专利名称：一种尺寸均一的小粒径魔芋葡甘聚糖微球及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物工程的生化分离以及药物载体领域，具体地，本发明涉及一种尺寸均一的小粒径魔芋葡甘聚糖微球及其制备方法。
背景技术：
魔芋葡甘聚糖(KGM)是一种由葡萄糖和甘露糖通过β-1，4-糖苷键连接而成的一种中性杂多糖，其分子结构与葡聚糖结构相似，具备了作为理想生物材料的许多特性:高亲水性、与生物大分子良好的生物相容性、分子中富含活性羟基以及易于进行化学修饰等，因此制备的魔芋葡甘聚糖微球可以作为层析介质、药物控释载体、香精吸附载体等多种产品。由于开发魔芋葡甘聚糖微球具有重要的经济及实用价值，国内外也开发了多种制备魔芋葡甘聚糖微球的方法。日本学者[JP62236839]利用酯化的魔芋葡甘聚糖制备了一种葡甘聚糖微球，其工艺路线冗长，成本昂贵JP1094949通过在制备的葡甘聚糖微球的基础上引入不同 的离子交换基团制备了魔芋葡甘聚糖离子交换介质。CN1078724A以及CN101113180B都分别描述了不同类型的魔芋葡甘聚糖微球的制备方法。但是，上述的制备方法均为机械搅拌法，制备的微球粒径不均一、粒径难以控制，实际应用中需要经过复杂的筛分程序，耗用大量人力及物力。申请人采用常规微孔膜乳化制备出粒径可控的魔芋葡甘聚糖微球(CN102492178Α)，解决了上述粒径不均一的问题，能够满足分离纯化、细胞培养微载体和诊断制剂等多方面的要求。该方法通过选择不同孔径的膜，可以制备出平均粒径在10-200 μ m范围内可控的微球，但是当制备粒径小于10 μ m的小粒径魔芋葡甘聚糖微球时，所用的膜孔径非常小，此时即使在较高的氮气压力下乳化速度仍然非常慢；增大压力在一定程度下能够提高乳化速度，但是太大的压力会降低微球的粒径均一性，当微球中魔芋葡甘聚糖含量较高时，此问题更为明显。CN101293191A公开了一种制备琼脂糖凝胶微球的方法，其包括如下步骤:提供预定浓度的琼脂糖水溶液作为水相W ;提供溶解了油溶性乳化剂且与水互不相溶的油性物质作为油相O ;将水相W与油相O混合得到W/0型初乳液；将所述初乳液在预定压力下通过经过疏水处理的微孔膜以得到粒径均一的W/0型乳液；使W/0型乳液滴凝固得到琼脂糖凝胶微球。在该方法中，初乳液的制备和过膜操作，都需要在加热条件下进行，即使是低熔点琼脂糖，也要求温度在40°c以上，并且该专利仅能制备琼脂糖含量在20%以下的微球。在本发明中，在进行过膜操作时，并不需要加热，不需将控制温度到40°C以上，在常温下即可操作。琼脂糖微球过膜时要求温度40°C以上，是为了防止溶液冷凝形成凝胶，导致堵膜等问题。对于魔芋葡甘聚糖溶液，由于我们对其进行了降解，把分子量控制在特定范围内，即使浓度增加到20%以上，在常温下也不会形成凝胶，有效解决了胶凝过程的影响。此外，由于琼脂糖微球过膜乳化时要求在40°C以上操作，因此溶液与膜之间的界面张力会下降很多，要求微孔膜必须进行疏水处理。但制备魔芋葡甘聚糖微球时，可以在常温操作，对膜的表面性质没有特殊要求，即使是亲水性的膜也可以制备均一、小粒径的微球，因此无需对微孔膜进行疏水处理。由于琼脂糖的分子量大，因此，浓度需要限制在20%以下，高于20%会因为过于黏稠而无法制备初乳或进行过膜操作。但魔芋葡甘聚糖分子量控制在特定范围内后，在高含量下(高于20%)，仍为可流动状态，可以通过常规方法如均质、高速搅拌等制备初乳液，并且初乳液可顺利通过膜孔进行操作，实现高含量(高于20%)微球的制备。同时高魔芋葡甘聚糖含量和小粒径对于魔芋葡甘聚糖凝胶微球的应用有着很重要的意义。一方面，在生物大分子分离纯化中，对分离介质的要求是能获得尽可能高的流速和尽可能高的分离效果，对于魔芋葡甘聚糖分离介质，这种要求同样存在。减小粒径和提高粒径均一性可以提高分离的分辨率。另一方面，提高魔芋葡甘聚糖微球强度的途径有两个，其一为通过引入化学交联剂，即通过在多糖链上的羟基间引入共价键提高凝胶强度。在保证交联效果相同的情况下，另外一种提高凝胶强度的途径是提高凝胶微球中的魔芋葡甘聚糖的含量，但是随着葡甘聚糖浓度的增加，粘度也会相应的增大。此时，传统机械分散法和已有的直接膜乳化法均难以制备小粒径的魔芋葡甘聚糖微球。虽然机械分散法可以通过提高搅拌速度来降低粒径，但是分散法得到的粒径分布很宽，小于 ο μ m的微球仍然很少。对于已有的直接膜乳化法，制备魔芋葡甘聚糖凝胶微球时，水相粘度的增大会给乳液的制备过程带来很大的麻烦，较大的水相粘度使生成的液滴在膜表面脱落困难，当液滴粒径较小时经过较长的乳化过程液滴甚至会堵塞膜孔。同时，研究也表明，较大的水相粘度使制备过程即使在很大的压力下，也会变得相当缓慢。因此，有必要研究新的制备方法，制备出尺寸均一的小粒径魔芋葡甘聚糖微球，以克服传统制备方法的不足以及由此带来的应用上的缺陷。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种尺寸均一的小粒径魔芋葡甘聚糖微球。所述魔芋葡甘聚糖微球的平均粒径为10 μ m以下，粒径分布span值为0.9以下。优选地，所述魔芋葡甘聚糖微球中魔芋葡甘聚糖含量为20wt%以上。
