一种超顺磁-等离子体复合微球及其制备方法与流程

本发明涉及生物材料领域，具体涉及一种超顺磁-等离子体复合微球。

背景技术：

超顺磁氧化铁纳米颗粒具备优良的生物相容性，并能在外加磁场作用下实现目标分子的靶向富集，因而在生物分子的分离纯化、细胞分选、疾病标志物体外诊断以及环境污染物富集以及监测等方面有着巨大的应用潜力。在众多磁性纳米颗粒中，粒径小于20nm的fe3o4纳米颗粒由于具有超顺磁性、制备相对简单以及可被生物体降解利用的特点而被广泛应用到生物分子分离纯化、细胞标记、临床磁共振成像及药物靶向递送等生物医学领域。一方面，在外加磁场作用下，小尺寸fe3o4表现出高的饱和磁化强度，撤去磁场后fe3o4无剩磁。这一性质保证了纳米颗粒在生物环境中的胶体稳定性；另一方面，fe3o4易于修饰的表面物理化学特性适于纳米载体的表面功能化。但由于单一fe3o4纳米颗粒的磁响应能力很弱，很难在外加磁场作用下实现快速、有效的富集。虽然增大fe3o4晶体尺寸可显著提高颗粒的磁响应能力，例如采用直径为100nm的fe3o4纳米球或长度为200～300nm的梭形fe2o3粒子作为功能化载体的核心，但超过氧化铁的超顺磁临界尺寸(20nm)会导致剩磁的产生，从而影响纳米载体的在生物体系中的胶体稳定性。

以小尺寸(小于10nm)氧化铁纳米颗粒形成团簇结构或修饰到纳米模板表面是提高磁响应性能同时保持超顺磁特征的有效途径。团簇化方法通常采用表面活性剂(如f127、tween80等)、两亲性聚合物(如疏水链改性的聚乙烯亚胺、聚丙烯酸等)或硅烷偶联剂等将疏水磁性纳米颗粒包裹至胶束中来制备纳米颗粒聚集体；将铁前躯体在多元醇体系中进行溶剂热反应或高温热解也可以获得高饱和磁化强度的氧化铁纳米团簇，并将制备过程简化。然而，以上方法均存在颗粒尺寸以及均一性难以控制等缺陷。将磁性纳米颗粒与模板表面通过配位作用、共价偶联或静电吸引等方式结合均可获得均一性好并且尺寸可控的超顺磁复合纳米球，但目前主要存在模板表面磁颗粒负载密度低、材料修饰-组装过程复杂等问题。

多巴胺自聚合是一种新兴的仿生合成聚合物纳米颗粒以及对多种基体材料进行表面改性的有效途径。以聚多巴胺颗粒为纳米模板的优势不仅在于其合成方法的简单、可控，更在于其优于常规模板(如聚苯乙烯)的高活性表面，即通过大量邻苯二酚基团直接螯合金属原子。目前已发展了多种基于邻苯二酚与fe原子配位作用的氧化铁纳米颗粒的表面修饰方法，以获得性质稳定的水溶性氧化铁纳米颗粒，表明以聚多巴胺为亲和模板，有望突破颗粒组装密度上的限制，获取尺寸均一且快速磁响应的超顺磁微球。

将贵金属(例如au)纳米颗粒的表面等离子体效应与磁性载体相结合，可赋予载体优异的光学传感效应以及催化效应等，进而在基于磁珠捕获的等离子增强荧光免疫分析、可循环型表面增强拉曼散射基底材料以及可回收型纳米催化剂等领域有巨大的应用潜力。由金属纳米结构表面等离子体共振产生的电磁场增强，在对荧光或拉曼探针的信号增强中起到了主导作用。而电磁场增强主要存在于金属纳米结构中颗粒之间的细小间隙中。以贵金属纳米颗粒或其多聚体在基底材料上进行紧密堆积后可获得由颗粒之间相互耦合而形成的众多增强热点。目前，将磁性载体与贵金属壳层进行复合的策略主要分为形成异质结构、共价偶联以及通过二氧化硅等无机壳层包覆等等。因氧化铁本身以及二氧化硅对au、ag等离子的亲和性低，一般难以实现贵金属颗粒的紧密堆积。同时，多数方案需事先合成贵金属颗粒再与载体进行组装，过程复杂。因此，以原位生长技术实现磁性载体表面贵金属颗粒的紧密包载，从而制备高性能超顺磁-等离子体复合基底材料，是该技术领域亟待解决的关键问题。

