专利名称：一种加压溶剂萃取微生物发酵培养物中物质的方法
技术领域：
本发明涉及一种萃取微生物发酵培养物中物质的方法，特别是一种加压溶剂萃取微生物发酵培养物中物质的方法。
背景技术：
目前，微生物作为细胞工厂来获取活性代谢产物已经得到了很广泛的应用，使用固体培养基培养微生物是提高生物量的有效方法。萃取微生物发酵培养物中物质大都采用常温常压下的溶剂萃取法，该法存在萃取时间长，消耗溶剂量大的缺点。尤其当目标物质不明确、发酵微生物种类繁多时，需要建立快速、高效、节耗的萃取方法，以尽可能多和尽可能全面地获得培养物中物质，并保证能快速完成萃取过程。加压溶剂萃取法又叫快速溶剂萃取法(Accelerated Solvent Extraction, ASE),是Richter等在1995年提出的一种萃取方法，其原理是:通过提高温度和增加压力来提高溶剂对被萃取物的渗透能力和对溶质的溶解度，从而提高萃取率。该法具有萃取时间短、溶剂消耗量省、操作简单、萃取率高的优点，是一种绿色萃取方法，被美国国家环保局批准为EPA3545号标准方法，在食品、药品的成分和农残检测等领域得到广泛的应用。但是，将ASE法用于微生物发酵培养物中物质的萃取目前还没见到报导。
发明内容
本发明的目的，是要提供一种加压溶剂萃取微生物发酵培养物中物质的方法。将加压溶剂萃取的手段用于萃取发酵培养物中物质，并结合溶剂回收工艺，可快速萃取得到培养物中物质，并能保证很高的萃取率，是适用于发酵培养物处理的符合经济性原则的方法。本发明是这样实现的，所述一种加压溶剂萃取微生物发酵培养物中物质的方法，依次包括如下步骤:
(1)装样:将固体发酵培养物或已将培养基与菌体分离后的液体发酵培养的菌体或已吸附发酵液中物质的载体直接装入萃取釜中；装填顺序依次为:滤片、滤纸、隔离层、样品和隔尚层；
(2)加压溶剂萃取:在高温高压下，使用甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、异丙醇、正丁醇、石油醚、正已烷、环已烷溶剂中的一种或多种作为萃取溶剂进行萃取，无需固液分离步骤，可直接接收得到萃取液；萃取操作的压力0.2 15MPa，萃取操作的温度30 200° C，静态萃取时间0.5 180 min,萃取次数一次或多次；
(3)萃取得到的萃取液进行减压浓缩，蒸发浓缩温度为20 100°C，真空度5 95KPa，萃取液经减压浓缩，浸膏即为发酵培养物中物质，而减压蒸发冷凝得到的液体可重复利用。步骤(2)中，高温高压萃取的过程包括升压、升温、静态萃取、降压、气体吹扫，最终直接接收得到萃取液。
本发明最佳萃取操作的温度为100 120 0C ;最佳萃取操作的压力10 15MPa ；最佳静态萃取时间为15 20min,最佳萃取次数为2 3次；最佳蒸发浓缩温度为35 45° C，最佳真空度5 25 Kpa0本发明的最佳实施例之一:使用甲醇和乙酸乙酯的混合溶液作为萃取溶剂进行萃取，最佳配比范围为，甲醇70 85%:乙酸乙酯30 15%，V/V。步骤(I)中所述隔离层为石英砂、玻璃棉或惰性人造棉。本发明的有益效果是，与传统工艺相比，本发明具有如下优点:①在加压溶剂萃取条件下，料液比得到很大提高，可以实现节省溶剂80%以上。②加压溶剂萃取在更高的压力和温度下进行，可以将培养物中物质萃取得更完全，可提高萃取率达40%以上。③加压溶剂萃取的静态萃取时间很短，萃取效率很高，可缩短萃取时间65%以上。④较短的操作时间大大降低了发酵培养物中物质氧化变性等的不稳定因素。⑤结合溶剂回收步骤，进一步提高了过程经济性。⑥通过改变萃取釜大小，可以方便地对工艺进行放大。
图1为本发明的加压溶剂萃取设备的示意图。图2为本发明的工艺流程图。图中:1.储液瓶，2.萃取釜，3.泵，4.吹扫阀，5.静态阀，6.收集瓶，7.氮气瓶，
8.炉体。
