细胞培养显微镜载玻片的改进和相关的改进的制作方法

本发明涉及细胞培养显微镜载玻片，且尤其但不排他地涉及用于在免疫测定(特别是免疫细胞化学(ICC))的领域中成像的细胞培养载玻片。

背景技术：

已知在显微镜载玻片上培育细胞培养物以用于免疫测定目的。大体上，使用者通过将玻璃盖玻片放置到一次性碟片的底部中来在该玻璃上培育细胞。取决于细胞类型，玻璃盖玻片可能被或可能没有被涂覆表面处理物质(例如，聚赖氨酸)以促进细胞粘附到玻璃表面上。所使用的盖玻片尺寸通常范围为12mm的圆形至25mm的正方形至25×75mm的方形。在预定时间，使用者用一对镊子从一次性碟片移除盖玻片，而希望不破坏该易损的玻璃。盖玻片放置到固定剂中，通常为磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的甲醛，但也可为甲醇。这通过将蛋白质交联在一起而将携带的蛋白质化学地固定就位。盖玻片从固定剂移除且在PBS中冲洗。然后，使用者开始以下过程：向盖玻片加入第一抗体，冲洗，加入第二抗体，冲洗，加入DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚细胞核染料)，冲洗，然后加入少量市售的安装介质，以及用密封剂(通常是指甲油)或通过使用硬化安装介质将盖玻片固定到另一玻璃载玻片上。允许该密封剂或安装介质硬化，并且该载玻片组件准备好为夹在两片玻璃之间的染色标记的蛋白质成像。在小心的情况下，可用不同盖玻片重复以上步骤，从而将两个或更多的盖玻片安装到单个玻璃载玻片上。

使用者选择放大倍数以用于检查组装的载玻片。如果物镜需要液体浸没介质，则浸没介质必须在用物镜检查之前加入。一些使用者可使用低放大倍数的空气浸没透镜来粗略地确定焦平面且识别感兴趣的区域，以在较高放大倍数下进行成像。然后移除组装的载玻片，更换物镜，将适当的浸没液体加入到载玻片或物镜上，将载玻片放回显微镜上，并将显微镜重新聚焦到样本上。

这种方法问题重重。事实上，显微镜的最困难的部分是样本准备，且很少有使用者完全理解样本在光学结果中所起的作用。以下是新接触免疫荧光的使用者面临的一些问题。

1.操作玻璃盖玻片：

由于玻璃盖玻片易损且易碎，其很容易被误操作。这在操作期间可能造成玻璃翻转。由于细胞仅在玻璃的一侧上，且肉眼看不到细胞，这导致准备玻璃的错误侧而浪费昂贵或稀有的材料。此外，玻璃覆盖有细胞，在需要镊子来操作玻璃时容易损坏细胞。常见的问题在于，在诸多准备步骤中的一者期间破坏玻璃，导致奇怪形状的样本、浪费的样本和材料以及样本污染。另外，过度操作玻璃可造成样本的错误识别，这可能需要重复实验或导致更糟的不正确的结果。

2.安装玻璃盖玻片：

由于玻璃盖玻片在载玻片上的放置、尺寸和分布大致随机，不存在在不扫描整个载玻片的情况下自动扫描载玻片以找到安装的盖玻片的选择。此外，由于玻璃盖玻片的两侧上都可存在密封剂，且密封剂取决于多种因素可为变化的厚度，因此由于存在高度差异，从一个安装的玻璃盖玻片自动移动到另一个的选择被限制。在载玻片上通常安装有多于一个玻璃盖玻片。由于加入安装介质和安装盖玻片是手动完成的，这些盖玻片通常在不同的焦平面中，其然后需要使用者在每个玻璃盖玻片区域上重新聚焦。由于显微镜的最大问题是找到焦平面，这导致挫败感以及破坏的载玻片。

