一种基于金表面硼酸类葡萄糖敏感型印迹水凝胶及其制备方法
【专利摘要】本发明为一种基于金表面硼酸类葡萄糖敏感型印迹水凝胶及其制备方法，该方法可分为三步：首先将巯基醇类化合物通过自组装方式在金片表面形成薄膜；然后利用酸酐和羟基的反应，在金片表面引入可聚合的双键；最后以丙烯酰胺基苯硼酸为单体，葡萄糖为模板，N,N-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，通过紫外光引发聚合在金表面合成水凝胶，反应完后洗去葡萄糖，在金片表面留下大量的葡萄糖印记空穴。本发明的基于金表面硼酸类葡萄糖敏感型印迹水凝胶可应用于葡萄糖的特异性识别、固载、传感、富集、分离或检测。
【专利说明】一种基于金表面硼酸类葡萄糖敏感型印迹水凝胶及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于金表面硼酸类葡萄糖敏感型印迹水凝胶的合成，也涉及葡萄糖分子的特异性识别、固载、传感、富集、分离或检测，尤其是涉及到可在人体生理条件下实现葡萄糖的连续检测。
【背景技术】
[0002]葡萄糖是人类赖以生存的食物来源，又是生命体中重要的信息物质，在细胞之间的相互识别、相互作用、水和电解质的输送、癌症的发生和转移、机体的免疫和免疫抑制以及受精和细胞凝集等生物过程中都起着关键作用。因此，研究高灵敏度、高选择性的葡萄糖识别方法具有重要的意义。
[0003]敏感型水凝胶是由具有网状交联结构的高分子和填充于其中的水组成，由于在溶剂中高分子链的构象发生变化从而引起凝胶宏观性质的变化，这类水凝胶能够对外界刺激产生口向应(Jind ich Kopecek, Jiyuan Yang.Hydrogels as smart b1materials,Polymer Internat1nal, 2007, 56: 1078-1098.)。葡萄糖敏感型水凝胶是能够识别环境中葡萄糖分子而产生刺激响应的水凝胶，能发生膨胀、收缩或者溶胶-凝胶相转变等响应行为，可应用于连续的葡萄糖检测。有机硼酸化合物能够与1，2或1，3-二醇化合物选择性结合，现已被广泛应用于葡萄糖等几十种糖类的检测。而基于硼酸基团的葡萄糖敏感型水凝胶近年来也受到了越来越多人们的关注。然而，基于硼酸基团的水凝胶用于葡萄糖检测时往往会存在如下两个问题:(I)硼酸是一种弱的Lewis酸，硼原子一个空轨道没有电子，它与葡萄糖的结合具有PH控制性，在高pH下形成硼酯键，酸性条件下硼酯键则会断开，这使得硼酸基水凝胶在具体应用时受到一定限制，例如在人体生理条件PH 7.4环境下，只有很少量的硼酸可以和糖反应生成稳定性较高的硼酸酯。为了制备在人体PH环境下与葡萄糖结合生成酯的硼酸，需要一种方法来降低硼酸的pKa值(Adrian M.Horgan,Alexander J.Marshall, Simon J.Kewj et al.Crosslinking of phenylboronic acidreceptors as a means of glucose selective holographic detect1n, B1sensors andB1electronics, 2006,21: 1838-1845)。(2)有机硼酸化合物可以与除葡萄糖外几乎所有的1，2或1，3- 二醇类化合物结合，对葡萄糖吸附的特异性并不高。
[0004]分子印迹技术是指以目标分子为模板，将具有结构上互补的功能化单体通过共价或非共价键与模板分子结合，并加入交联剂进行聚合反应，反应完成后将模板分子洗脱出来，形成具有固定空穴大小和形状及有确定排列方式的聚合物的一类技术，相应的交联高聚物即分子印迹聚合物。分子印迹技术因合成的印迹聚合物具有固定空穴大小和形状，能够对模板分子实现专一性识别而使得该技术在分离纯化、抗体模拟、催化以及传感器等领域具有重要的应用前景。尤其是表面印迹技术，由于是在固相基质表面进行的聚合反应，印迹位点分布在基质的表面和外层，具有扩散阻力小、吸附容量高、模板易洗脱等优点而得到了广泛的研究(张栓红，孙昌梅，曲荣君.表面分子(离子)印迹硅胶/聚合物的制备及性能研究进展.高分子通报，2010(4): 17-29.)。