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所述魔芋葡甘聚糖微球可以为凝胶型或大孔型。所述魔芋葡甘聚糖微球的尺寸非常均一，微球之间无合并现象，在保存过程中不会出现并聚现象。本发明的目的之一还在于提供所述魔芋葡甘聚糖微球的用途。所述魔芋葡甘聚糖微球可用于制备作为药物包埋载体的凝胶微球(能够保持药物的生物活性和生物稳定性)、用于香精吸附(能够有效延长香精释放期)、用作生化工程中的精细分离介质或用作控释载体。本发明的目的之一还在于提供一种所述魔芋葡甘聚糖微球的制备方法。所述魔芋葡甘聚糖微球的制备方法包括以下步骤:(I)以分散有小分子魔芋葡甘聚糖的水溶液为水相W，以溶解有油溶性乳化剂且与水互不相溶的溶液作为油相0，其中，所述小分子魔芋葡甘聚糖的重均分子量为1，000 500，OOODa ；(2)将所述水相W与油相O混合得到W/0型初乳液；(3)将步骤(2)得到的初乳液在压力下通过微孔膜以得到粒径均一的W/0型乳液；(4)进行交联反应；
(5)交联成球后除杂，得到魔芋葡甘聚糖微球。优选地，步骤(I)所述小分子魔芋葡甘聚糖由魔芋葡甘聚糖降解得到。魔芋葡甘聚糖是一种天然的多糖大分子，分子量为80 100万左右，通常情况下，1%的葡甘聚糖溶解在水中即形成胶冻状，没有任何流动性，不能在油相中分散成球。因此，需要将大分子量的葡甘聚糖分子进行降解，得到分子量较小的、易于流动和分散的小分子魔芋葡甘聚糖水溶液。通常降解大分子多糖的方法主要有辐照技术(例如采用放射源钴60 Y-射线)、酸解和酶解三种方法。优选地，所述降解为酸解法；优选地，所述酸解中所使用的酸为有机酸和/或无机酸，进一步优选为盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、草酸、碳酸、丙酸或醋酸中的I种或至少2种的组合，所述组合典型但非限制性的实例包括:盐酸和硫酸的组合，硝酸和磷酸的组合，草酸、碳酸和丙酸的组合，盐酸、碳酸、丙酸和醋酸的组合，硫酸、硝酸、磷酸、草酸和碳酸的组合，硝酸、磷酸、草酸、碳酸、丙酸和醋酸的组合等，特别优选为盐酸、硝酸、丙酸或醋酸中的I种或至少2种的组合。所述酸解法包括:将一定量的魔芋精粉溶于一定量的合适浓度的酸溶液中，充分搅拌形成胶冻状，然后放入高压反应釜内高温降解，再将降解物取出降至室温，加入碱液溶解降解物，充分搅拌使胶冻状物质全部溶解，然后过滤杂质得到黄色澄清液体即魔芋葡甘聚糖溶液。所述酸解法为所属领域已知技术，所属领域技术人员可根据需要选择具体酸解条件。
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降解后的魔芋葡甘聚糖为水溶性分子，要选用油性物质为分散介质进行快速膜乳化成球工艺；优选地，所述油相的分散介质为酯、杂环烷烃、杂环烷烃卤代物、烃类或卤代烃类中的I种或至少2种的组·合，例如醋酸丁酯、氯代环氧丙烷、机油、煤油、透平油、二氯甲烷、石油醚、四氯化碳、液体石蜡、环己烷、芳香族化合物或芳香族化合物卤代物(如甲苯、二氯苯、二甲苯等)中的I种或至少2种的组合，特别优选为液体石蜡、石油醚和/或二甲苯。为制备出光滑凝胶微球，一般需要选择既能溶于油相分散介质中，又可以形成稳定分散效果的油相乳化剂。所述乳化剂可以单独使用，也可以两种或两种以上复配使用。优选地，所述油溶性乳化剂为Span类乳化剂(即失水山梨醇脂肪酸酯，也称为司班类乳化剂，例如山梨醇酐单月桂酸酯(Span20)、山梨醇酐单软脂酸酯(Span40)、山梨醇酐单硬脂酸酯(Span60)、山梨醇酐三硬脂酸酯(Span65)、山梨醇酐单油酸酯(Span80)或山梨醇酐三油酸酯(Span85)中的I种或至少2种的组合)、吐温(Tween)类乳化剂(即聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，例如 Tween20、Tween21、Tween40、Tween60、Tween61、Tween80、Tween81 或 Tween85中的I种或至少2种的组合)、P0-500、油酸、油酸钠、乙基纤维素或锂基脂中的I种或至少2种的组合。优选地，所述油溶性乳化剂在油相中的浓度为0.1 20wt%，进一步优选为0.3 15wt%，特别优选为0.5 10wt%优选地，所述小分子魔芋葡甘聚糖的重均分子量为5，000 100，OOODa0优选地，所述小分子魔芋葡甘聚糖在水相中的浓度为0.01 60wt%，例如:
0.02wt%、0.03wt%、0.05wt%、0.09wt%、0.llwt%、0.2wt%、0.5wt%、lwt%、2wt%、4wt%、6wt%、10wt%、20wt%、25wt%、29wt%、31wt%、35wt%、40wt%、45wt%、49wt%、51wt%、55wt%、58wt%、59wt%等，进一步优选为0.1 50wt%，特别优选为5 30wt%。优选地，步骤(I)所述水相还含有致孔剂，用于制备大孔型魔芋葡甘聚糖微球；选用的致孔剂不能参与交联反应，同时不能溶于油相；微球的制备过程中，致孔剂占据微球内的部分空间，交联反应成球后除去致孔剂，即形成既有物理孔又有化学孔的大孔微球；优选地，所述致孔剂为无机盐、多羟基化合物(例如多元醇)或其聚合物中的一种或几种，特别优选为NaCl、Na2CO3、丙三醇或PEG中的I种或至少2种的组合；优选地，所述致孔剂在水相中的浓度为 50wt% 以下，例如 0.001wt%、0.01wt%、0.lwt%、0.5wt%、0.9wt%> 1.lwt%> 1.5wt%>1.9wt%、2.lwt%>2.5wt%>3wt%>5wt%>10wt%>20wt%>30wt%>35wt%>39wt%、41wt%、44wt%、46wt%、47wt%、48wt%或49wt%等，进一步优选为I 45wt%,特别优选为2 40wt%。优选地，步骤(2)所述水相与油相的质量比为1:0.8以上，例如1:0.9、1:1.1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:2.9、1:3.1、1:4、1:10、1:14、1:16、1:20、1:50、1:100、1:200、1:500、1:800、1:900、1:990、1:999、1:1001、1:1005、1:1010 等，进一步优选为 1:1 1:1000，特别优选为1:3 1:15。步骤(3)所述微孔膜的孔径和压力与具体制备中魔芋葡甘聚糖的含量相关，例如在60°C下，以孔径9.2 μ m的膜制备魔芋葡甘聚糖含量为12wt%的微球，所用压力为0.7kgf/cm2 ；以孔径5.2 μ m的膜制备魔芋葡甘聚糖含量为15wt%的微球时，所用压力为1.2kgf/cm2 ；以孔径9.2 μ m的膜制备魔芋葡甘聚糖含量为20wt%的微球时，其所用压力为l.0kgf/cm2 ;所属领域的技术人员可根据具体情况选择；优选地，所述微孔膜的孔径为0.5 26 μ m，进一步优选为0.8 22 μ m，特别优选为I 20 μ m ;优选地，所述压力为0.1 6.0kgf/cm2,进一步优选为0.3 4.0kgf/cm2,特别优选为0.5 3.0kgf/cm2 ;优选地,所述初乳液通过微孔膜的速度为0.1 4m3.m_2.IT1,进一步优选为0.3 2.5m3.m 2.h \ 特别优选为 0.5 1.5m3.m 2.h、本发明中使用的膜对材质没有特殊要求，既可以使用有机膜，如聚砜、聚酰亚胺、聚偏氟乙烯、聚乙烯、聚丙烯和聚四氟乙烯等，也可以使用无机膜，如陶瓷、玻璃、不锈钢、氧
化铝、二氧化钛、氧化锆等。所述步骤(3)可重 复多次，例如2次以上，3次、4次、10次或20次等。微球制备过程中，魔芋葡甘聚糖水溶液与油相混合得到W/0型初乳液，将初乳液在预定压力下通过微孔膜以得到粒径均一的W/0型乳液后，滴加交联剂，边交联边固化成球。反应完毕后，经过多次除杂，即可得到魔芋葡甘聚糖凝胶微球。优选地，在步骤(I)所述水相中加入交联剂，或者在步骤(3)得到的W/0型乳液中加入交联剂；在在步骤(I)所述水相中加入交联剂时，交联剂可以首先与魔芋葡甘聚糖水溶液混合后，再分散于油相中形成初乳液；然后经过快速膜乳化形成粒径均一乳液后，直接升高温度固化成球。优选地，所述交联剂为1，4- 丁二醇二缩水甘油醚、含有环氧基团的化合物和/或含有卤素取代基的化合物，进一步优选为二环氧丁烷、1，4-丁二醇二缩水甘油醚、环氧氯丙烷-多元醇衍生物或环氧氯丙烷中的I种或至少2种的组合，特别优选为二环氧丁烷、1，4- 丁二醇二缩水甘油醚或环氧氯丙烷中的I种或至少2种的组合。优选地，步骤(4)所述交联反应在搅拌下进行；交联时的搅拌转速是影响小粒径魔芋葡甘聚糖微球制备的重要因素；优选地，所述搅拌转速为20 lOOOrpm/min，进一步优选为50 800rpm/min,特别优选为200 600rpm/min。优选地，步骤(4)所述交联反应的温度为30 90°C，特别优选50 80°C。
