本申请要求于2015年8月13日提交的名称为“作为生物样品的色谱分离用柱硬件的镍-钴合金材料(nickel-cobaltalloymaterialascolumnhardwareforchromatographicseparationofbiologicalsamples)”的美国临时专利申请no.62/204,769的优先权和权益，其通过引用整体并入本文。
本公开涉及用于色谱分离装置和部件的材料以及用于固定化酶反应器装置和部件的材料。
背景
色谱技术是用于鉴定和分离复杂样品的重要工具。色谱技术潜在的基本原理是通过将移动流体中的混合物输送通过分离通道(例如分离柱)中的保留介质而将混合物分离成单独成分。移动流体通常被称为流动相，而保留介质通常被称为固定相。混合物各种组分的分离是基于流动相和固定相之间的差异分配。成分的分配系数的差异导致在固定相上的差异保留，导致分离。位于分离通道出口端的检测器在每个分离的成分离开分离通道产生色谱图时检测这些成分。
色谱分离的可选方法通常是气相色谱(gc)和液相色谱(lc)。gc和lc之间的一个主要区别是gc中的流动相是气体，而lc中的流动相是液体。尽管gc通常是敏感的分析方法，但gc中所需的高温使得该方法不适用于某些高分子量生物聚合物或蛋白质，因为它们会因热而变性。另外，它们的低蒸气压使它们不溶于气相。相反，lc不需要高温，可以使用增溶流动相。通常使用小填充颗粒和中等高压的lc被称为高效液相色谱(hplc)；而通常利用非常小的填充颗粒和高压的液相色谱被称为超高效液相色谱(uhplc)。在hplc和uhplc中，样品被高压液体(其为流动相)强制通过填充有固定相的分离通道(例如柱)，所述固定相通常由不规则或球形的颗粒构成。在一些实施方案中，固定相可以是整体式固体。
各种材料(例如不锈钢、诸如peek的聚合物、熔融二氧化硅等)已被用于色谱分离的柱硬件(例如，hplc硬件或uplc硬件)。然而，这些类别的材料中的每一种在生物样品中肽和蛋白质的色谱分离方面都存在缺陷。
概要
本发明技术的一些示例性实施方案包括用于通过色谱分离样品的装置和用于色谱分离装置的部件。在色谱分离期间，装置或部件具有暴露于包括样品的流动相的润湿表面。所述润湿表面包括包含镍、钴和铬以及被限于一定量以内的钛的合金材料。在一些实施方案中，所述润湿表面的合金材料使得能够对含有肽(例如含组氨酸的肽)的样品进行色谱分析，其中肽成分具有窄峰，并且肽成分没有显著的峰拖尾。在一些实施方案中，合金材料比一些色谱分离装置中采用的其他材料(例如不锈钢)更耐腐蚀。所使用的合金的增强的耐腐蚀性可以增加色谱分离装置和部件的使用寿命。
在一些方面，用于通过色谱分离样品的组分和装置具有暴露于包括样品的流动相的润湿表面，所述润湿表面中的一个或多个包括经选择以抵抗样品中存在的蛋白质和肽的吸附的合金材料。在一个实施方案中，合金材料是镍-钴、镍-钴-铬或镍-铬合金材料，并且钛被限于一定量以内(例如，少于1wt%的钛，少于0.5wt%的钛，少于0.1wt%的钛，少于0.05wt%的钛，少于0.015wt%的钛，少于0.01wt%的钛，少于0.005wt%的钛，少于0.001wt%的钛)。在一个实施方案中，合金材料具有约35wt%的钴、35wt%的镍、20wt%的铬和10wt%的钼的组成，并且钛被限于一定量以内。在一些方面，合金材料被包括在色谱部件或分离通道的表面部分中，而色谱部件或分离通道的本体部分包括不同的材料。在一个例子中，表面部分和本体部分相互扩散结合。
在一些方面，具有包括所述合金材料的润湿表面的部件和装置经构造用于微流体分离装置或系统(例如，其中分离通道的宽度或直径落入20μm至500μm的范围内)。在一些方面，具有包括所述合金材料的润湿表面的部件和装置经构造以在高压下(例如，在6,000至15,000psi的压力下)使用。
在一个方面，用于通过色谱分离样品的装置包括具有润湿表面的壁，所述润湿表面在色谱分离期间暴露于包括样品的流动相。所述壁的润湿表面包括包含以下组分的合金材料：镍；和钴和/或铬；且钛的量被限于1wt%以内。在一些实施方案中，所述壁的润湿表面包含所述合金材料。
