶中间流体以及任选存在的洗涤缓冲液能通过所述反应区，其中所述不混溶中间流体能够从所述反应区替换所述试剂溶液；和(C)收集和再生区，其中所述不混溶中间流体和所述试剂溶液可由重力分离来分离，使得能通过将所分离的液体引导回所述反应区而再利用所述不混溶中间流体和所述试剂溶液。
[0121]所述装置可优选包含如上文所述的反应区，其包含如上文所述的化学或生化可识别实体(根据本文所述的技术固定)。
[0122]所述装置还可包含储存器，例如扩充区或导管或者引入导管或区，其使得流体单元在装置内移动，例如通过上述的转移技术之一。所述储存器可以具有任意适宜的形式或大小，以及可以包含至少一个入口和一个出口、或者超过一个入口和一个出口、或者超过一个出口和一个出口。所述储存器可以是开放的或者是用所述装置封闭。装置中可以存在一个或多个储存器，例如置于不同的位置使得流体可以移动等。
[0123]如本文所用，液体连接件可以是任意适宜的的大小、直径、或形式。例如，液体连接件可以是毛细管。或者，其可以具有更大的大小。液体连接件并不必然需要持久地充满液体，还可以载入气体容纳物，例如如果要进行气动替换措施。
[0124]可以存在如上文所述的收集和再生区。此区优选以收集和再生容器、导管、室或盛器的形式提供。所述收集和再生区可适宜于容纳来自液体连接件、或者来自本发明装置的不同区的一或多个流体单元，例如是由上文所述的移动技术所驱动。本发明此方面的收集和再生区被设计为使得如上文所述的一或多种试剂溶液和不混溶中间流体的流体单元可以经重力分离。因此，在具体的实施方案中，所述收集和再生区可经设计以避免填充之后的扰动，例如是通过提供转动机制以将所述区从装置或者从入口移除、通过提供入口连接的移除机制(例如移至另外的收集和再生区)、和/或通过提供停止或暂停机制以使收集和再生区的填充停住直至重力分离和/或重利用步骤已发生(例如使填充过程停住lOsec、30sec、lmin、2min、5min、10min、20min 等。
[0125]所述收集和再生区可以可选地或者另外地装配有使得上文所述经增强的分离可以进行的元件，例如使得可以应用离心力的元件、冷却或加热元件、摇动或混合模块等。这些另外的模块可依据收集和再生区中液体的分离状态而启动。
[0126]在本发明另外的优选实施方案中，所述收集和再生区包含与上文所述反应区连接的一个入口以及分别与用于试剂溶液的储存器和用于不混溶中间流体的储存器相连的两个出口。术语“与反应区相连的入口”如本文所用是指如上文所述的反应区与收集和再生区之间的直接或间接液体连接件。此连接件可以通过管、通道、毛细通道、桥联、或其它任何适宜的连接元件来实现。其也可以是反应区与收集和再生区之间可以关闭的直接连接件，例如是通过门或锁来关闭。术语“与用于试剂溶液的储存器相连的出口”如本文所用是指如上文所述的收集和再生区与仅含有试剂溶液(优选仅含有一种类型的试剂溶液或者给定的组分)的储存器之间的直接或间接液体连接件。此连接件可以通过管、通道、毛细通道、桥联、或其它任何适宜的连接元件来实现。在一些实施方案中，收集和再生区可以与超过一个用于试剂溶液的储存器连接，或者可以与装置中使用的每种试剂溶液的一个储存器连接。术语“与用于不混溶中间流体的储存器连接的出口”如本文所用是指上文所述的收集和再生区，与仅含有本发明不混溶中间流体的另外的储存器之间的直接或间接液体连接件。此连接件可以通过管、通道、毛细通道、桥联、或其它任何适宜的连接元件来实现。
[0127]用于试剂溶液的和用于不混溶中间流体的储存器可以与装置的反应区连接而使得可以重引导和重利用各自的流体，或者与装置的任何其它区或区域连接，例如与如上文所述的引入区。
[0128]在本发明另一个实施方案中，用于试剂溶液的和用于不混溶中间流体的所述储存器或多个储存器是可以从所述装置移除的，例如使得可以在外部的位置储存如冰箱或冷却设施。此种可移除性可以通过在入口和/或出口区块存在的门控(gating)和锁控(locking)元件来实现。从本发明的装置移除储存器的可能性进一步提高了反应溶液(例如含有贵重的酶或其它组分)的重利用性，这是通过在不同的装置中或在不同的时间点(例如在储存期之后)提供进一步的使用。或者，可移除储存器还可以用于在使用前储存反应溶液(例如含有贵重的酶或其它组分)。在具体的实施方案中，锁控也可以是持久性的。如上文所述的入口构件可以这样的方式设计，其使得可以有效引入流体单元，这例如是通过使其位于收集和再生区的顶端。出口构件因而可可以这样的方式设计，其使得试剂溶液和不混溶中间流体可以有效撤离。例如，出口可以位于收集和再生区的下半部和上半部、三分之一处(third)或四分之一(quarter)处。或者，入口可以是根据收集和再生区中液体的量而可移动的重定位的。或者，收集和再生区可包括超过一个出口构件，其优选是可以关闭的，并且可以根据液体的量以及试剂溶液相和不混溶中间流体相的位置来使用。