优选地，步骤(4)所述交联反应的时间为至少4小时，例如4.1小时、4.2小时、4.5小时、4.9小时、5.1小时、6小时、10小时、11小时、3小时、15小时、20小时、22小时、23小时、25小时、30小时或40小时等，进一步优选为4 24小时，特别优选为5 12小时。优选地，步骤(4)所述除杂为依次洗涤、收集，特别优选为依次洗涤、过滤。在一个实施方案中，所述魔芋葡甘聚糖微球的制备方法包括以下步骤:(I)以分散有小分子魔芋葡甘聚糖的水溶液为水相W，以溶解有油溶性乳化剂且与水互不相溶的溶液作为油相0，其中，所述小分子魔芋葡甘聚糖的重均分子量为1，000 500，OOODa，所述小分子魔芋葡甘聚糖在水相中的浓度为0.01 60wt% ；(2)将水相W与油相O混合得到W/0型初乳液，其中水相与油相的质量比为1:0.8以上；(3)将所述初乳液在压力下通过微孔膜以得到粒径均一的W/0型乳液，所用微孔膜的孔径为0.5 26 μ m,所述压力为0.1 6.0kgf/cm2 ；(4)在步骤(3)得到的乳液中滴加交联剂，在搅拌下进行交联反应，交联反应的温度为30 90°C，交联反应的时间为至少4小时，交联时转速为20 1000rpm/min ；(5)交联成球后，经洗涤、过滤，即可得到尺寸均一的小粒径魔芋葡甘聚糖微球。在另一个实施方案中，所述魔芋葡甘聚糖微球的制备方法包括以下步骤:(I)以分散有小分子魔芋葡甘聚糖和交联剂的水溶液为水相W，以溶解有油溶性乳化剂且与水互不相溶的溶液作为油相0，其中，所述小分子魔芋葡甘聚糖的重均分子量为1，000 500，OOO Da，所述小分子魔芋葡甘聚糖在水相中的浓度为0.01 60wt% ；(2)将水相W与油相O混合得到W/0型初乳液，其中水相与油相的质量比为1:0.8以上；(3)将所述初乳液在压力下通过微孔膜以得到粒径均一的W/0型乳液，所用微孔膜的孔径为0.5 26 μ m,所述压力为0.1 6.0kgf/cm2 ；(4)在搅拌下将步骤(3)得到的乳液升温至30 90°C进行交联反应，交联反应的时间为至少4小时，交联时转速为20 1000rpm/min ；(5)交联成球后，经洗涤、过滤，即可得到尺寸均一的小粒径魔芋葡甘聚糖微球。根据本发明提供的尺寸均一的小粒径魔芋葡甘聚糖微球的制备方法，可以制备用于生化工程中的精细分离介质以及用作药物包埋体的魔芋葡甘聚糖凝胶微球。微球的尺寸小于10 μ m、魔芋葡甘聚糖含量可高达20wt%以上。该技术解决了传统膜乳化法难以制备小粒径以及较高魔芋葡甘聚糖含量的微球的问题，在保证粒径均一的前提下能够制备出粒径小于10 μ m、葡甘聚糖含量高达20wt%以上的魔芋葡甘聚糖微球。在本发明中，初乳液在常温下通过微孔膜即可得到粒径均一的W/0型乳液，条件更为温和，且能耗较低，易于实现工业化生产。与已有技术方案相比，本发明具有以下有益效果:(I)采用本发明的制备方法，能够很容易的制备出传统乳化法难以制备的高魔芋葡甘聚糖含量(20wt%以上)的凝胶微球，从而得到较高机械强度的凝胶微球，能够在较高压力下实现精细分离。(2)本发明提供的制备方法，能够成功制备粒径均一的小粒径(小于10 μ m)魔芋葡甘聚糖微球，并可通过调节致孔剂的用量来控制魔芋葡甘聚糖微球的孔容大小，能够制备多种类型的魔芋葡甘聚糖微球，扩大微球的分离范围。(3)本发明提供的制备方法除可以制备用于生化精细分离的介质外，还可用于制备作为药物包埋载体的凝胶微球，可望能够保持药物的生物活性和生物稳定性，还可以用于香精吸附、控释载体，能够有效延长香精释放期，同时由于粒径小，能够良好的分散于介质中，长期放置不发生沉降现象。(4)本发明所使用的试验设备简单，容易实现工艺放大，且制备工艺简单，操作易于控制。
图1是快速膜乳化法制备魔芋葡甘聚糖微球的一个实施方案的制备流程；图2是实施例1中魔芋葡甘聚糖水溶液的制备流程；图3是实施例2中制备的魔芋葡甘聚糖微球的光学显微照片；图4是实施例7中制备的魔芋葡甘聚糖微球的光学显微照片；图5是实施例9中制备的魔芋葡甘聚糖微球的光学显微照片；图6是实施例10中制备的魔芋葡甘聚糖微球的光学显微照片。