【发明内容】
[0005]本发明为了解决现有基于硼酸基团水凝胶在检测葡萄糖时所存在的技术问题，选取丙烯酰胺基苯硼酸作为葡萄糖的识别基团，并将表面分子印迹技术引入到硼酸基团敏感型水凝胶中，提供了一种基于金片表面的具有较高选择性地结合葡萄糖分子的敏感型印迹水凝胶。该方法首先将巯基醇类化合物通过自组装方式在金片表面形成薄膜；然后利用酸酐和羟基的反应，在金片表面引入可聚合的双键；最后以丙烯酰胺基苯硼酸为单体，葡萄糖为模板，N，N-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，通过紫外光引发聚合在金表面合成水凝胶，反应完后洗去葡萄糖，在金表面留下大量的与葡萄糖高度匹配的印迹空穴。
[0006]本发明的技术方案为:一种基于金表面硼酸类葡萄糖敏感型印迹水凝胶及其制备方法，包括如下步骤:
(I)羟基化:将金片先后分别用丙酮、乙醇、二次蒸馏水超声清洗10 min，气体吹干。将巯基醇类化合物加入到溶剂溶解后，将金片置于上述溶液中，室温下反应2?24 h，依次用无水乙醇和二次蒸馏水将金片冲净，气体吹干；其中，巯基醇类化合物的浓度=0.5?2mmol /I,η
[0007](2)双键化:将一定量的酸酐溶解于溶剂中，加入催化剂，混合均匀，将金片置于上述溶液中，在25?50 °C反应5?20 h后，依次用无水乙醇和二次蒸馏水将金片冲净，气体吹干；其中，酸酐的浓度=0.5?2 mol/L，催化剂的浓度为0.01?0.05 mmol/L。
[0008](3)聚合:将葡萄糖、丙烯酰胺基苯硼酸，加入到二甲基亚砜中，室温搅拌5?24h，然后加入N，N-亚甲基双丙烯酰胺和引发剂，混合均匀后，取0.1?5 uL的混合液均匀地涂在步骤(2)中所述的金片上，室温下N2气氛，置于紫外灯下光引发聚合5?60 min，反应完后用二甲基亚砜反复洗涤，洗去未反应物，再用乙酸和甲醇的混合溶液反复洗涤，直到滤液中检测不到葡萄糖，再用超纯水反复洗涤。将所得凝胶片室温干燥3天，然后真空干燥I天；其中，葡萄糖、丙烯酰胺基苯硼酸、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、引发剂的浓度分别为10?50,50?100,100?200,0.2?0.5 mmol/L，乙酸和甲醇的体积比为I?5: 10。
[0009]所述的步骤(I)中金片的直径为14 mm，金片为金金属片或者是载体上涂布或化学制备有金膜层的材料中的一种。
[0010]所述的步骤(I)中巯基醇类化合物为巯基乙醇、二巯基丙醇、3-巯基丙醇、1-巯基-2-丙醇和3 -巯基己醇中的一种。
[0011]所述的步骤(I)中溶剂为乙醇、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮、异戊烷和苯中的一种。
[0012]所述的步骤(I)和(2)中吹干片子的气体为氮气、氩气和氢气中的一种。
[0013]所述的步骤(2)中酸酐为丁二酸酐、顺丁烯二酸酐、邻苯二甲酸酐和偏苯三酸酐中的一种。
[0014]所述的步骤(2)中催化剂为三乙胺、4-二甲氨基吡啶和吡啶中的一种。
[0015]所述的步骤(2)中溶剂为二甲基亚砜、N，N_ 二甲基甲酰胺、二氯甲烷和苯中的一种。
[0016]所述的步骤(3)中紫外光的波长范围为250?400 nm，紫外光的照射强度为I?100瓦/平方米。
[0017]所述的步骤(3)中引发剂为二苯基乙二酮、2，2-二乙氧基苯乙酮、a，a_ 二甲氧基-a-苯基苯乙酮、2，4，6-三甲基二苯甲酮和2，4- 二乙基硫杂蒽酮中的一种。