[0129]入口和出口构件可以进一步装配有适宜的驱动元件例如泵，或者装配有适宜的封闭实体如门、锁，或者装配有分支小管等。
[0130]在本发明另外的具体实施方案中，收集和再生区可以与装置的所述反应区或引入区直接连接，例如使所述试剂溶液和所述不混溶中间流体可以直接循环(例如通过直接的液体连接件)。[0131]在本发明另外的实施方案中，还可以将洗涤缓冲液与所述不混溶中间流体和/或试剂溶液分离，只要所述洗涤缓冲液不与所述试剂混溶。如果在装置中使用洗涤缓冲液，则可提供收集和再生区使得所述洗涤缓冲液和本文所述的不混溶中间流体可以经重力分离。相应的收集和再生区因而可以装配有与装置的反应区或其它区相连的入口，以及用于经使用的洗涤缓冲液的出口(导向废弃物模块)和用于不混溶中间流体的出口(导向储存器或直接引导回其它装置区例如本文所述的反应区)。或者，所述洗涤缓冲液还可以被再利用并因而可以被转移至储存器和/或直接转移回装置的其它区，特别是如上文所述的反应区。对于重利用洗涤缓冲液，所述装置可以提供过滤或消毒模块。
[0132]在另一方面，本发明涉及用于进行分子反应的另外的装置，包括:(a)反应区，包含其上固定有化学或生化可识别实体的基材；(b)储存器和液体连接件，使试剂溶液、不混溶中间流体以及任选存在的洗涤缓冲液能通过所述反应区，其中所述不混溶中间流体能够从所述反应区替换所述试剂溶液；和(C)重导向和分配模块，其中检测从所述不混溶中间流体至所述试剂溶液的转换并分离所述流体和溶液，使得能通过将所分离的液体引导回所述反应区而再利用所述不混溶中间流体和所述试剂溶液。反应区(a)以及储存器和液体连接件(b)已在上文有描述。
[0133]本文所述的“重导向和分配模块”是指将上文所述流体单元改向或重导向至不同方向的技术实体，如改向或重导向至装置的分支管或区(例如连接至本文所述的装置的反应区)，其中反应溶液单元被改向至一个特定方向，而不混溶中间流体单元被改向至另一个特定方向(不同于所述反应溶液单元所改向的方向)。类似地，可以对不同类型的试剂溶液进行差异性改向。可以通过上文所述的移动或驱动技术来进行相应的改向，例如气动驱动、活塞驱动、或应用定向真空、使用一或多个阀。有效改向的前提是检测不相同的流体单元之间的转换。流体单元之间的转换可以如上文所述进行检测，例如通过用适宜的传感器、照相机或其它本领域已知的技术实体来确定颜色、pH、电性质或其它适宜参数中的差异。此类技术实体优选与所述改向模块连接，例如通过微电子流或者计算机化的评估模块，其上的例如可以在装置中自动或半自动地分配流体单元。也可在装置的其它区域(例如在分支管附近)提供另外的传感器或测定模块。
[0134]在本发明具体的实施方案中，所述重导向和分配模块可包含包含与反应区连接的一个入口以及分别与用于试剂溶液的储存器和用于不混溶中间流体的储存器相连的两个出口。术语“与反应区相连的入口 ”如本文所用是指如上文所述的反应区与重导向和分配模块之间的直接或间接液体连接件。此连接件可以通过管、通道、毛细通道、桥联、或其它任何适宜的连接元件来实现。其也可以是反应区与重导向和分配模块之间可以关闭的直接连接件，例如是通过门或锁来关闭。术语“与用于试剂溶液的储存器相连的出口”如本文所用是指如上文所述的重导向和分配模块与仅含有试剂溶液(优选仅含有一种类型的试剂溶液或者给定的组分)的储存器之间的直接或间接液体连接件。此连接件可以通过管、通道、毛细通道、桥联、或其它任何适宜的连接元件来实现。在一些实施方案中，重导向和分配模块可以与超过一个用于试剂溶液的储存器连接，或者可以与装置中使用的每种试剂溶液的一个储存器连接。术语“与用于不混溶中间流体的储存器连接的出口 ”如本文所用是指上文所述的重导向和分配模块与仅含有本发明不混溶中间流体的另外的储存器之间的直接或间接液体连接件。此连接件可以通过管、通道、毛细通道、桥联、或其它任何适宜的连接元件来实现。用于试剂溶液的和用于不混溶中间流体的储存器可以与装置的反应区连接而使得可以重引导和重利用各自的流体，或者与装置的任何其它区或区域连接，例如与如上文所述的引入区。在本发明另一个实施方案中，用于试剂溶液的和用于不混溶中间流体的所述储存器或多个储存器是可以如上文所述从装置移除的。
[0135]在本发明另外的具体实施方案中，重导向和分配模块可以与装置的所述反应区或引入区直接连接，例如使所述试剂溶液和所述不混溶中间流体可以直接循环(例如通过直接的液体连接件)。