具体实施例方式为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。总体上讲，本发明采用了一种新的膜乳化法制备了小粒径的魔芋葡甘聚糖微球。根据一个优选的实施方案，本发明采用玻璃膜作为微孔膜，先将油水两相通过均质乳化或者搅拌制得W/0的初乳液，之后在较高的压力下使初乳液快速通过微孔膜降低乳液中液滴的尺寸，经过反复几次膜乳化得到粒径均一的乳液，之后乳液经化学交联固化得到粒径均一的魔芋葡甘聚糖微球。本发明采用这种新型的膜乳化法可以制备尺寸均一、粒径小于10 μ m的魔芋葡甘聚糖微球，在魔芋葡甘聚糖浓度高达20% (w/w)的情况下得到的微球粒径均一性依然很高。本发明除了能制备得到尺寸小于10 μ m、粒径均一、魔芋葡甘聚糖含量高的凝胶微球，还可以通过选择不同的膜孔径控制所得微球的平均粒径。本发明中魔芋葡甘聚糖微球的制备方法的一个实施方案如图1所示。实施例1:魔芋葡甘聚糖水溶液的制备(如图2)在500ml反应器中，将20ml0.5M的HCl与120g去离子水混合均匀，将魔芋葡甘聚糖20.0g倒入混合液中,搅拌均勻,溶胀5min后呈胶冻状。用parafilm膜或表面皿盖住反应器，放入高压灭菌锅中，在115°C下降解30min，降解完毕后取出反应器，放置至室温。加入40g40%的NaOH溶液，搅拌使浆液溶解，过滤杂质后即可得到澄清的10%含量的魔芋葡甘聚糖水溶液。同法可以制备0.1%、4%、15%、20%、40%等固含量的魔芋葡甘聚糖水溶液备用。 实施例2将孔径为9.2 μ m的膜置于亲油性的物质中浸润，将油溶性乳化剂37.5g司班80加入到750g的液体石蜡和石油醚的混合物(质量比11:1)中，搅拌至完全溶解并加热至60°C作为油相。迅速将IOOg水相(魔芋葡甘聚糖浓度为5%)与油相混合并以均质乳化在5000rpm下乳化30秒,所得乳液迅速倒入预热至60°C的膜乳化装置中，在0.5kgf/cm2压力下快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的W/0型乳液，将所得乳液作为初乳液在0.5kgf/cm2压力再次通过微孔膜反复乳化三次；乳化完毕，将50g交联剂环氧氯丙烷缓慢滴加入乳液中，滴加时间约0.5h。滴加完毕后，以400rpm转速下交联反应8h。固化结束后，分别用乙醇、石油醚以及去离子水进行清洗，并将其保存在去离子水中。微球的平均粒径和粒径分布采用激光粒度仪Mastrrizer2000E进行测量，最后得到粒径为8.2 μ m左右的魔芋葡甘聚糖微球，span值为0.901。微球的光学显微镜照片如图3所示。实施例3将孔径为10.2 μ m的膜置于亲油性的物质中浸润，将油溶性乳化剂司班8015g加入到500g的液体石蜡和石油醚的混合物(质量比7:5)中，搅拌至完全溶解并加热至50°C作为油相。迅速将IOOg水相(魔芋葡甘聚糖浓度为12%)与油相混合并以均质乳化在5000rpm下乳化30秒，所得乳液迅速倒入预热至40°C的膜乳化装置中，在0.7kgf/cm2压力下快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的W/0型乳液，将所得乳液作为初乳液在0.7kgf/cm2压力再次通过微孔膜 反复乳化三次；乳化完毕，将50g交联剂环氧氯丙烷缓慢滴加入乳液中，滴加时间约0.5h。滴加完毕后，以350rpm转速下在65°C下交联反应8h。固化结束后，分别用乙醇、石油醚以及去离子水进行清洗，最后得到粒径为9.4 μ m左右的魔芋葡甘聚糖微球，span值为0.891。实施例4将孔径为5.7 μ m的膜置于亲油性的物质中浸润，将油溶性乳化剂司班8016g和8g乙基纤维素的混合物加入到600g的二甲苯中，搅拌至完全溶解并加热至30°C作为油相。迅速将IOOg水相(魔芋葡甘聚糖浓度为10%)与油相混合并以均质乳化在5000rpm下乳化30秒，所得乳液迅速倒入预热至30°C的膜乳化装置中，在1.0kgf/cm2压力下快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的W/0型乳液，将所得乳液作为初乳液在1.0kgf/cm2压力再次通过微孔膜反复乳化四次；乳化完毕，将50g交联剂环氧氯丙烷缓慢滴加入乳液中，滴加时间约0.5h。滴加完毕后，以500rpm转速下在80°C下交联反应8h。固化结束后，分别用乙醇、石油醚以及去离子水进行清洗，最后得到粒径为5.2 μ m左右的魔芋葡甘聚糖微球，span 值为 0.851 ο实施例5将孔径为5.2 μ m的膜置于亲性的物质中浸润，将油溶性乳化剂P0-500加入到IOOOg的液体石蜡和石油醚的混合物(质量比10:2)中，搅拌至完全溶解并加热至40°C作为油相。