[0018]与现有技术相比，本发明的优点是:(1)所选择的单体丙烯酰胺基苯硼酸在人体生理条件pH 7.4下可以和葡萄糖糖反应生成稳定性较高的硼酸酯。(2)采用分子印迹技术能够有效地提高对葡萄糖分子的特异性。由于所述的分子印迹技术属于在固相基质的表面上发生聚合反应的表面分子印迹技术，与传统分子印迹相比，具有对目标离子选择性高、交换阻力低、吸附容量高等优点。(3)本文将巯基醇在金片表面自组装形成的单分子膜具有致密、稳定等特性，有利于后续各步反应。(4)该产品经过后续研究，合成可专一检测葡萄糖分子的生物传感器，并有望植入人体，实现对葡萄糖的连续检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是本发明实施例1的制备流程图。
【具体实施方式】
[0020]以下结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于此。
[0021]实施例1:(1)羟基化:将金金属片片先后分别用丙酮、乙醇、二次蒸馏水超声清洗10 min,氮气吹干。将其置于0.5 mmol/L 二巯基丙醇的乙醇溶液中，室温下反应5 h,依次用无水乙醇和二次蒸馏水将金片冲净，氩气吹干；(2)双键化:将丁二酸酐和三乙胺加入到二甲基亚砜中，其中丁二酸酐的浓度为I mol/L,三乙胺浓度为0.01 mmol/L,混合均勻后，将氨基化金片置于上述溶液中，在25 °C反应5 h后，依次用无水乙醇和二次蒸馏水将金片冲净，氩气吹干；(3)聚合:将葡萄糖、丙烯酰胺基苯硼酸，加入到二甲基亚砜中，室温搅拌10 h,然后加入N, N-亚甲基双丙烯酰胺和a, a-二甲氧基-a-苯基苯乙酮,混合均勻后,用微量注射器移取3 uL的混合液均匀地涂在双键化的金片上，室温下N2气氛，置于紫外灯下光引发聚合5 min，反应完后用二甲基亚砜反复洗涤，洗去未反应物，再用乙酸和甲醇的混合溶液反复洗涤，直到滤液中检测不到葡萄糖，再用超纯水反复洗涤。将所得凝胶片室温干燥3天，然后真空干燥I天；其中，葡萄糖、丙烯酰胺基苯硼酸、N, N-亚甲基双丙烯酰胺、弓丨发剂的浓度分别为20、50、100、0.3 mmol/L,乙酸和甲醇的体积比为1:10。
[0022]另外，用于对照的金表面硼酸类葡萄糖敏感型非印迹水凝胶的合成，步骤(3)除不加入葡萄糖外，其余操作与金表面硼酸类葡萄糖敏感型非印迹水凝胶的制备相同。
[0023]实施例2:(1)羟基化:将镀金硅片先后分别用丙酮、乙醇、二次蒸馏水超声清洗10min，氢气吹干。将其置于I mmol/L 3-巯基丙醇的乙醇溶液中，室温下反应24 h，依次用无水乙醇和二次蒸馏水将金片冲净，氮气吹干；(2)双键化:将顺丁烯二酸酐和吡啶加入到N，N-二甲基甲酰胺中，其中顺丁烯二酸酐的浓度为I mol/L，吡啶浓度为0.02 mmol/L，混合均匀后，将氨基化金片置于上述溶液中，在25 °C反应10 h后，依次用无水乙醇和二次蒸馏水将金片冲净，氩气吹干；(3)聚合:将葡萄糖、丙烯酰胺基苯硼酸，加入到二甲基亚砜中，室温搅拌24 h，然后加入N，N-亚甲基双丙烯酰胺和2，2- 二乙氧基苯乙酮，混合均匀后，用微量注射器移取0.25 uL的混合液均匀地涂在双键化的金片上，室温下N2气氛，置于紫外灯下光引发聚合30 min,反应完后用二甲基亚砜反复洗涤，洗去未反应物，再用乙酸和甲醇的混合溶液反复洗涤，直到滤液中检测不到葡萄糖，再用超纯水反复洗涤。将所得凝胶片室温干燥3天，然后真空干燥I天；其中，葡萄糖、丙烯酰胺基苯硼酸、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、引发剂的浓度分别为40、80、150、0.5 mmol/L,乙酸和甲醇的体积比为4:10。