总体来讲，当前制备超顺磁-等离子体微球技术的主要缺点为：所用纳米模板不具备金属亲和性，导致颗粒包覆密度低，磁响应差；多数方案需额外进行模板的表面基团改性，以及额外制备用于组装的超顺磁纳米颗粒；制备超顺磁-贵金属复合微球亦需要经历金种的合成以及组装过程，导致制备过程复杂、贵金属颗粒包覆密度低，等离子效应欠佳。本发明的目的是采用一种天然的金属亲和性模板(聚多巴胺)一步合成高质量超顺磁微球，进一步经多巴胺修饰后原位合成贵金属外壳，获得超顺磁-等离子体复合微球。

技术实现要素：

本发明公开了一种具有超顺磁响应以及等离子体光学效应复合微球的制备方法，旨在提供一种颗粒单分散性好、氧化铁负载量高、贵金属颗粒紧密堆积的高性能纳米诊断分析平台以及生物纯化平台。通过类途径的多巴胺自聚合工艺，获取具有较宽尺寸调控范围以及高度均一性的聚多巴胺微球模板。在无水无氧条件以及多元醇体系中采用高温热解法制备高结晶度以及紧密负载的氧化铁颗粒修饰层，获得单分散超顺磁微球。以多巴胺配体替换方式活化氧化铁颗粒表面，进而以原位成核及生长技术获取紧密包裹的金纳米颗粒修饰层，制备单分散、快速磁响应以及等离子光学效应复合微球。

发明所要解决的技术问题是，提供一种尺寸均一可控、具有超顺磁响应以及等离子体光学效应复合微球的制备方法。

本发明一个方面提供了一种基于聚多巴胺、四氧化三铁以及金纳米颗粒的超顺磁-等离子体复合微球，其特征在于：①以聚多巴胺为天然铁亲和模板，原位生长制备氧化铁颗粒高密度负载的超顺磁微球，具备粒径高度均一、尺寸可调控以及磁响应快速的优势；②通过au原位成核及生长技术，制备金纳米颗粒紧密包覆的超顺磁微球，其包覆密度可控，包覆均匀，具备优良的表面等离子体光学特性。

其中，一种聚多巴胺微球模板的合成方法，其特征在于：①采用类体系合成，其中包含水、乙醇、氨水以及多巴胺盐酸盐，加入氨水的体积为2.2～0.4ml，所合成聚多巴胺微球的尺寸为100nm～600nm。

本发明另一方面提供了一种聚多巴胺模板化超顺磁微球的合成方法，其特征在于：所选合成体系为多元醇-有机铁高温热解体系。其中，多元醇为三甘醇或四甘醇中的至少一种；聚多巴胺微球的尺寸为100nm～600nm；乙酰丙酮铁的加入量为80～240mg；两个阶段的反应温度分别为210℃及290℃。

本发明还公开了一种氧化铁壳层表面金种的原位负载方法，其特征在于：氧化铁颗粒表面在醇溶液中经过多巴胺分子配体替换(活化)，其中醇为甲醇或乙醇中的至少一种，反应方式为超声或涡旋混合中的至少一种；在加入还原剂前，haucl4溶液需要在冰浴条件下与超顺磁微球孵育5～20min；以硼氢化钠为还原剂负载金种。

本发明还公开了一种致密的金纳米壳的生长方法，其特征在于：在金种负载的超顺磁微球溶液中交替加入au⁺前驱体以及抗坏血酸溶液，加入的总次数为5～10次。其中au⁺前驱体的制备方法为：向新配置的k2co3溶液(50mm)中逐滴加入一定体积的haucl4溶液(50mm)并搅拌至溶液无色为止。

具体地，本发明提供了一种超顺磁-等离子体复合微球的制备方法，其包括以下步骤：

1)聚多巴胺微球合成：以氨水催化多巴胺自聚合，形成聚多巴胺微球；

2)超顺磁微球的合成：在无水无氧条件下，以多元醇-有机铁高温热解法在聚多巴胺微球表面负载氧化铁颗粒；

3)超顺磁微球的表面活化：以多巴胺配体活化氧化铁颗粒表面；

4)超顺磁微球表面金种生长：在超顺磁微球表面原位形成金种；

5)超顺磁微球表面金纳米壳的生长：在金种上原位生长，获得金纳米颗粒修饰层。

在一个具体实施方案中，其包括以下步骤：

1)聚多巴胺微球合成：

将多巴胺水溶液加入低分子醇、超纯水和氨水的混合液中，反应至完全，离心收集沉淀，以水进行洗涤获得聚多巴胺微球；

2)超顺磁微球的合成：

将聚多巴胺微球以低分子醇溶解，并加入乙酰丙酮铁和多元醇，减压去除低分子醇，在惰性气体下升温至190-210℃反应1-3小时，继续升温至280℃以上至反应完全，加入有机溶剂后磁分离，并以有机溶剂进行洗涤，获得在聚多巴胺微球表面负载有氧化铁颗粒的超顺磁微球；