迅速将IOOg水相(魔芋葡甘聚糖浓度为12%)与油相混合并以均质乳化在5000rpm下乳化30秒，所得乳液迅速倒入预热至40°C的膜乳化装置中，在1.7kgf/cm2压力下快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的W/0型乳液，将所得乳液作为初乳液在1.7kgf/cm2压力再次通过微孔膜反复乳化四次；乳化完毕，将50g交联剂环氧氯丙烷缓慢滴加入乳液中，滴加时间约0.5h。滴加完毕后，以450rpm转速下交联反应8h。固化结束后，分别用乙醇、石油醚以及去离子水进行清洗，最后得到粒径为4.8 μ m左右的魔芋葡甘聚糖微球，span 值为 0.751 ο实施例6将孔径为5.2 μ m的膜置于亲油性的物质中浸润，将油溶性乳化剂司班8037.5g加入到750g的液体石蜡中，搅拌至完全溶解作为油相。迅速将含有50gl，4-丁二醇双缩水甘油醚的IOOg水相(魔芋葡甘聚糖浓度为10%)与油相混合并以均质乳化在5000rpm下乳化30秒，所得乳液迅速倒入膜乳化装置中，在1.0kgf/cm2压力下快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的W/0型乳液，将所得乳液作为初乳液在1.0kgf/cm2压力再次通过微孔膜反复乳化四次；乳化完毕后，以400rpm转速在37°C下交联反应12h。固化结束后，分别用乙醇、石油醚以及去离子水进行清洗，最后得到粒径为4.4 μ m左右的魔芋葡甘聚糖微球，span 值为 0.871。实施例7将孔径为10.2 μ m的膜置于亲油性的物质中浸润，将油溶性乳化剂P0_50025g加入到500g的液体石蜡和石油醚的混合物(质量比10:2)中，搅拌至完全溶解并加热至40°C作为油相。迅速将含有50g环氧氯丙烷的IOOg水相(魔芋葡甘聚糖浓度为12%)与油相混合并以均质乳化在5000rpm下乳化30秒，所得乳液迅速倒入预热至40°C的膜乳化装置中，在
0.7kgf/cm2压力下快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的W/0型乳液，将所得乳液作为初乳液在0.7kgf/cm2压力再次通过微孔膜反复乳化三次；乳化完毕后，以400rpm转速下交联反应8h。固化结束后，分别用乙醇、石油醚以及去离子水进行清洗，最后得到粒径为9.5 μ m左右的魔芋葡甘聚糖微球，span值为0.882。微球的光学显微镜照片如图4所
/Jn ο实施例8将孔径为10.2 μ m的膜置于亲油性的物质中浸润，将油溶性乳化剂20gP0_500和20g锂基酯加入到750g甲苯和四氯化碳的混合物(质量比为4:1)中，搅拌至完全溶解并加热至30°C作为油相。迅速将固含量为40%的魔芋葡甘聚糖溶液IOOg(其中含有IOg NaCl)与油相混合并以均 质乳化在5000rpm下乳化30秒，所得乳液迅速倒入预热至30°C的膜乳化装置中，在2.5kgf/cm2压力下快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的W/0型乳液，将所得乳液作为初乳液在2.5kgf/cm2压力再次通过微孔膜反复乳化五次；乳化完毕，将50g交联剂1，4-丁二醇双缩水甘油醚缓慢滴加入乳液中，滴加时间约0.5h。滴加完毕后，以600rpm转速下交联反应12h。固化结束后，分别用乙醇、石油醚以及去离子水进行清洗，最后得到粒径为9.0 μ m左右的大孔型魔芋葡甘聚糖微球，span值为0.892。实施例9将孔径为5.2 μ m的膜置于亲油性的物质中浸润，将油溶性乳化剂司班8045g加入到1500g的液体石蜡中，搅拌至完全溶解并加热至40°C作为油相。迅速将固含量为12%的魔芋葡甘聚糖溶液IOOg (其中含有5g NaCl)与油相混合并以均质乳化在5000rpm下乳化30秒，所得乳液迅速倒入预热至40°C的膜乳化装置中，在1.2kgf/cm2压力下快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的W/0型乳液，将所得乳液作为初乳液在1.2kgf/cm2压力再次通过微孔膜反复乳化四次；乳化完毕，将50g交联剂环氧氯丙烷缓慢滴加入乳液中，滴加时间约0.5h。滴加完毕后，以600rpm转速在80°C下交联反应12h。固化结束后，分别用乙醇、石油醚以及去离子水进行清洗，最后得到粒径为4.8 μ m左右的大孔型魔芋葡甘聚糖微球，span值为0.791。微球的光学显微镜照片如图5所不。