3.材料选择：

ICC中最常见的问题之一是材料的选择。高数值孔径的透镜专为单一玻璃厚度而设计。存在无数的安装介质供选择，且许多可用的选择造成较差成像。样本(例如，细胞)和检测器(例如，照相机)之间的一切会影响可从样本获得的对比度和分辨率。错误的玻璃厚度导致球面像差和轴向色差。错误的安装介质导致若干像差、高背景和较差的对比度。

4.显微镜、场景选择和样本偏差：

使用显微镜最难的部分之一是找到焦平面。这对于稀疏样本特别困难，但甚至对于密集样本也可能有问题。甚至显微镜“专家”偶尔也会将载玻片安装得上下颠倒，且花费很长时间试图找到焦平面，而后才意识到这个问题。几乎所有使用者都遇到的非常隐匿的问题是选择偏见。显微镜工作者通常基于对细胞的视觉检查来选择要成像的细胞。这导致使用者基于“好细胞”的定义的偏见。这种偏见是潜意识的且难以避免。此外，因为“好细胞”是主观的，这使其他人难以重复实验。即使将收集的图像发送到明确的图像分析，也存在选择偏见。科学家需要场景或细胞选择是无偏见的，但这是极少的情况。这导致可疑的结果，进而产生其他人不可复制的可疑的论文。

US7919319公开了在两个透明板之间培养细胞，透明板间隔开与待培养的细胞尺寸相当的距离，从而提供单层细胞，其可随时间的推移通过显微镜观察。这种技术为细胞培养提供了扭曲的环境，因为大多数细胞在团块中而非在扁平阵列中生长得最好，且细胞废物不太可能被冲走。描述的技术在ICC中很少使用，因为意在不干扰细胞，且因此上面提到的清洗和染色步骤是有问题的。

技术实现要素：

发明人设计了一种解决上述问题的显微镜载玻片。本发明提供了一种根据权利要求1的显微镜载玻片，其具有从属于权利要求1的权利要求限定了优选特征。本发明还提供了一种由权利要求6和从属于其的权利要求所限定的方法。

本发明延伸至本文所公开的特征的任何组合，无论这样的组合是否在本文中明确提及。此外，在组合提及两个或更多的特征的地方，其意在这些特征可单独地要求保护而不扩展本发明的范围。

附图说明

本发明可以多种方式付诸实施，下文参照附图描述其一个说明性实施例，在附图中：

图1示出了显微镜载玻片的平面视图；

图2示出了使用中的载玻片沿图1中的线II-II的剖面图。

具体实施方式

本发明及其目标和优点参照结合附图的以下描述可更好地理解，其中相似的参考标号在附图中表示相似元件。

参照图1和图2，示出了显微镜载玻片10，其包括光学透明的基本平坦的基板20(在此例中为硼硅酸盐玻璃)，基板具有相反的上表面27和下表面28，以及外部塑料模制的周边框架40。框架的外部尺寸符合ANSI/SBS 1-2004和2-2004标准。基板具有0.165mm至0.175mm，优选为0.17mm的基本均匀的厚度。基板包含细胞培养区域22，细胞在其中生长，且根据已有技术执行染色。在此实施例中，示出了两个直径为13mm的圆形区域，但是仅一个区域可利用，或者更多的区域可使用，例如多达30000个微区域可使用。这些区域彼此分开，疏水材料24应用到基板上除区域22之外的所有区域中。对于微区域，疏水材料可通过点阵打印机或类似的技术而应用。疏水材料24用于将井彼此隔离，因为水基液体将避开疏水区域24且细胞将不跨过疏水区域。培养区域22可选地涂覆有α-聚赖氨酸或允许细胞粘附到玻璃上的其它市售材料。同样位于基板上的是与别个不同的标识器26。在此例中，标识器是条形码，其可通过光学装置读取，包括通过载玻片10安装到其上的显微镜。在此实施例中，基板还包括位于框架的一个角落处的对准标记48，且由三个凸起的波纹形成。标记允许载玻片10相对于显微镜的正确定向，且在需要的情况下可通过显微镜读取。