3)超顺磁微球的表面活化：

将超顺磁微球分散于有机溶剂中，加入多巴胺混合至超顺磁微球表面进行配位结合，将活化后的超顺磁微球分离，洗涤后以超纯水分散，获得活化的超顺磁微球分散液；

4)超顺磁微球表面金种生长：

在冰浴条件下，向活化的超磁微球分散液中逐滴加入氯金酸(haucl4)溶液，搅拌孵育后，加入还原剂(硼氢化钠)溶液至超顺磁微球上负载有金种，磁性分离后洗涤，得到负载金种的超顺磁微球分散液；

5)超顺磁微球表面金纳米壳的生长：

在负载金种的超顺磁微球分散液中加入au⁺前驱体溶液，反应1-10分钟，再加入抗环血酸溶液反应1-10分钟，交替加入au⁺前驱体溶液和抗坏血酸溶液5～10次，磁性分离并洗涤后获得超顺磁-等离子体复合微球；

其中，au⁺前驱体溶液通过向k2co3溶液中逐滴加入haucl4溶液，反应至溶液无色获得。

在一个具体实施方案中，步骤1)中氨水与多巴胺的摩尔比为2：1～11：1；

优选地，所得聚多巴胺微球的尺寸为100nm-600nm。

在一个具体实施方案中，步骤2)中聚多巴胺微球与乙酰丙酮铁的质量比为1：1～1：5。优选地，聚多巴胺微球与乙酰丙酮铁的质量比为1：1.6～1：4.8

在一个具体实施方案中，步骤3)中超顺磁微球与多巴胺的质量比为1：3～1：8(优选为1：5)。

在一个具体实施方案中，步骤4)中超磁微球与haucl4的质量比为20：1～30：1(优选为24：1)；haucl4与nabh4的摩尔比为1：10～1：16(优选为1：13.6)。

在一个具体实施方案中，au⁺前驱体溶液的配制中，k2co3溶液与haucl4溶液的摩尔比为15：1～25：1(优选为20：1)。

本发明还提供了以上述方法制备得到的超顺磁-等离子体复合微球。

本发明还提供一种超顺磁-等离子体复合微球，其特征在于，其具有聚多巴胺微球的内核、内核上负载有原位生长的氧化铁颗粒，氧化铁颗粒外包覆有多巴胺配体以及原位成核生长的金纳米颗粒外壳；优选地，聚多巴胺微球的尺寸为100nm-600nm(优选为100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm)。

本发明还提供了一种在表面负载氧化铁的颗粒表面原位生成贵金属颗粒的方法，其包括以下步骤：

i)活化氧化铁表面：氧化铁颗粒表面在醇溶液中经过多巴胺分子配体替换活化，优选地，醇溶液为甲醇或乙醇中的至少一种，活化的反应方式为超声或涡旋混合中的至少一种；

ii)原位形成金种：硼氢化钠为还原剂负载金种；

iii)在金种上原位生长，形成金纳米壳。

有益效果

1、聚多巴胺模板可通过类途径高效、大量且(尺寸)可控合成。

2、聚多巴胺微球具备天然的铁亲和性，与氧化硅及聚苯乙烯微球相比，无需任何表面改性。

3、选用聚多巴胺-多元醇-有机铁高温热解体系，一步合成高结晶度及紧密负载的氧化铁修饰层，实现快速超顺磁响应。

4、以原位金种负载及生长方式制备紧密堆积的金纳米壳，具有优良及可调谐的等离子体光学效应。

5、该制备方法简便易行，便于重复及推广。

附图说明

图1为超顺磁-等离子体复合微球的制备示意图。

图2为聚多巴胺负载氧化铁微球的tem(a)及hrtem(b)照片。

图3为超顺磁-等离子体复合微球的tem(a)及hrtem(b)照片。

图4为超顺磁-等离子体复合微球的室温磁滞回线。

图5为超顺磁-等离子体复合微球在金壳生长过程中的紫外-可见吸收光谱图(以箭头指示方向依次为加入1、2、3、4、6、8、10次au⁺与抗坏血酸溶液)。

具体实施方式

实施例1：

(1)量取40ml乙醇、90ml超纯水以及2.2ml氨水，倒入250ml反应瓶中。称取0.5g多巴胺盐酸盐并溶解于10ml水中，在剧烈搅拌下快速加入上述混合溶液中，在室温下磁力搅拌30h。将溶液离心收集沉淀并水洗数次，得到100nm的聚多巴胺微球。