[0024]实施例3:(1)羟基化:将金金属片先后分别用丙酮、乙醇、二次蒸馏水超声清洗10min,氢气吹干。将其置于1.5 mmol/L 1_巯基_2_丙醇的丙酮溶液中，室温下反应5 h,依次用无水乙醇和二次蒸馏水将金片冲净，氢气吹干；(2)双键化:将邻苯二甲酸酐和4-二甲氨基吡啶加入到二氯甲烷中，其中邻苯二甲酸酐的浓度为2 mol/L, 4-二甲氨基吡啶浓度为
0.05 mmol/L,混合均勻后,将氨基化金片置于上述溶液中，在50 °C反应20 h后,依次用无水乙醇和二次蒸馏水将金片冲净，氮气吹干；(3)聚合:将葡萄糖、丙烯酰胺基苯硼酸，力口入到二甲基亚砜中，室温搅拌5 h，然后加入N，N-亚甲基双丙烯酰胺和二苯基乙二酮，混合均匀后，用微量注射器移取5 uL的混合液均匀地涂在双键化的金片上，室温下N2气氛，置于紫外灯下光引发聚合30 min,反应完后用二甲基亚砜反复洗涤，洗去未反应物，再用乙酸和甲醇的混合溶液反复洗涤，直到滤液中检测不到葡萄糖，再用超纯水反复洗涤。将所得凝胶片室温干燥3天，然后真空干燥I天；其中，葡萄糖、丙烯酰胺基苯硼酸、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、引发剂的浓度分别为30、50、150、0.2 mmol/L，乙酸和甲醇的体积比为3:10。
[0025]实施例4:(1)羟基化:将镀金硅片先后分别用丙酮、乙醇、二次蒸馏水超声清洗10 min，氩气吹干。将其置于2 mmol/L巯基乙醇的异戊烷溶液中，室温下反应10 h，依次用无水乙醇和二次蒸馏水将金片冲净，氩气吹干；(2)双键化:将偏苯二酸酐和吡啶加入到苯中，其中偏苯二酸酐的浓度为0.5 mol/L,卩比唳浓度为0.02 mmol/L,混合均勻后,将氨基化金片置于上述溶液中，在50 °C反应15 h后，依次用无水乙醇和二次蒸馏水将金片冲净，氮气吹干；(3)聚合:将葡萄糖、丙烯酰胺基苯硼酸，加入到二甲基亚砜中，室温搅拌24 h，然后加入N，N-亚甲基双丙烯酰胺和2，4，6-三甲基二苯甲酮，混合均匀后，用微量注射器移取3 uL的混合液均匀地涂在双键化的金片上，室温下N2气氛，置于紫外灯下光引发聚合60 min，反应完后用二甲基亚砜反复洗涤，洗去未反应物，再用乙酸和甲醇的混合溶液反复洗涤，直到滤液中检测不到葡萄糖，再用超纯水反复洗涤。将所得凝胶片室温干燥3天，然后真空干燥I天；其中，葡萄糖、丙烯酰胺基苯硼酸、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、引发剂的浓度分别为50、80、100、0.2 mmol/L,乙酸和甲醇的体积比为2:10。
[0026]实施例5:(1)羟基化:将金金属片先后分别用丙酮、乙醇、二次蒸馏水超声清洗10min,氢气吹干。将其置于2 mmol/L 3-巯基己醇的苯溶液中，室温下反应24 h,依次用无水乙醇和二次蒸馏水将金片冲净，氮气吹干；(2)双键化:将顺丁烯二酸酐和三乙胺加入到N，N-二甲基甲酰胺中，其中顺丁烯二酸酐的浓度为I mol/L，三乙胺浓度为0.01 mmol/L,混合均匀后，将氨基化金片置于上述溶液中，在25 °C反应20 h后，依次用无水乙醇和二次蒸馏水将金片冲净，氮气吹干；(3)聚合:将葡萄糖、丙烯酰胺基苯硼酸，加入到二甲基亚砜中，室温搅拌5 h，然后加入N，N-亚甲基双丙烯酰胺和2，4- 二乙基硫杂蒽酮，混合均匀后，用微量注射器移取4 uL的混合液均匀地涂在双键化的金片上，室温下N2气氛，置于紫外灯下光引发聚合45 min,反应完后用二甲基亚砜反复洗涤，洗去未反应物，再用乙酸和甲醇的混合溶液反复洗涤，直到滤液中检测不到葡萄糖，再用超纯水反复洗涤。将所得凝胶片室温干燥3天，然后真空干燥I天；其中，葡萄糖、丙烯酰胺基苯硼酸、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、引发剂的浓度分别为20、50、150、0.3 mmol/L，乙酸和甲醇的体积比为1:10。