具体实施例方式本发明所述一种加压溶剂萃取微生物发酵培养物中物质的方法，如图1、2所示，按图2所示过程，首先向储液瓶I中加入萃取用溶液，向如图1所示的配有加热套的萃取釜2中按顺序装填好样品，并盖好萃取釜盖。萃取用溶液可选择甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、异丙醇、正丁醇、石油醚、正己烷、环己烷等。甲醇和乙醇萃取物的极性分布较广且极性大的物质多；乙酸乙酯、正丁醇和氯仿萃取物极性分布最广；石油醚，环己烷和正己烷萃取物主要是极性小的物质，且这些物质用甲醇和乙酸乙酯萃取可得到。甲醇和乙酸乙酯混合溶液作为萃取剂时，不仅能萃取得到种类最多的物质，而且萃取率最高。甲醇和乙酸乙酯可按多种比例混合，最佳配比范围为甲醇70— 85%:乙酸乙酯30 —15%，V/V。然后，设定相应的萃取温度、萃取压力、静态萃取时间和萃取次数。萃取操作的温度一般设定在30 200 °C，最佳萃取操作的温度为100 120 °C，温度过高容易造成被萃取物的不稳定，温度较低时萃取率也较低。萃取操作的压力一般设定在0.2 15MPa，最佳萃取操作的压力10 15MPa，萃取压力过高对设备要求较高，容易发生漏液现象，萃取压力较低时萃取率也较低。静态萃取时间一般设定在0.5 180min,最佳静态萃取时间为15 20min，静态萃取时间过长并不能进一步提高萃取率反而增加被萃取物变性的几率，静态萃取时间太短时萃取不完全。萃取次数可以设定I到多次，最佳萃取次数为2 3次，I次萃取往往不能保证萃取完全，萃取次数太多，不仅增加操作时间，也增加了后续减压浓缩的压力。设定完成后，程序自动向萃取釜中泵入萃取溶液，并开始加压。压力升至设定压力的一半左右时，系统开始对萃取釜进行加热。加热至设定温度后，系统再次升压至设定压力。之后，系统开始进行静态萃取。达到设定的静态萃取时间后，系统卸压，收集瓶中收集到萃取液。卸压后可用如图1所示的氮气进行吹扫，以尽可能全面地收集萃取液。收集到的萃取液于20 100 ° C下进行减压浓缩，最佳蒸发浓缩温度为35 45 ° C，真空度5 95Kpa，最佳真空度5 25 Kpa0浓缩得到的浸膏即为萃取得到的发酵培养物中物质，减压蒸发冷凝得到的液体可重复利用，用于新的萃取过程。图1中还标有泵3、吹扫阀4、静态阀
5、收集瓶6、氮气瓶7、炉体8。下面结合五个实施例对本发明再作详细说明
实施例1:将一株海洋真菌(球孢枝孢)固体发酵产物(包括菌体与培养基)装入萃取釜中，盖上萃取釜盖，设定好程序(包括萃取温度、萃取压力、静态萃取时间、萃取次数等)，萃取釜自动加注溶剂(萃取溶液)后，自动加热、加压到设定值，样品在设定的压力和温度下进打静态卒取，卒取结束后，氣气自动吹扫，在收集瓶中接收卒取物。所取发酵物质量为10g，以80:20 (V:V)的甲醇与乙酸乙酯混合溶液进行萃取，设定萃取温度为105° C，萃取压力为12MPa，静态萃取时间为15min，萃取2次，接收到的萃取液进行减压浓缩并称量浸膏质量。与常压条件下的溶剂浸泡法相比，压力溶剂萃取法所需时间仅为常压萃取的30%，溶剂消耗量仅为常压萃取的19%，而萃取率则提高了 38%。实施例2:将一株放线菌发酵培养液进行离心并将菌体装入萃取釜中，盖上萃取釜盖，设定好程序(包括萃取温度、萃取压力、静态萃取时间、萃取次数等)，萃取釜自动加注溶剂(萃取溶液)后，自动加热、加压到设定值，样品在设定的压力和温度下进行静态萃取，卒取结束后，氣气自动吹扫，在收集瓶中接收卒取物。所取发酵物质量为15g，以80:20 (V:V)的甲醇与乙酸乙酯混合溶液进行萃取，设定萃取温度为120° C，萃取压力为IIMPa，静态萃取时间为20min，萃取2次，接收到的萃取液进行减压浓缩并称量浸膏质量。与常压条件下的溶剂浸泡法相比，压力溶剂萃取法所需时间仅为常压萃取的35%，溶剂消耗量仅为常压萃取的20%，而萃取率则提高了 40%。实施例3:将一株海洋真菌(青霉)固体发酵产物(包括菌体与培养基)装入萃取釜中，盖上萃取釜盖，设定好程序(包括萃取温度、萃取压力、静态萃取时间、萃取次数等)，萃取釜自动加注溶剂(萃取溶液)后，自动加热、加压到设定值，样品在设定的压力和温度下进打静态卒取，卒取结束后，氣气自动吹扫，在收集瓶中接收卒取物。所取发酵物质量为80g，依次使用甲醇和乙酸乙酯作为萃取剂，设定萃取温度为105°C，萃取压力为12MPa，静态萃取时间为15min，两种溶剂分别萃取2次，接收到的萃取液进行减压浓缩并称量浸膏质量。与常压条件下的溶剂浸泡法相比，压力溶剂萃取法所需时间为常压萃取的80%，溶剂消耗量仅为常压萃取的70%，而萃取率则提高了 65%。实施例4:将一株海洋真菌(青霉)固体发酵产物(包括菌体与培养基)先进行充分干燥再装入萃取釜中，盖上萃取釜盖，设定好程序(包括萃取温度、萃取压力、静态萃取时间、萃取次数等)，萃取釜自动加注溶剂(萃取溶液)后，自动加热、加压到设定值，样品在设定的压力和温度下进行静态萃取，萃取结束后，氮气自动吹扫，在收集瓶中接收萃取物。所取干燥后发酵物质量为2.3g，依次使用甲醇和乙酸乙酯作为萃取剂，设定萃取温度为105°C，萃取压力为12MPa，静态萃取时间为15min，两种溶剂分别萃取2次，接收到的萃取液进行减压浓缩并称量浸膏质量。与常压条件下的溶剂浸泡法相比，压力溶剂萃取法所需时间与常压萃取相当，溶剂消耗量与常压萃取相当，而萃取率则提高了 76%。