实施例10将孔径为19 μ m的膜置于亲油性的物质中浸润，将40g油溶性乳化剂司班60加入到900g 二甲苯中，搅拌至完全溶解作为油相。迅速将固含量为12%的魔芋葡甘聚糖溶液IOOg (其中含有15g Na2CO3)与油相混合并以均质乳化在5000rpm下乳化30秒，所得乳液迅速倒入膜乳化装置中，在0.7kgf/cm2压力下快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的W/0型乳液，将所得乳液作为初乳液在0.7kgf/cm2压力再次通过微孔膜反复乳化三次；乳化完毕，将50g交联剂环氧氯丙烷缓慢滴加入乳液中，滴加时间约0.5h。滴加完毕后，以350rpm转速下交联反应8h。固化结束后，分别用乙醇、石油醚以及去离子水进行清洗，最后得到粒径为15 μ m左右的大孔型魔芋葡甘聚糖微球，span值为0.791。微球的光学显微镜照片如图6所示。实施例11将孔径为26 μ m的膜置于亲油性的物质中浸润，将油溶性乳化剂P0_500200g加入到800g的石油醚中，搅拌至完全溶解并加热至30°C作为油相。迅速将125g水相(魔芋葡甘聚糖浓度为60%)与油相混合并以均质乳化在5000rpm下乳化60秒,所得乳液迅速倒入预热至30°C的膜乳化装置中，在0.lkgf/cm2压力下快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的W/0型乳液，将所得乳液作为初乳液在0.lkgf/cm2压力再次通过微孔膜反复乳化四次；乳化完毕，将40g交联剂环氧氯丙烷缓慢滴加入乳液中，滴加时间约lh。滴加完毕后，以IOOOrpm转速下在90°C下交联反应4h。固化结束后，分别用乙醇、石油醚以及去离子水进行清洗，最后得到粒径为21 μ m左右的魔芋葡甘聚糖微球，span值为0.864。实施例12将孔径为0.5 μ m的膜置于亲油性的物质中浸润，将油溶性乳化剂油酸IOOOg加入到9000g的液体石蜡中，搅拌至完全溶解并加热至30°C作为油相。迅速将Ig水相(魔芋葡甘聚糖浓度为0.01%)与油相混合并以均质乳化在5000rpm下乳化20秒，所得乳液迅速倒入预热至30°C的膜乳化装置中，在6.0kgf/cm2压力下快速通过孔径均一的微孔膜，得到粒径比较均一的W/0型乳液，将所得乳液作为初乳液在6.0kgf/cm2压力再次通过微孔膜反复乳化三次；乳化完毕，将IOg交联剂环氧氯丙烷缓慢滴加入乳液中，滴加时间约0.5h。滴加完毕后，以IOOrpm转速下在30°C下交联反应25h。固化结束后，分别用乙醇、石油醚以及去离子水进行清洗，最后得到粒径为0.3` μ m左右的魔芋葡甘聚糖微球，span值为0.782。申请人:声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
权利要求
1.一种魔芋葡甘聚糖微球，其特征在于，所述魔芋葡甘聚糖微球的平均粒径为IOym以下，粒径分布span值为0.9以下。
2.如权利要求1所述的魔芋葡甘聚糖微球，其特征在于，所述魔芋葡甘聚糖微球中魔芋葡甘聚糖含量为20wt%以上。
3.如权利要求1或2所述的魔芋葡甘聚糖微球的用途，其特征在于，所述魔芋葡甘聚糖微球用于制备作为药物包埋载体的凝胶微球、用于香精吸附、用作生化工程中的精细分离介质或用作控释载体。
4.一种如权利要求1或2所述的魔芋葡甘聚糖微球的制备方法，包括以下步骤: (O以分散有小分子魔芋葡甘聚糖的水溶液为水相W，以溶解有油溶性乳化剂且与水互不相溶的溶液作为油相O，其中，所述小分子魔芋葡甘聚糖的重均分子量为1，000 500，OOODa ； (2)将所述水相W与油相O混合得到W/0型初乳液； (3)将步骤(2)得到的初乳液在压力下通过微孔膜以得到粒径均一的W/0型乳液； (4)进行交联反应； (5)交联成球后除杂，得到魔芋葡甘聚糖微球。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述小分子魔芋葡甘聚糖由魔芋葡甘聚糖降解得到； 优选地，所述降解为酸解； 优选地，所述酸解中所使用的酸为有机酸和/或无机酸，进一步优选为盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、草酸、碳酸、丙酸或醋酸中的I种或至少2种的组合，特别优选为盐酸、硝酸、丙酸或醋酸中的I种或至少2种的组合； 优选地，所述小分子魔芋葡甘聚糖的重均分子量为5，000 100，OOODa ； 优选地，所述小分子魔芋葡甘聚糖在水相中的浓度为0.01 60wt%，进一步优选为0.1 50wt%，特别优选为5 30wt%o