[0136]在本发明另外的实施方案中，还可以将洗涤缓冲液与所述不混溶中间流体和/或试剂溶液分离，只要所述洗涤缓冲液不与所述试剂混溶。如果在装置中使用洗涤缓冲液，则可提供重导向和分配模块使得本文所述的洗涤缓冲液和不混溶中间流体可以重导向。因而相应的重导向和分配模块可装配有与装置的反应区或其它区相连的入口，以及用于经使用的洗涤缓冲液的出口(导向废弃物模块)和用于不混溶中间流体的出口(导向储存器或直接引导回其它装置区例如本文所述的反应区)。或者，所述洗涤缓冲液还可以被再利用并因而可以被转移至储存器和/或直接转移回装置的其它区，特别是如上文所述的反应区。对于重利用洗涤缓冲液，所述装置可以提供过滤或消毒模块。
[0137]在本发明另外的实施方案中，可以在重复使用之后进行试剂溶液中组分的再生。另外，可以测定所述试剂溶液中试剂的质量，例如在原位、或者在装置的外部测定区块中进行。
[0138]在本发明另外的优选实施方案中，上文所述的、或者在本发明方法的背景中所提到的装置是微观流体装置。术语“微观流体装置”如本文所用是指可以对约束在小尺度、优选亚毫米尺度的流体进行精确控制和操作的装置。通常，微观流体装置执行小的体积，例如在nl、pi或fl的范围，和/或其可执行小的总大小。另外，本发明的微观流体装置可消耗较低量的能量。在微观流体装置中，可以实现如下效果，诸如层流、比表面张力、电湿润(electrowetting)、快速热弛豫、存在电表面电荷(electrical surface charge)以及扩散作用，和/或可以将所述效果用于进行本发明的方法。在一些实施方案中，微观流体装置可以与外部来源或外部元件连接，例如对于重利用目的的分离或储存或导管是可能的。另外，所述微观流体装置可包含电子或计算机界面，使得可以控制和操作装置中的活动、和/或可以检测或测定反应结果或产物。
[0139]在本发明另外的具体实施方案中，所述微观流体装置可以是集成微观流体盒(integrated microfluidic cartridge)。术语“集成微观流体盒”如本文所用是指使微观流体紧凑和调整其大小，例如用室或容器样的形式包含所有必须的连接件、区、及任选存在的组分。所述盒可以例如是完全封闭的，或者是部分封闭的使得可以通过可再密封的入口引入样品、组分等。所述盒还可以装配有用于扫描或者检测装置的比对构件(alignmentstructure),例如扫描仪的识别部分、指示所提供的组分的条形码或矩阵码(matrixcode)、生产日期等；或者装配有检测单元的界面使得可以对如上文所述的反应结果进行电子或光学测定。在另外的优选实施方案中，所述盒可包含已装载的试剂溶液和/或不混溶中间流体，例如用于临床应用的一次性使用的目的，使得可以避免交污染。
[0140]在本发明另外的特别优选的实施方案中，以本发明的方法和装置为背景的如上文所述的分子反应是测序反应或核酸合成反应。[0141]术语“测序反应”如本文所用是指在确定序列的方法中使用的一或多种反应。此类确定序列的方法是本领域技术人员已知的。这些方法包括下一代测序方法或高通量测序方法，例如，焦磷酸测序，其基于Roche提供的用于454 Genome Sequencer的技术。此方法在位于油溶液中的小水滴内部扩增DNA，其中每个小水滴含有附着至单一引物包被的珠的单个DNA模板，其继而形成克隆群落。焦磷酸测序使用荧光素酶以产生光用于检测加至初始DNA的个体核苷酸,而经组合的数据则用于产生序列读出结果。另一个实例是Illumina或Solexa测序的方法学，其基于可逆染料_终止剂。DNA分子通常附着至载玻片上的引物并被扩增，从而形成局部的克隆群落。随后，一次可添加一种类型的核苷酸，而未并入的核苷酸则被洗掉。随后，可以获得经荧光标记的核苷酸的图像并将染料从DNA化学去除，使得可以进行下个循环。另外的实例是Applied Biosystems的SOLiD技术,其利用连接测序。此方法是基于使用所有可能的给定长度寡核苷酸的汇集，所述寡核苷酸根据所测序的位置进行标记。将这些寡核苷酸复性并连接。随后，由DNA连接酶对匹配的序列进行的优先连接通常得到信号，所述信号提供在该位置的核苷酸的信息。由于DNA通常是由乳化PCR所扩增，则所得的珠(每个仅含有相同DNA分子的拷贝)可以被沉积在载玻片上而得到了具有与Illumina测序相当的质量和长度的序列。还有另外的实例是Helicos的Heliscope技术，其中通过拴定至阵列的PolyT寡聚物来捕获片段。在每个测序循环，添加聚合酶和单一荧光标记的核苷酸并对阵列成像。荧光标签随后被去除并重复该循环。本发明所涵盖的测序技术的另外的实例有微观流体Sanger测序，和基于微芯片的测序方法。本发明还虑及了这些技术的进一步开发，例如序列测定准确性、或者测定生物体基因组序列所需的时间等的进一步改善。这些测序方法可以在目前提供的方法学内进行调整，以使得由于可在反应进行期间提高酶和/或寡聚物和/或核苷酸的量，从而可以高度提高读取长度和降低成本。所述方法的进一步改变以及细节是本领域技术人员熟知的，并且可以得自适宜的出版物例如 Metzger, 2010, Nature Reviews, Genetics, Vol 11。