实施例5:将一株海洋细菌(波多野氏微杆菌)的发酵液，用细颗粒状的惰性载体吸附其中的有机化合物成分，将该载体装入萃取釜中，盖上萃取釜盖，设定好程序(包括萃取温度、萃取压力、静态萃取时间、萃取次数等)，萃取釜自动加注溶剂(萃取溶液)后，自动加热、加压到设定值，样品在设定的压力和温度下进行静态萃取，萃取结束后，空气吹扫，在收集瓶中接收萃取物。所取的吸附发酵液中有机化合物的载体质量为60g，依次使用甲醇和乙酸乙酯作为萃取剂，设定萃取温度为85°C，萃取压力为12MPa，静态萃取时间为lOmin，两种溶剂分别萃取2次，接收到的萃取液进行减压浓缩并称量浸膏质量。与常压条件下的柱洗脱方法相t匕，压力溶剂萃取法所需的时间比装柱洗脱法节省了 50%以上的时间，溶剂消耗量比装柱洗脱法节省了 50%以上，而萃取率则提高了 50%。以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
权利要求
1.一种加压溶剂萃取微生物发酵培养物中物质的方法，依次包括如下步骤: (1)装样:将固体发酵培养物或已将培养基与菌体分离后的液体发酵培养的菌体或已吸附发酵液中物质的载体直接装入萃取釜中；装填顺序依次为:滤片、滤纸或滤布、隔离层、样品和隔离层； (2)加压溶剂萃取:在高温高压下，使用甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、异丙醇、正丁醇、石油醚、正已烷、环已烷溶剂中的一种或多种作为萃取溶剂进行萃取，无需固液分离步骤，可直接接收得到萃取液；萃取操作的压力0.2 15MPa，萃取操作的温度30 200° C，静态萃取时间0.5 180 min,萃取次数一次或多次； (3)萃取得到的萃取液进行减压浓缩，蒸发浓缩温度为20 100°C，真空度5 95KPa，萃取液经减压浓缩，浸膏即为发酵培养物中物质，而减压蒸发冷凝得到的液体可重复利用。
2.根据权利要求1所述的一种加压溶剂萃取微生物发酵培养物中物质的方法，其特征是:步骤(2)中，高温高压萃取的过程包括升压、升温、静态萃取、降压、气体吹扫，最终直接接收得到萃取液。
3.根据权利要求1所述的一种加压溶剂萃取微生物发酵培养物中物质的方法，其特征是:最佳萃取操作的温度为100 120 0C ;最佳萃取操作的压力10 15MPa ;最佳静态萃取时间为15 20min,最佳萃取次数为2 3次；最佳蒸发浓缩温度为35 45 °C,最佳真空度5 25 Kpa0
4.根据权利要求1所述的一种加压溶剂萃取微生物发酵培养物中物质的方法，其特征是:使用甲醇和乙酸乙酯的混合溶液作为萃取溶剂进行萃取，最佳配比范围为，甲醇70 85%:乙酸乙酯30 15%，V/Vo
5.根据权利要求1所述的一种加压溶剂萃取微生物发酵培养物中物质的方法，其特征是:步骤(I)中所述隔离层为石英砂、玻璃棉或惰性人造棉。
全文摘要
本发明公开了一种加压溶剂萃取微生物发酵培养物中物质的方法，依次包括如下步骤(1)将固体发酵培养物或已将培养基与菌体分离后的液体发酵培养的菌体或已吸附发酵液中物质的载体直接装入萃取釜中；(2)在0.2~15MPa压力和30~200℃温度下，使用单一或混合溶剂对步骤(1)中已装入萃取釜中的微生物发酵培养物进行1次或多次萃取；(3)萃取得到的萃取液进行减压浓缩，冷凝得到的溶剂循环使用；减压浓缩得到的浸膏即为发酵培养物中物质。与现有的溶剂浸提法相比，本发明溶剂消耗量可低至20%，萃取时间可缩短至1/3，同时萃取率可提高40%，并可有效防止培养物中物质氧化变性。
文档编号B01D11/00GK103203117SQ20131009896
公开日2013年7月17日 申请日期2013年3月26日 优先权日2013年3月26日
发明者夏金梅, 许晨, 许建中, 刘芬, 王倩, 廖云莉, 骆祝华, 陈建明, 邵宗泽 申请人:国家海洋局第三海洋研究所