外部框架40使基板20保持就位，且具有连续平坦的上表面42和下表面44。这里，“连续平坦的表面”意思是围绕基板在一个平面上限定不间断回路的表面。表面42和44彼此基本平行。下表面44包括凹窗46，玻璃基板20紧密地配合到其中，使得基板的下表面28定位成与框架的下表面44齐平。框架的上表面42高于基板20的上表面27，从而提供了井32，在初始使用时细胞培养基包含在井32中。

在使用中，包含细胞的介质放置到一个或两个区域22中，盖子(未示出)放置在载玻片10上方，且载玻片置到培养箱(未示出)中。数小时之后，细胞将在该区域中沉积到基板20上，扩散且附着到基板表面上。对于长期培养，包含细胞的介质可在约8小时之后移除，且井32可用另外的介质灌注。细胞将避开疏水材料24，且因此即使当井32被灌注时，井之间也不会发生细胞的混合。此技术大大简化了细胞的生长、固定、清洗和整个ICC方案。

当使用者准备好进行ICC时，从区域22或从井32移除介质，且向每个区域22加入大约100μl(对于13mm区域)的市售的固定剂。根据已知技术进行进一步常规的ICC清洗、培育、清洗、培育、清洗步骤，但不需要像常规技术那样操作易损的盖玻片。根据已知技术使用标记的抗体对感兴趣的蛋白质进行染色。在完成ICC步骤时，大约5μl的常规安装介质加入到每个区域22，且密封的载玻片50放置到框架的上表面42上。这保护区域免于脱水和接触损坏。

载玻片10连同密封的载玻片50(组装的载玻片)一起放置到显微镜系统上。在实施的地方，读取对准标记以将显微镜台和组装的载玻片对准，且条形码标识器26通过系统读取以确定载玻片的标识，且从而确定其内容。通过将条形码交叉参照到已知载玻片的列表，可容易地确定区域22的位置。另外，条形码将包括与别个不同地限定特定载玻片的标识器。以此方式，关于正被成像的特定样本没有歧义，且不需要在载玻片本身上手写标识。浸没油52应用到载玻片上且使用高数值孔径4X物镜54扫描载玻片，以在需要时用于随后的更高分辨率成像。

载玻片10及其上述使用显著增加了包含载玻片的样本的准备和使用的便利性，尤其是对于ICC实验期间的免疫荧光，在那里需要许多载玻片准备步骤。如果需要，外塑料框架40的使用允许自动操作载玻片10，且该框架构造成有助于显微镜扫描过程的自动化。例如，载玻片10具有完全平坦的下表面28/44，其允许物镜(例如，透镜54)扫描该表面而无需承担碰到任何突起的风险。使用与别个不同的标识器减少操作错误的概率，且提供一致的自动成像位置。

虽然已经描述和示出了仅一个实例，但对于本领域技术人员来说将显而易见的是，在不脱离本发明所要求保护的范围的情况下，可对那些实施例进行添加、省略和修改。例如，优选的基板20是玻璃，但也可使用其它透明的材料，例如塑料。框架40优选由塑料形成，但这包括热塑性塑料和热固性塑料。考虑到纤维加固。井32的优选深度为约2mm至6mm，且更优选为3mm至5mm，因为这个尺寸接受大致合适体积的细胞培养基，但可使用更浅或更深的井以适应不同的需要。

描述了条形码26，但可使用其它识别装置，例如RFID装置可用于自动将识别数据和其它数据写入载玻片，以便记录其准备进度和随后进行的任何成像的结果。

与图2相比，载玻片10可倒置，使得在成像期间从上观察。在这种情况下，术语上部、下部等应当相应地理解，且不意在关于图2所示的载玻片10的定向而为限制性的。