[0142]术语“核酸合成反应”如本文所用是指在基材上直接产生寡核苷酸序列的方法，例如以阵列的形式。典型的方法可以例如包括，在硅石基材上的光刻法合成(photolithographic synthesis),其中使用光以及光敏感遮蔽剂以便一次一个核苷酸地生成序列。在提供单一核苷酸的溶液前，将每个可应用的探针选择性地去遮蔽(unmask)，继而发生遮蔽反应并将下一组探针去遮蔽以为了不同的核苷酸暴露作准备。若干次重复后，完整构建所涉及的探针的序列。因而，所构建的寡核苷酸依据所期望的目的可以更长(例如60-聚体)或更短(例如25-聚体)。所述方法的进一步改变以及细节是本领域技术人员熟知的，并且可以得自适宜的出版物例如Pease等，1994，PNAS 91:5022 - 5026。
[0143]在另一方面，本发明涉及本文所定义的不混溶中间流体的用途，其用于用于从上文所述的微观流体装置中的反应区基材替换所述反应区中存在的试剂溶液、或者洗涤溶液或缓冲液。优选所述试剂溶液或洗涤溶液或缓冲液的替换可以是完全的或基本完全的替换，例如导致99%、99.9%,99.99%或100%的试剂溶液或任意其它容易从反应区基材去除。
[0144]在本发明优选的实施方案中，本文所定义的所述不混溶中间流体可以用于从反应区替换试剂溶液、或者洗涤溶液或缓冲液，其中所述反应区包含具有化学或生化可识别实体的基材。
[0145]在本发明更优选的实施方案中，如本文所定义的所述不混溶中间流体可以用于通过从所述反应区基材替换试剂溶液、或者洗涤溶液或缓冲液，从而使所述化学或生化可识别单元具有活性或反应性。术语“使……具有活性或反应性”如本文所用是指去除所述基材之中或之上的化学或生化实体上任何结合的或湿润的实体。所述基材因而可以经清洁去除废弃产物、结合的实体、缓冲成分、酶底物等。
[0146]在本发明另一特别优选的实施方案中，所述化学或生化可识别实体是核酸，肽，多肽，碳水化合物，或其修饰的形式，或者是核酸，肽，多肽，碳水化合物，或其修饰的形式的阵列，或者其任意组合。
[0147]术语“核酸”如本文所用是指任意本领域技术人员已知的核酸，优选是指DNA、RNA、PNA、CNA、HNA、LNA或ANA。DNA可以是例如A_DNA、B_DNA或Z-DNA的形式。RNA可以例如是P-RNA即批喃糖基-RNA(pyranosysl-RNA)、或者经结构修饰的形式如发夹RNA或颈环RNA的形式。术语“PNA”涉及肽核酸，即人工合成的类似于DNA或RNA的聚合物，其用于生物学研究和医学治疗，但是其未知是可自然发生的。PNA骨架通常由重复的N-(2-氨乙基)-甘氨酸单元(由肽键连接)所组成。各种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基键连接至所述骨架。PNA—般像肽一样进行描述，N-端在前面(左边)的位置而C-端在右边。术语“CNA”涉及氨基环己基乙烷酸核酸。另外，该术语涉及环戊烷核酸，即包含例如2'-脱氧氨基甲酸鸟苷酸的核酸分子。
[0148]术语“HNA”涉及己糖醇核酸，即由标准的核碱基和磷酸化的1，5-脱水己糖醇骨架所构建的DNA类似物。术语“LNA”涉及锁定的核酸。通常，锁定的核酸是经修饰并因而不可接近的RNA分子。可以用连接2'和4'碳的额外桥联来修饰核苷酸的核糖部分。此桥联将核糖锁定在3'-内结构构象。所述锁定的核糖构象增强碱基堆积和骨架预组织。这可显著地提高热稳定性，也即寡核苷酸的解链温度。术语“AM”涉及阿拉伯糖核酸或其衍生物。本发明北京中，优选的ANA衍生物是2，-脱氧-2'-氟-β -D-拉伯糖核苷(2，F-ANA)。在另外的实施方案中，核酸分子可以包含任意的DNA、RNA、PNA、CAN、HNA、LNA和ANA的组合。在另外的实施方案中，上文所定义的核酸分子可以是短寡核苷酸、长寡核苷酸或多核苷酸的形式。
[0149]以本发明为背景的术语“肽”是指包含超过一个氨基酸的任意类型的氨基酸序列，特别是长达40或50个氨基酸的短序列。在一些实施方案中，该术语还指蛋白结构或其功能性衍生物。另外，肽可以与另外的化学部分或官能性组合。