(2)将聚多巴胺微球(干重约50mg)溶于0.5ml乙醇并加入50ml两口反应瓶中。随后加入120mg乙酰丙酮铁和10ml三甘醇。在真空条件下将溶液温度升至70℃并保持15min以上以除去乙醇。向瓶中充入氮气或氩气后升温至210℃并磁力搅拌2h；在该惰性气体氛围下继续升至290℃并搅拌1h。将所得超顺磁微球用乙醇洗涤；

(3)将20mg超顺磁微球分散于40ml乙醇中，加入0.1g多巴胺盐酸盐并超声15min。将复合微球磁分离，并用水洗涤后分散至20ml超纯水中；

(4)将上述20ml磁微球分散液至于冰浴中冷却20min后，向其中逐滴加入50μlhaucl4溶液(50mm)并搅拌10min。将340μl新配置的硼氢化钠溶液(0.1m)快速注入上述溶液并剧烈搅拌5min。将该磁微球用水洗涤2次，分散于20ml超纯水中；

(5)向新配置的10mlk2co3溶液(50mm)中逐滴加入500μlhaucl4溶液(50mm)，搅拌至溶液无色。向上述20ml磁微球分散液中逐滴加入au⁺前驱体1ml并磁力搅拌3min；向上述溶液中逐滴加入新配置的50mm抗环血酸溶液1ml并磁力搅拌3min；按照上述步骤交替加入au⁺前驱体溶液以及抗环血酸溶液5次，待反应结束后，将复合微球用水洗涤2次。

实施例2：

(1)量取40ml乙醇、90ml超纯水以及0.68ml氨水，倒入250ml反应瓶中。称取0.5g多巴胺盐酸盐并溶解于10ml水中，在剧烈搅拌下快速加入上述混合溶液中，在室温下磁力搅拌30h。将溶液离心收集沉淀并水洗数次，得到370nm的聚多巴胺微球；

(2)将聚多巴胺微球(干重约50mg)溶于0.5ml乙醇并加入50ml两口反应瓶中。随后加入120mg乙酰丙酮铁和10ml三甘醇。在真空条件下将溶液温度升至70℃并保持15min以上以除去乙醇。向瓶中充入氮气或氩气后升温至210℃并磁力搅拌2h；在该惰性气体氛围下继续升至290℃并搅拌1h。将所得超顺磁微球用乙醇洗涤；

(3)将20mg超顺磁微球分散于40ml乙醇中，加入0.1g多巴胺盐酸盐并涡旋混合15min。将复合微球磁分离，并用水洗涤后分散至20ml超纯水中；

(4)将上述20ml磁微球分散液至于冰浴中冷却20min后，向其中逐滴加入50μlhaucl4溶液(50mm)并搅拌10min。将340μl新配置的硼氢化钠溶液(0.1m)快速注入上述溶液并剧烈搅拌5min。将该磁微球用水洗涤2次，分散于20ml超纯水中；

(5)向新配置的10mlk2co3溶液(50mm)中逐滴加入500μlhaucl4溶液(50mm)，搅拌至溶液无色。向上述20ml磁微球分散液中逐滴加入au⁺前驱体1ml并磁力搅拌3min；向上述溶液中逐滴加入新配置的50mm抗环血酸溶液1ml并磁力搅拌3min；按照上述步骤交替加入au⁺前驱体溶液以及抗环血酸溶液8次，待反应结束后，将复合微球用水洗涤2次。

实施例3：

(1)量取80ml乙醇、180ml超纯水以及1.36ml氨水，倒入500ml反应瓶中。称取1.0g多巴胺盐酸盐并溶解于20ml水中，在剧烈搅拌下快速加入上述混合溶液中，在室温下磁力搅拌30h。将溶液离心收集沉淀并水洗数次，得到370nm的聚多巴胺微球；

(2)将聚多巴胺微球(干重约100mg)溶于1.0ml乙醇并加入100ml两口反应瓶中。随后加入240mg乙酰丙酮铁和20ml三甘醇。在真空条件下将溶液温度升至70℃并保持15min以上以除去乙醇。向瓶中充入氮气或氩气后升温至210℃并磁力搅拌2h；在该惰性气体氛围下继续升至290℃并搅拌1h。将所得超顺磁微球用乙醇洗涤；

