一种同时具有阳离子交换和反相保留能力的吸附材料及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种分离材料，尤其涉及一种同步富集分离微量黄酮和生物碱的固相萃取材料及其制备方法和在复杂生物样品分析的应用。

背景技术：

中药药效物质基础研究是中药研究的核心内容之一，也是中药现代化的关键所在，但由于中药成分的复杂性，中药效物质基础研究非常困难，已成为制约中药发展公认的瓶颈问题。中药化学成分是中药药效产生的物质基础，从药理学角度来看，被生物体吸收的成分才有机会成为潜在的有效成分。因此，研究生物样品中的中药有效成分变化，能够为明确中药药效、物质基础及作用机制提供实验依据。生物样品包括血液、细胞培养液、尿液、组织液、组织匀浆液等多种类型，普遍存在样品基质非常复杂和有效成分浓度很低两个问题，需要采取适当的分离、净化和富集等样品处理技术，增加检测灵敏度和准确度，同时降低对整个检测系统的污染。

生物碱和黄酮是两类重要的天然活性物质，广泛分布于多种药物植物中。其中生物碱类具有降血压、抗心律失常、抗血小板聚集、降血糖、逆转肿瘤耐药性、抗氧化等药理作用；黄酮类具有清除自由基、抗氧化、抑制肿瘤细胞等多种生物活性。因此，开发和运用现代分离分析技术分离和定量分析生物样品中的生物碱和黄酮成分，然后进行药效筛选和药理实验，能够更为科学合理地利用药用植物资源，极有可能开发出新型天然药物。

目前生物碱的提取方法包括酸水提取法、乙醇提取法和离子交换树脂法等。黄酮的提取方法主要有溶剂提取法、微波提取法、超声波提取法、酶解法、超临界流体萃取法、双水相萃取分离法、半仿生提取法等。但以上方法只能用于药材中生物碱或黄酮的富集分离，不能用于样品量较少，且基体复杂的生物样品分析。由于生物样品的样品量少，基体复杂，生物样品前处理一般采用固相萃取小柱或液液萃取法，但目前尚未见到能够同时分离富集生物样品中生物碱和黄酮的样品前处理方法。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是设计了一种同时具有阳离子交换和反相保留能力的吸附材料，本发明的第二个目的是提供上述的吸附材料的制备方法，本发明的第三个目的是提供上述的吸附材料的应用。本发明用于同步富集分离生物样品中的生物碱和黄酮，与高效液相色谱联合使用，定量分析生物碱和黄酮成分，为中药药效物质基础研究提供实验装置及实验方法。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种同时具有阳离子交换和反相保留能力的吸附材料，该吸附材料由苯乙烯-二乙烯苯聚合物微球的磺化修饰制得，苯乙烯-二乙烯苯聚合物微球中含有0.1%~20%的纳米碳管。

作为优选，所述的苯乙烯-二乙烯苯聚合物微球中含有1%~15%的纳米碳管。再优选，所述的苯乙烯-二乙烯苯聚合物微球中含有5%~12%的纳米碳管。

作为优选，所述的纳米碳管采用多壁碳纳米管和单壁碳纳米管中的一种或两种混合。

作为优选，所述的苯乙烯-二乙烯苯聚合物中苯乙烯和二乙烯基苯单体的比为：1:10~10:1。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种制备所述的吸附材料的方法，该方法采用种子聚合方法，该方法包括以下的步骤：

1）种子溶液的制备：在反应容器中加入90~95%乙醇水溶液、聚吡咯烷酮；通氮气除去氧气，把反应装置的温度恒定设为60~80℃；加入苯乙烯、偶氮二异丁腈，在氮气保护下，搅拌反应20~30小时后停止加热，反应结束后将种子乳液用水反复清洗抽滤，再用无水乙醇洗涤，转移至0.1~0.5%质量百分比浓度的十二烷基磺酸钠溶液中分散保存；

2）微球的制备：在种子溶液中加入苯乙烯，二乙烯基苯，甲苯，过氧化苯甲酰、十二烷基磺酸钠，聚乙二醇水溶液和碳纳米管；将该混合液超声分散至上层无油滴，然后在室温下搅拌20~30小时；通氮气，水浴温度升温至60~80℃，搅拌反应20~30小时；反应所得乳液用热水反复清洗抽滤，至无泡沫时用无水乙醇洗涤后真空干燥，再用甲苯作为提取溶剂，索氏抽提60~80小时，烘干备用；