[0150]如本文所用，术语“多肽”是指中等或长的氨基酸序列，优选包含40或50个氨基酸。在一些实施方案中，该术语还指蛋白结构或其功能性衍生物。另外，多肽可以与另外的化学部分或官能性组合。
[0151]如本文所用，术语“碳水化合物”是指具有经验式Cm(H2O)n的有机化合物，也即仅由碳、氢和痒所组成，具有2:1的碳:氢原子比`。该类包括单糖、二糖、寡糖、和多糖。优选提到的是糖，即单糖和二糖。
[0152]本发明的多肽、蛋白质或肽的“修饰”可以是乙酰化，聚乙二醇化，羟乙基淀粉化，甲酰化，磷酸化，酰胺化，用已知的保护/封闭基团衍生化，特定的化学切割，蛋白水解切害I]，连至细胞配体或其它已知蛋白或者高氨基酸聚合物化(即融合至富含甘氨酸的高氨基酸聚合物(HAP))等。可以用本领域技术人员已知的适宜技术来进行此类修饰。另外，所述多肽、肽或变体可含有一或多种非典型氨基酸。[0153]“阵列”如本文所用是指用于阵列中捕获分子和周围环境中潜在作用物(例如如上文所述的介质)之间相互作用的有序排列。阵列可以包括任意二维和三维排列的可接近区域，优选是二维排列。阵列可以包括核酸，例如寡核苷酸、肽/多肽实体、碳水化合物、或者这些的混合物或组合。
[0154]在本发明优选的实施方案中，所述不混溶中间流体包含氟化烃。在本发明另外的优选实施方案中，所述不混溶中间流体由氟化烃组成。在本发明另一个优选的实施方案中，所述不混溶中间流体包含全氟化烃。在本发明另一个优选的实施方案中所述不混溶中，间流体由全氟化烃组成。在本发明另一个优选的实施方案中，所述不混溶中间流体包含氟化硅酮。在本发明另一个优选的实施方案中，所述不混溶中间流体由氟化硅酮组成。在本发明另一个优选的实施方案中，所述不混溶中间流体包含全氟化硅酮。在本发明另一个优选的实施方案中，所述不混溶中间流体由全氟化硅酮组成。在本发明另一个优选的实施方案中，所述不混溶中间流体包含氟化的饱和烃。在本发明另一个优选的实施方案中，所述不混溶中间流体由氟化的饱和烃组成。在本发明另一个优选的实施方案中，所述不混溶中间流体包含全氟化的饱和烃。在本发明另一个优选的实施方案中，不混溶中间流体由全氟化的饱和烃组成。
[0155]在本发明的一些实施方案中，所述不混溶中间流体包含上述烃的组合或者由上述烃的组合组成。
[0156]术语“烃”如本文所用是指主要由氢和碳所组成的分子。该类包括烃基、芳香族烃(芳烃)、烷、烯、环烷和基于炔的化合物。优选该术语涉及烷如丁烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷等，或者涉及烯如戊烯、己烯、庚烯、辛烯、壬烯、癸烯等。在本发明的一些实施方案中，烃类还包括杂原子特别是氮，或者烃类可以另外含有官能团特别是胺基。
[0157]术语“硅酮(silicone) ”如本文所用是指聚合的硅氧烷(siloxane)或聚硅氧烷，即混合的无机-有机聚合物，具有通式[R2SiO]n，其中R是有机基团如甲基、乙基或苯基。
[0158]本发明的“氟化烃”或“氟化硅酮”是其中一个或多个但却不是全部的氢被氟原子取代的烃或者硅。优选取得或使用具有高氟化度的烃和/或硅酮，以提供亲水性和疏水性物质的低溶解。
[0159]本发明的“全氟化烃”或“全氟化硅酮”是其中所有氢原子都被氟原子取代的烃或硅酮分子。
[0160]在本发明另外的优选实施方案中，所述不混溶中间流体具有低于大约0.1Pa.s的粘度，高于大约1100kg/l的密度，高于大约50°C的沸点和低于大约1%的水溶性。
[0161]在本发明的一些实施方案中，疏水不混溶中间流体可以例如具有大约0.09Pa.S、
0.08Pa.s、0.07Pa.s、0.06Pa.s、0.05Pa.s、0.04Pa.s、0.03Pa.s、0.02Pa.s、0.0lPa.s 等的粘度和超过大约1100kg/l的密度，高于大约50°C的沸点和低于大约1%的水溶性。
[0162]在本发明另外的实施方案中，所述不混溶中间流体可以，例如，具有大约1200kg/
1、1300kg/l、1400kg/l、1500kg/l、1750kg/l、2000kg/l、2500kg/l等的密度以及低于大约0.1Pa.s的粘度，高于大约50°C的沸点和低于大约1%的水溶性.[0163]在本发明另外的实施方案中，所述不混溶中间流体可以，例如，具有大约60°C、7o°c、8o°c、9o°c、io(rc、ii(rc、i2(rc、i3(rc、i4(rc、i5(rc 或更高的沸点，以及低于大约0.1Pa.s的粘度，高于大约1100kg/l的密度，和低于大约1%的水溶性。[0164]在本发明另外的实施方案中，疏水不混溶中间流体可以例如，具有大约0.9%、