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述油相的分散介质为酯、杂环烷烃、杂环烷烃卤代物、烃类或卤代烃类中的I种或至少2种的组合，特别优选为液体石蜡、石油醚和/或二甲苯； 优选地，所述油溶性乳化剂为Span类乳化剂、吐温类乳化剂、P0-500、油酸、油酸钠、乙基纤维素或锂基脂中的I种或至少2种的组合； 优选地，所述油溶性乳化剂在油相中的浓度为0.1 20wt%，进一步优选为0.3 15wt%，特别优选为0.5 10wt% ； 优选地，步骤(I)所述水相还含有致孔剂； 优选地，所述致孔剂为无机盐、多羟基化合物或其聚合物中的一种或几种，特别优选为NaCl、Na2CO3、丙三醇或PEG中的I种或至少2种的组合； 优选地，所述致孔剂在水相中的浓度为50wt%以下，进一步优选为I 45wt%，特别优选为 2 40wt%。
7.如权利要求4-6之一所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述水相与油相的质量比为1:0.8以上，进一步优选为1:1 1:1000，特别优选为1:3 1:15 ; 优选地，步骤(3)所述微孔膜的孔径为0.5 26μπι，进一步优选为0.8 22μπι，特别优选为I 20 μ m ; 优选地，步骤(3)所述压力为0.1 6.0kgf/cm2,进一步优选为0.3 4.0kgf/cm2,特别优选为0.5 3.0kgf/cm2 ； 优选地，步骤(3)所述初乳液通过微孔膜的速度为0.1 4m3.m_2.h—1，进一步优选为·0.3 2.5m3.m 2.h \ 特别优选为 0.5 1.5m3.m 2.h、
8.如权利要求4-7之一所述的方法，其特征在于，在步骤(I)所述水相中加入交联剂，或者在步骤(3)得到的W/0型乳液中加入交联剂； 优选地，所述交联剂为1，4-丁二醇二缩水甘油醚、含有环氧基团的化合物和/或含有卤素取代基的化合物，进一步优选为二环氧丁烷、1，4-丁二醇二缩水甘油醚、环氧氯丙烷-多元醇衍生物或环氧氯丙烷中的I种或至少2种的组合，特别优选为二环氧丁烷、1，4- 丁二醇二缩水甘油醚或环氧氯丙烷中的I种或至少2种的组合。
9.如权利要求4-8之一所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述交联反应在搅拌下进行；优选地，所述搅拌转速为20 1000rpm/min,进一步优选为50 800rpm/min,特别优选为 200 600rpm/min ； 优选地，步骤(4)所述交联反应的温度为30 90°C，特别优选50 80°C ； 优选地，步骤(4)所述交联反应的时间为至少4小时，进一步优选为4 24小时，特别优选为5 12小时； 优选地，步骤(4)所述除杂 为依次洗涤、收集，特别优选为依次洗涤、过滤。
10.如权利要求4-9之一所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (O以分散有小分子魔芋葡甘聚糖的水溶液为水相W，以溶解有油溶性乳化剂且与水互不相溶的溶液作为油相0，其中，所述小分子魔芋葡甘聚糖的重均分子量为1，000 ·500，OOODa，所述小分子魔芋葡甘聚糖在水相中的浓度为0.01 60wt% ； (2)将水相W与油相O混合得到W/0型初乳液，其中水相与油相的质量比为1:0.8以上； (3)将所述初乳液在压力下通过微孔膜以得到粒径均一的W/0型乳液，所用微孔膜的孔径为0.5 26 μ m,所述压力为0.1 6.0kgf/cm2 ； (4)在步骤(3)得到的乳液中滴加交联剂，在搅拌下进行交联反应，交联反应的温度为·30 90°C，交联反应的时间为至少4小时，交联时转速为20 1000rpm/min ； (5)交联成球后，经洗涤、过滤，即可得到尺寸均一的小粒径魔芋葡甘聚糖微球。
全文摘要
本发明涉及一种魔芋葡甘聚糖微球，微球的平均粒径小于10μm，微球中魔芋葡甘聚糖含量可以高达20%(w/w)以上，粒径均一，粒径分布系数Span值小于0.9。本发明还提供了该微球的制备方法，解决了传统方法难以制备粒径小于10μm魔芋葡甘聚糖微球的问题以及所制备的微球粒径不均一的问题。
文档编号B01J13/02GK103194008SQ20131009972
公开日2013年7月10日 申请日期2013年3月26日 优先权日2013年3月26日
发明者马光辉, 周炜清, 熊志冬, 苏志国, 李娟 , 孙李靖, 巩方玲 申请人:中国科学院过程工程研究所