3）微球的磺化修饰：将微球分散在浓硫酸中，在35~45℃水浴中超声0.1~0.5小时，得到悬浮液用水稀释后抽滤，然后用水洗至pH值7，过滤后，真空干燥。

作为优选，所述的步骤1）种子溶液的制备中个成分的质量比为乙醇水溶液：苯乙烯：聚吡咯烷酮：偶氮二异丁腈=40~60:4~6：0.4~0.6~0.1~0.3。

作为优选，所述的步骤2）中按重量百分比计：

聚乙二醇水溶液 80~95%

苯乙烯 1~5%

二乙烯基苯 2~10%

甲苯 4~10%

过氧化苯甲酰 0.02~0.1%

十二烷基磺酸钠 0.1~0.5%

碳纳米管 0.1~1%。

为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：

上述的吸附材料用于生物碱和黄酮同时分离富集的固相萃取材料。

一种生物碱和黄酮同时分离富集的方法，该方法包括以下的步骤：

1）吸取的生物样品于离心管中离心后取上清液，转移至另一只干净的离心管中备用；

2）加入缓冲溶液与离心管中，与样品混合均匀，缓冲溶液的pH范围为4-7；

3）加入权利要求1~4任意一项权利要求所述的吸附，超声混匀，进行萃取；

4）离心后去除上层清液，加入洗脱溶剂洗脱；

5）离心后吸取上层清液，以氮气吹干。

所述的生物样品包括：细胞培养液、组织液、血清、血浆、尿液、组织匀浆液、唾液、乳汁、泪液、胆汁、胃液、胰液、粪便中的一种；缓冲溶液类型包括磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、邻苯二甲酸缓冲液中的一种；洗脱溶剂选用甲醇、乙腈、二氯甲烷、甲醇-氨水混合溶液、乙腈-氨水混合溶液、二氯甲烷-二乙胺混合溶液、二氯甲烷-三乙胺混合溶液、甲醇-二乙胺混合溶液、甲醇-三乙胺混合溶液、乙腈-二乙胺混合溶液、乙腈-三乙胺混合溶液中的一种。

本发明设计了一种同时具有阳离子交换和反相保留能力的吸附材料，采用碳纳米管增强其对生物碱和黄酮的保留能力，将该吸附材料置于生物样品中，能够同步富集分离样品中的生物碱和黄酮成分，洗脱后采用高效液相色谱进行定量检测。该材料及方法主要用于生物碱和黄酮的同时定量分析，其他采用的混合保留模式材料在化学结构、工作原理上均与本发明存在明显差异。

本发明由于采用了上述的固相萃取材料及应用步骤，具有以下的特点：

1、样品净化高效快速

由于目前用于富集黄酮和生物碱成分的固相萃取材料，大多只能用于单类成分的富集，不能实现黄酮和生物碱的同步富集，且大多吸附容量小，只能用于样品量大（一般大于10 mL）、目标成分含量较高（一般大于5 mg/mL）的样品中，不能用于样品量小、且目标成分含量低的生物样品。本发明的固相萃取材料具有离子交换和反相保留双重吸附能力，且吸附容量大，能够用于样品量小（最低仅用0.1mL），同时吸附生物样品中微量黄酮和生物碱（成分浓度最低可到0.002mg/mL），萃取效率显著提高。

2、吸附容量可调

本发明的固相萃取材料及其应用方法，可针对不同的目标物质和样品，调节碳纳米管用量与磺化修饰时间，方便调节离子交换和反相吸附容量，灵活选择多种萃取溶剂，通过调整不同的吸附容量、溶剂类型、用量和萃取时间，提供多样化的实验数据，满足不同生物样品的分析要求。

3、萃取方法简便

目前的固相萃取普遍采用固相萃取柱或层析柱，所需固相萃取材料用量较大（一般大于2g），有机溶剂用量也较大（一般大于5mL），且需要较高的实验技巧，操作繁琐耗时。本发明所用的固相萃取法是不需要额外的固相萃取柱或层析柱，通过分散固相萃取材料于样品中实现目标成分的吸附。萃取过程简便可控，结果重现性好，能够为生物样品的色谱分析提供可靠的样品前处理装置。

4、应用前景良好

本发明所采用的制备材料是各类实验室常用的实验耗材，萃取材料如萃取溶剂和容器也应用广泛，取材方便。通过本发明的制备方法，可以方便地合成所需固相萃取材料，开展样品前处理实验，且该材料可以多次重复使用，能够为减少样品前处理时间，降低实验费用，发挥积极的作用。

附图说明

图1固相萃取材料的扫描电镜图A：不含碳纳米管的固相萃取材料；B：含碳纳米管的固相萃取材料；C：不含碳纳米管的固相萃取材料（局部放大图）；D：含碳纳米管的固相萃取材料（局部放大图）。

图2 检测波长为225nm的HPLC色谱分离图 A：标准溶液；B：破骨细胞培养液样品；C：大便样品；D：尿液样品；E：成骨细胞培养液样品。色谱峰1：木兰花碱。

图3 检测波长为270nm的HPLC色谱分离图 A：标准溶液；B：淫羊藿提取液；C：破骨细胞培养液样品；D：大便样品；E：尿液样品；F：成骨细胞培养液样品。色谱峰1：表小檗碱；色谱峰2：药根碱；色谱峰3：巴马丁；色谱法4：朝藿定A；色谱峰5：朝藿定B；色谱峰6：朝藿定C；色谱峰7：淫羊藿苷。