0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1% 或更低的水溶性或低于大约 0.1Pa.s 的粘度，超过大约1100kg/l的密度，和高于大约50°C的沸点。
[0165]在本发明另外的实施方案中，疏水不混溶中间流体可以例如具有，大约0.09Pa.S、
0.08Pa.s、0.07Pa.s、0.06Pa.s、0.05Pa.s、0.04Pa.s、0.03Pa.s、0.02Pa.s、或 0.0lPa.s 等的粘度；和大约 1200kg/l、1300kg/l、1400kg/l、1500kg/l、1750kg/l、2000kg/l、或 2500kg/
I等的密度；和大约 6o°c、7o°c、8o°c、9(rc、io(rc、ii(rc、i2(rc、i3(rc、i4(rc、i5(rc 或更高的沸点；和大约 0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1% 或更低的水溶性。
[0166]可以根据本领域技术人员已知的适宜的测定法和过程来测试和测定上述参数和/或流体的不混溶性。本发明因此虑及了落入上文所提供的参数组之内并且不混溶的流体，例如提供适宜的测试或测定法测定。
[0167]在本发明另一个优选的实施方案中，所述不混溶中间流体是FluorinertElectronic Liquid FC-40。该术语特别是指图3所示的化合物,并且还进一步具有如下特性:⑴表观:清晰、无色，(ii)平均分子量:650沸点(Iatm):165°C ； (iv)流动点:_57V ; (V)计算的临界温度:543K ； (vi)估算的临界压:1.18x10?帕斯卡；(vii)蒸汽压:287帕斯卡；(vii)汽化潜热(正常沸点):69J/g ； (vii)液态密度:1855kg/m3 ； (viii)运动粘度:2.2厘沱；(ix)绝对粘度:4.1厘泊；(X)液态比热:1100J kg-1℃ ―1 ； (xi)液态导热性:0.065---1。。-S(xii)膨胀系数:0.0012。。-S(Xiii)折射指数:1.290 ； (xiii)水溶性 <7ppmw ； (xiv)水中溶解度:〈5 ；ppmw ； (xv)电介质强度:46kV,0.1〃 间隔(gap) ； (xvi)电介质常数:1.9 ;和(xvii)电阻率(ASTM D-257):4.0xl015ohm cm
[0168]在本发明另外的具体实施方案中，FC-40可以与一或多种其它不混溶中间流体组合，例如上文所述的一或多种不混溶中间流体。
[0169]在另外的优选实施方案中，本发明涉及上文所述装置用于进行测序反应或核酸合成反应的用途。以本发明用途权利要求为背景的测序反应应当被理解为上文所定义的测序反应、或者本领域技术人员所知道的测序反应。以本发明用途权利要求为背景的核酸合成反应应当被理解为上文所定义的核酸合成反应、或者本领域技术人员所知道的核酸合成反应。还虑及了上文所定义的装置用于进行上文所述分子反应、或本领域技术人员所知的分子反应的用途。
[0170]提供如下的实施例和附图用于说明目的。因而，应理解实施例和附图不应被认为是限定。本领域技术人员显然能够设想出本文所述原理的另外的修改。
实施例
[0171]实施例1 - FC-40对杂交信号的作用
[0172]为测试FC-40对杂交信号的作用，以InM的浓度对两个不同的探针即PCR12和PCR5进行杂交。
[0173]PCR产物12包含114碱基对并且是人类染色体的部分，2011年3月15号的登录号是N0.NCBI36:12:111399702:111400602:1 ;序列报道如下(SEQ ID NO:1)，对捕获探针的特异性结合区域加有下划线:
[0174]AGTTACATTGCCACACAAGGCTGCCTGCMAACACGGTGAATGACTTTTGGCGGATGGTGTTCCAAGAAAACTCCCGAGTGATTGTCATGACAACGAAAGAAGTGGAGAGAGGA(SEQ ID NO:1)
[0175]PCR产物5包含108碱基对并且是人类染色体的部分，2011年3月15号的登录号是 N0.NCBI36:5:127637813:127638713:1 ;序列报道如下(SEQID NO: 2)，对捕获探针的特异性结合区域加有下划线:
[0176]ACCAGGTGGACATTTACAGGTAAACCCCCCCAGGGTGTTGACACAGAGGAACTGGCAGTTATGCTGCTTTGTTTGACATTCATCAAGGTCTGAAATTAGAGAGAAGCC(SEQ ID NO:2)