[0027]上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种基于金表面硼酸类葡萄糖敏感型印迹水凝胶及其制备方法，其特征为包括如下步骤:(1)羟基化:将金片先后分别用丙酮、乙醇、二次蒸馏水超声清洗1(T40 min，气体吹干。将巯基醇类化合物加入到溶剂溶解后，将金片置于上述溶液中，室温下反应2?24 h，依次用无水乙醇和二次蒸馏水将金片冲净，气体吹干；其中，巯基醇类化合物的浓度=0.5?2 mmol/L; (2)双键化:将一定量的酸酐溶解于溶剂中，加入催化剂，混合均匀，将金片置于上述溶液中，在25?50 °C反应5?20 h后，依次用无水乙醇和二次蒸馏水将金片冲净，气体吹干；其中，酸酐的浓度=0.5?2 mol/L，催化剂的浓度为0.01?0.05 mmol/L;(3)聚合:将葡萄糖、丙烯酰胺基苯硼酸，加入到二甲基亚砜中，室温搅拌过夜，然后加入N，N-亚甲基双丙烯酰胺和引发剂，混合均匀后，用微量注射器移取0.1?5 uL的混合液均匀地涂在双键化的金片上，室温下N2气氛，置于紫外灯下光引发聚合5?60 min，反应完后用二甲基亚砜反复洗涤，洗去未反应物，再用乙酸和甲醇的混合溶液反复洗涤，直到滤液中检测不到葡萄糖，再用超纯水反复洗涤。将所得凝胶片室温干燥3天，然后真空干燥I天；其中，葡萄糖、丙烯酰胺基苯硼酸、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、引发剂的浓度分别为10?50,50?100、100?200,0.2?0.5 mmol/L，乙酸和甲醇的体积比为1:5?10。
2.如权利要求1所述的一种基于金表面硼酸类葡萄糖敏感型印迹水凝胶及其制备方法，其特征为所述的步骤(I)中金片为金属片或者是载体上涂布或化学制备有金膜层的材料中的一种。
3.如权利要求1所述的一种基于金表面硼酸类葡萄糖敏感型印迹水凝胶及其制备方法，其特征为所述的步骤(I)中巯醇类化合物为二巯基丙醇、3-巯基丙醇、1-巯基-2-丙醇、巯基苯酚和3-巯基丙基-三甲氧基硅烷中的一种。
4.如权利要求1所述的一种基于金表面硼酸类葡萄糖敏感型印迹水凝胶及其制备方法，其特征为所述的步骤(I)中溶剂为乙醇、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮、异戊烷和苯中的一种。
5.如权利要求1所述的一种基于金表面硼酸类葡萄糖敏感型印迹水凝胶及其制备方法，其特征为所述的步骤(I)和(2)中吹干片子的气体为氮气、氩气和氢气中的一种。
6.如权利要求1所述的一种基于金表面硼酸类葡萄糖敏感型印迹水凝胶及其制备方法，其特征为所述的步骤(2)中酸酐为丁二酸酐、顺丁烯二酸酐、邻苯二甲酸酐和偏苯三酸酐中的一种。
7.如权利要求1所述的一种基于金表面硼酸类葡萄糖敏感型印迹水凝胶及其制备方法，其特征为所述的步骤(2)中催化剂为三乙胺、4-二甲氨基吡啶和吡啶中的一种。
8.如权利要求1所述的一种基于金表面硼酸类葡萄糖敏感型印迹水凝胶及其制备方法，其特征为所述的步骤(2)中溶剂为二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和苯中的一种。
9.如权利要求1所述的一种基于金表面硼酸类葡萄糖敏感型印迹水凝胶及其制备方法，其特征为所述的步骤(3)中紫外灯的波长为250?400 nm。
10.如权利要求1所述的一种基于金表面硼酸类葡萄糖敏感型印迹水凝胶及其制备方法，其特征为所述的步骤(3)中引发剂为二苯甲酮、二苯基乙二酮、2，2-二乙氧基苯乙酮、2，4，6-三甲基二苯甲酮和2，4- 二乙基硫杂蒽酮中的一种。
【文档编号】B01J20/291GK104148038SQ201410099220
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年3月18日 优先权日:2014年3月18日
【发明者】戴庆 申请人:苏州康磁医疗科技有限公司