(3)将40mg超顺磁微球分散于80ml乙醇中，加入0.2g多巴胺盐酸盐并超声15min。将复合微球磁分离，并用水洗涤后分散至40ml超纯水中；

(4)将上述40ml磁微球分散液至于冰浴中冷却20min后，向其中逐滴加入100μlhaucl4溶液(50mm)并搅拌10min。将680μl新配置的硼氢化钠溶液(0.1m)快速注入上述溶液并剧烈搅拌5min。将该磁微球用水洗涤2次，分散于40ml超纯水中；

(5)向新配置的20mlk2co3溶液(50mm)中逐滴加入1mlhaucl4溶液(50mm)，搅拌至溶液无色。向上述40ml磁微球分散液中逐滴加入au⁺前驱体2ml并磁力搅拌3min；向上述溶液中逐滴加入新配置的50mm抗环血酸溶液2ml并磁力搅拌3min；按照上述步骤交替加入au⁺前驱体溶液以及抗环血酸溶液8次，待反应结束后，将复合微球用水洗涤2次。

实施例4：

(1)量取80ml乙醇、180ml超纯水以及0.8ml氨水，倒入500ml反应瓶中。称取1g多巴胺盐酸盐并溶解于20ml水中，在剧烈搅拌下快速加入上述混合溶液中，在室温下磁力搅拌30h。将溶液离心收集沉淀并水洗数次，得到600nm的聚多巴胺微球；

(2)将聚多巴胺微球(干重约50mg)溶于0.5ml乙醇并加入50ml两口反应瓶中。随后加入80mg乙酰丙酮铁和10ml三甘醇。在真空条件下将溶液温度升至70℃并保持15min以上以除去乙醇。向瓶中充入氮气或氩气后升温至210℃并磁力搅拌2h；在该惰性气体氛围下继续升至290℃并搅拌1h。将所得超顺磁微球用乙醇洗涤；

(3)将20mg超顺磁微球分散于40ml乙醇中，加入0.1g多巴胺盐酸盐并超声15min。将复合微球磁分离，并用水洗涤后分散至20ml超纯水中；

(4)将上述20ml磁微球分散液至于冰浴中冷却20min后，向其中逐滴加入50μlhaucl4溶液(50mm)并搅拌10min。将340μl新配置的硼氢化钠溶液(0.1m)快速注入上述溶液并剧烈搅拌5min。将该磁微球用水洗涤2次，分散于20ml超纯水中；

(5)向新配置的10mlk2co3溶液(50mm)中逐滴加入500μlhaucl4溶液(50mm)，搅拌至溶液无色。向上述20ml磁微球分散液中逐滴加入au⁺前驱体1ml并磁力搅拌3min；向上述溶液中逐滴加入新配置的50mm抗环血酸溶液1ml并磁力搅拌3min；按照上述步骤交替加入au⁺前驱体溶液以及抗环血酸溶液5次，待反应结束后，将复合微球用水洗涤2次。

实施例5：

(1)量取80ml乙醇、180ml超纯水以及0.8ml氨水，倒入500ml反应瓶中。称取1g多巴胺盐酸盐并溶解于20ml水中，在剧烈搅拌下快速加入上述混合溶液中，在室温下磁力搅拌30h。将溶液离心收集沉淀并水洗数次，得到600nm的聚多巴胺微球；

(2)将聚多巴胺微球(干重约50mg)溶于0.5ml乙醇并加入50ml两口反应瓶中。随后加入240mg乙酰丙酮铁和10ml三甘醇。在真空条件下将溶液温度升至70℃并保持15min以上以除去乙醇。向瓶中充入氮气或氩气后升温至210℃并磁力搅拌2h；在该惰性气体氛围下继续升至290℃并搅拌1h。将所得超顺磁微球用乙醇洗涤；

(3)将20mg超顺磁微球分散于40ml乙醇中，加入0.1g多巴胺盐酸盐并超声15min。将复合微球磁分离，并用水洗涤后分散至20ml超纯水中；

(4)将上述20ml磁微球分散液至于冰浴中冷却20min后，向其中逐滴加入50μlhaucl4溶液(50mm)并搅拌10min。将340μl新配置的硼氢化钠溶液(0.1m)快速注入上述溶液并剧烈搅拌5min。将该磁微球用水洗涤2次，分散于20ml超纯水中；

(5)向新配置的10mlk2co3溶液(50mm)中逐滴加入500μlhaucl4溶液(50mm)，搅拌至溶液无色。向上述20ml磁微球分散液中逐滴加入au⁺前驱体1ml并磁力搅拌3min；向上述溶液中逐滴加入新配置的50mm抗环血酸溶液1ml并磁力搅拌3min；按照上述步骤交替加入au⁺前驱体溶液以及抗环血酸溶液5次，待反应结束后，将复合微球用水洗涤2次。