[0177]合成PCR产物并用Atto770 (Biolegio)荧光标记。长度均为76个核苷酸(Biolegio)的两种类型的合成寡核苷酸分别被用作PCR12和PCR5的捕获探针:
[0178]捕获探针12:
[0179]GGAGTTTTCTTGGAACACCATCCGCCAAAAGTCATTCAC CGTGTTTTGCAGGCAGCCTT(SEQ IDNO:3).[0180]捕获探针5:
[0181]CTTGATGAATGTCAAACAAAGCAGCATAACTGCCAGTTCCTCTGTGTCAACACCCTGGGG(SEQ IDNO:4).[0182]将寡核苷酸以6 μ M的浓度溶解至含1.5Μ甜菜碱的PBS中，在洁净间设施内按排喷墨印压至氨基硅烷载玻片(Genorama SA载玻片)上，并UV光交联；每个点由300pL的溶液所产生。
[0183]将由Atto700荧光标记的参照点溶解至含有以2 μ M的浓度溶解至含1.5Μ甜菜碱的PBS中，并按平行的排压印。
[0184]为了流过用PCR 12和PCR 5进行的杂交测试，在压印区上构建具有入口、出口、和U型微通道的微观流体构件(宽1.2mm,总长50mm，高100 μ m)。通过注射泵的手段经入口将杂交溶液注射至微通道中。
[0185]将PCR 12和PCR 5以InM的浓度溶解在杂交缓冲液中(3x SSC w0.11%SDS)，于95°C变性10分钟，在冰上冷却并通过注射泵的手段以6 μ 1/min注射至微观流体构件中。将该流保持恒定30分钟。
[0186]将该体系保持在热盘上以确保杂交期间微通道内部54°C的温度。
[0187]在54°C流过杂交30分钟后，将流体从微通道移除，并用共焦扫描仪分析该区域，以检测经标记PCR产物的结合。
[0188]为评估FC-40对杂交过程的惰性，以如下条件进行三个平行试验措施:
[0189]l)FC-40流过进行5分钟，室温，以6 μ 1/min流过+PCR12和PCR5的杂交如前所述；
[0190]2) FC-40流过进行5分钟，以6 μ 1/min流过+洗涤缓冲液(lx SSC w0.2%SDS)进行5分钟，室温，以6 μ 1/min流过+PCR12和PCR5的杂交如前所述；和
[0191]3)PCR12和PCR5的杂交如前所述，未接触FC-40。
[0192]由图4，部分1、2和3(相应于试验部分1)、2)和3)，如前)可知，与FC-40的接触对杂交信号无影响。
[0193]由图4，部分1、2和3(相应于试验部分1)、2)和3)，如前)可知，与FC-40的接触对杂交信号无影响。
[0194]实施例2 - FC-40对酶末端修复PRC反应的作用[0195]为测试FC-40对酶末端修复PRC反应的作用，用Cp40am(具有氨基官能性的合成寡核苷酸，58个核苷酸长(Biolegio))进行杂交。Cp40am的序列报道如下(SEQ ID NO: 5):
[0196]Cp40am:
[0197]AGTCCTCACCCAAGCGCACGTTTTCGATTAGCTGCCCAAGTCTTCAATGCATCTTACC(SEQ IDNO:5)
[0198]将Cp40am溶解至具有1.5M甜菜碱的PBS中，并作为捕获探针压印至Nexterion载玻片P(Schott),如数据表所推荐那样。将16-孔上层构件(superstructure) (Schott)应用于所压印的载玻片。
[0199]将As40+4(具有4个突出核苷酸的互补探针(GCTA-))溶解于杂交缓冲液(3x SSCw0.1%SDS)至IOnM ;将50 μ I的杂交溶液引入孔中。于50°C进行杂交30分钟。
[0200]在洗涤缓冲液(lx SSC w0.2%SDS)中洗涤之后，以Klenow聚合酶在NEB缓冲液中(w0.1%BSA)用核苷酸mic dNTP-C*来进行末端修复反应，其中C核苷酸经Cy5标记；将dNTP-C*混合物稀释至300nM的浓度。此溶液作为参照溶液(参见图5 ;〃Ref〃)。
[0201]为了测试FC-40对末端修复反应的影响，根据如下比例将渐增量的FC-40加至聚合酶溶液:1:1000、1:100、1:10、1:5。
[0202]将50 μ I的每种溶液应用于不同的孔并在37°C进行末端修复反应30分钟。
[0203]由图5，第3栏可知，达到1:100 (v/v)的微量的FC-40在末端修复步骤期间不影响Klenow聚合酶的活性。令人吃惊的是，更高浓度的FC-40 (第I和第2栏)表现出提高聚合酶反应的产率。
【权利要求】