具体实施方式

1、吸附材料的制备

1）试剂的前处理

苯乙烯：将50 mL苯乙烯装入减压蒸馏装置中，减压蒸馏去除阻聚剂，收集馏分放入棕色试剂瓶中4℃密封保存备用。

二乙烯基苯：将50mL二乙烯基苯装入减压蒸馏装置中，减压蒸馏去除阻聚剂，收集馏分放入棕色试剂瓶中4℃密封保存备用。

偶氮二异丁腈：在25℃下用无水乙醇重新溶解偶氮二异丁腈，配制成饱和溶液，过滤后将饱和溶液冷却静置重结晶，将警惕用无水乙醇洗涤，真空干燥，放入棕色试剂瓶中4℃密封保存备用。

过氧化苯甲酰：在25摄氏度将过氧化苯甲酰用氯仿配制成饱和溶液，过滤后加入等体积甲醇，待其自然挥发、析出晶体后抽滤、用少量甲醇洗涤后，真空干燥，放入棕色试剂瓶中4℃密封保存备用。

碳纳米管：将1500mg多壁碳纳米管或单壁碳纳米管分散在100mL浓硫酸和浓硝酸的混合溶液中，其中浓硫酸和浓硝酸的体积比为3:1。在10-50℃水浴中超声12小时，得到悬浮液用水稀释后抽滤，然后用水洗至pH值7，过滤后，真空干燥，放入试剂瓶中4℃密封保存备用。

2）吸附材料的制备

种子的制备：在1000mL三颈瓶中加入95%乙醇水溶液50mL、聚吡咯烷酮0.5g；通氮气60min除去氧气，把反应装置的温度恒定设为70℃；加入苯乙烯5g、偶氮二异丁腈0.2g，在氮气保护下，搅拌反应24小时后停止加热，反应借宿后将种子乳液用水反复清洗抽滤，再用无水乙醇洗涤5次，转移至0.2%十二烷基磺酸钠溶液中分散保存。

微球的制备：在1000mL三颈瓶中加入5g苯乙烯，10g二乙烯基苯，14g甲苯，0.2g过氧化苯甲酰、0.8g十二烷基磺酸钠，250mL 1%聚乙二醇水溶液和1500 mg碳纳米管。将该混合液超声分散至上层无油滴，然后在室温下搅拌24小时。通氮气，水浴温度升温至70℃，搅拌反应24小时。反应所得乳液用热水反复清洗抽滤，至无泡沫时用无水乙醇洗3次后真空干燥，再用甲苯作为提取溶剂，索氏抽提72小时，烘干备用。

微球的磺化修饰：将微球分散在100mL浓硫酸中，在40℃水浴中超声0.2小时，得到悬浮液用水稀释后抽滤，然后用水洗至pH值7，过滤后，真空干燥，放入试剂瓶中保存备用。制备所得微球中碳纳米管含量约为10%。

3）生物样品制备

淫羊藿提取液：称取100g淫羊藿药材于2000mL圆底烧瓶中，加入1000mL水，加热提取2小时，过滤，滤渣再用1000mL水提取2次，合并滤液，减压蒸馏浓缩即为淫羊藿提取液，生药含量为0.38g/mL。

成骨细胞培养液：成骨细胞密度为1×10⁵，培养液中加入淫羊藿提取液，最终含量（以生药量计）为1.90mg/mL。经24小时后，吸取0.5mL细胞培养液，过滤后即为成骨细胞培养液样品。

破骨细胞培养液：破骨细胞密度为1×10⁵，培养液中加入淫羊藿提取液，最终含量（以生药量计）为1.90mg/mL。经24小时后，吸取0.5mL细胞培养液，过滤后即为破骨细胞培养液样品。

大鼠尿液：清洁级雌性大鼠，体重为200g，给药剂量为3.80g/kg/天，给药3天，1天1次。收集第三天大鼠尿液，减压蒸馏浓缩至干，加入1mL纯水将残渣全部溶解，过滤后即为大鼠尿液样品。

大鼠大便样品：清洁级雌性大鼠，体重为200g，给药剂量为3.80g/kg/天，给药3天，1天1次。收集第三天大鼠大便。称取5g大鼠大便，加入10mL纯水，匀浆，离心后取上清液，浓缩至干，加入1mL纯水将残渣全部溶解，过滤后为大鼠大便样品。

4) 固相萃取步骤：

吸取0.1mL生物样品于离心管中。离心管体积为1.5mL。加入0.2mL磷酸盐缓冲液（pH为5.8）与离心管中，与样品混合均匀。加入10mg固相萃取材料，超声混匀，萃取2min。离心后去除上层清液，加入0.1mL洗脱溶剂。洗脱溶剂为甲醇-氨水混合溶液（80:20，v/v）。离心后吸取上层清液，以氮气吹干，用0.1mL乙腈溶解，用高效液相色谱分析。

5）生物样品中淫羊藿黄酮和生物碱含量测定结果

采用外标法，计算实际样品淫羊藿含量，结果见表1。

表1. 生物样品中淫羊藿黄酮和生物碱含量

^an.a.：未检出。