1.用于在装置中进行分子反应的方法，包括如下步骤: (a)将一或多种试剂溶液和不混溶中间流体引入所述装置中，其中所述装置包含基材，所述基材上固定有化学或生化可识别实体； (b)在所述固定的化学或生化可识别实体与所述试剂溶液之间进行分子反应；或者在存在所述试剂溶液时在所述固定的化学或生化可识别实体上进行分子反应； (c)用所述不混溶中间流体替换存在于所述基材上的试剂溶液； (d)分离所述不混溶中间流体和所述试剂溶液，优选在收集和再生区进行；和 (e)重利用所述试剂溶液和/或不混溶中间流体进行一或多次步骤(a)至(e)的重复。
2.权利要求1的方法，还包括用洗涤缓冲液洗涤所述基材的步骤，其中通过所述不混溶中间流体将所述洗涤缓冲液与所述试剂溶液分开。
3.权利要求1或2的方法，还包括测量所述分子反应的状态或结果的步骤，优选通过光学和/或电手段进行。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述替换步骤(c)通过气动流体驱动、蠕动传动、活塞和传动膜驱动、或应用定向真空来进行。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述分离步骤(d)通过使所述试剂溶液和所述不混溶中间流体经重力分离进行。
6.用于进行分子反应的装置，包括: (a)包含基材的反应区，所述基`材上固定有化学或生化可识别实体； (b)储存器和液体连接件，其使得试剂溶液、不混溶中间流体以及任选地存在的洗涤缓冲液能通过所述反应区，其中所述不混溶中间流体能够从所述反应区替换所述试剂溶液；和 (C)收集和再生区，其中所述不混溶中间流体和所述试剂溶液可由重力分离来分离，使得能通过将所分离的液体引导回所述反应区而再利用所述不混溶中间流体和所述试剂溶液，其中所述收集和再生区任选地包含一个与反应区连接的入口和两个分别与试剂溶液的储存器和不混溶中间流体的储存器连接的出口。
7.用于进行分子反应的装置，包括: (a)反应区，包含其上固定有化学或生化可识别实体的基材； (b)储存器和液体连接件，其使得试剂溶液、不混溶中间流体以及任选地存在的洗涤缓冲液能通过所述反应区，其中所述不混溶中间流体能够从所述反应区替换所述试剂溶液；和 (C)重导向和分配模块，其中检测从所述不混溶中间流体至所述试剂溶液的转换并分离所述流体和溶液，使得能通过将所分离的液体引导回所述反应区而再利用所述不混溶中间流体和所述试剂溶液，其中所述重导向和分配模块任选地包含一个与反应区连接的入口和两个分别与试剂溶液的储存器和不混溶中间流体的储存器连接的出口。
8.权利要求1-5任一项的方法或者权利要求6或7的装置，其中所述装置是微观流体装置，优选集成微观流体盒。
9.权利要求1-5或8任一项的方法或者权利要求6-8任一项的装置，其中所述分子反应是测序反应或者核酸合成反应。
10.不混溶中间流体的用途，其用于从微观流体装置的反应区基材替换所述反应区中存在的试剂溶液，其中所述反应区包含具有化学或生化可识别实体的基材，以及用于使得所述化学或生化可识别单元活化或具有反应性。
11.权利要求1_5、8或9任一项的方法、权利要求6-9任一项的装置或者权利要求10的用途，其中所述化学或生化可识别实体是核酸、肽、多肽、碳水化合物、其修饰的形式，核酸、肽、多肽、碳水化合物、其修饰的形式的阵列，或者其任意组合。
12.权利要求1-5、8、9或11任一项的方法、权利要求6-9或11任一项的装置或者权利要求10或11的用途，其中所述不混溶中间流体包含或由(全)氟化烃和/或(全)氟化硅酮组成，优选包含或由(全)氟化饱和烃组成。
13.权利要求1-5、8、9或11任一项的方法、权利要求6-9或11任一项的装置或者权利要求10或11的用途，其中所述不混溶中间流体具有低于大约0.1Pa.s的粘度，高于大约1100kg/l的密度，高于大约50°C的沸点和低于大约1%的水溶性。
14.权利要求1-5 、8、9、11、12或13任一项的方法、权利要求6_9、11、12或13任一项的装置或者权利要求10、11、12或13任一项的用途,其中所述不混溶中间流体是FluorinertElectronic Liquid FC-40.
15.权利要求6-9、11、12、13或14任一项的装置用于进行测序反应或者核酸合成反应的用途。
【文档编号】B01L3/00GK103459035SQ201280014380
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年3月20日 优先权日:2011年3月22日
【发明者】R·温贝格尔-弗里德尔, P·J·范德扎格, E·塞尔沃利 申请人:皇家飞利浦有限公司