在一些实施方案中，所述壁包括表面部分，所述表面部分包括所述润湿表面和本体部分，且所述润湿表面的合金材料的组成不同于所述本体部分的材料的组成。在一些实施方案中，所述表面部分扩散结合到所述本体部分。在一些实施方案中，所述壁的大部分或全部厚度可以由所述合金制成。
在一些实施方案中，所述壁的润湿表面限定分离通道。在一些实施方案中，所述装置进一步包括在所述分离通道的出口处的电喷尖端，且所述电喷尖端的润湿表面包括所述合金材料。
在一些实施方案中，所述装置包括两个或更多个合金材料的片，每个片的一部分形成所述壁的一部分。在一些实施方案中，所述两个或更多个片在界面处与沿着所述界面延伸的分离通道的至少一部分扩散结合。
在一些实施方案中，所述装置包括两个或更多个片，每个片包括所述合金材料的层，且每片形成所述壁的一部分，其中所述片的合金材料的层对于所述壁的该部分形成润湿表面。在一些实施方案中，所述两个或更多个片的合金材料的层在界面处与沿着所述界面延伸的分离通道的至少一部分扩散结合。
在一些实施方案中，所述装置还包括端部配件，且端部配件的润湿表面包括所述合金材料。
在一些实施方案中，所述装置还包括密封环，且密封环的润湿表面包括所述合金材料。在一些实施方案中，密封环包括玻璃料，且玻璃料的润湿表面包括所述合金材料。
在一些实施方案中，所述装置还包括玻璃料，且玻璃料的润湿表面包含所述合金材料。
在一些实施方案中，所述装置还包括堰，且堰的润湿表面包含所述合金材料。
在一些实施方案中，所述装置还包括一个或多个集成阀，且所述一个或多个集成阀的润湿表面包含所述合金材料。
在一些实施方案中，所述装置还包括分配盘，且分配盘的润湿表面包括所述合金材料。
在一些实施方式中，除固定相之外，在所述分离通道的出口端的上游且经构造以在使用期间与包括样品的流动相接触的所述装置的所有表面包括所述合金材料。
在一些实施方案中，所述分离通道的宽度或直径落入500μm至50mm的范围内。
在一些实施方案中，所述装置是微流体装置，并且所述分离通道的宽度或直径落入20μm至500μm的范围内。
在一些实施方案中，所述分离通道的宽度或直径落入500μm至50mm的范围内。
另一方面，经构造以在用于通过色谱分离样品的装置中使用的部件包括具有润湿表面的形体，所述润湿表面在色谱分离期间暴露于包括样品的流动相。所述润湿表面包括包含以下组分的合金材料：镍；和钴和/或铬；并且钛的量被限于1wt%以内。
在一些实施方案中，所述润湿表面限定分离通道，包括样品的流动相在使用期间流动通过所述分离通道。在一些实施方案中，所述分离通道的宽度或直径在20μm和500μm之间。在一些实施方案中，所述部件进一步包括在所述分离通道的出口处的电喷尖端，并且所述形体的润湿表面包括所述电喷尖端的润湿表面。
在一些实施方案中，所述部件进一步包括一个或多个集成阀，并且所述一个或多个集成阀的润湿表面包括所述合金材料。
在一些实施方案中，所述部件是用于分离柱的入口或出口的端部配件。
在一些实施方案中，所述部件是经构造以将固定相保持在所述装置的分离通道内的固定相保持元件。在一些实施方案中，所述固定相保持元件是玻璃料。在一些实施方案中，所述固定相保持元件是堰结构。
在一些实施方案中，所述形体包括表面部分，所述表面部分包括所述润湿表面和本体部分，并且所述润湿表面的合金材料的组成与所述本体部分的材料的组成相同。在一些实施方案中，所述形体包括表面部分，所述表面部分包括所述润湿表面和本体部分，并且所述润湿表面的合金材料的组成不同于所述本体部分的材料的组成。在一些实施方案中，所述表面部分扩散结合到所述本体部分。
在一些实施方案中，所述表面部分由所述合金材料组成。
在一个方面，经构造以用作色谱分离装置中的固定相的至少一部分的固体形体包括如本文所述的合金材料。
另一方面，对样品进行色谱分离的方法包括提供包括分离通道的色谱分离装置。所述分离通道具有润湿表面，所述润湿表面包括包含以下组分的合金材料：镍；和钴和/或铬；且钛的量被限于1wt%以内。所述方法还包括使携带样品的流动相流动进入并通过所述分离通道，从而对样品进行色谱分离。
在一些实施方案中，所述方法还包括检测所述分离通道下游的样品的成分。
在一些实施方案中，所述样品包括蛋白质，且样品中的蛋白质被分离和检测。在一些实施方案中，所述样品包括肽，且样品中的肽被分离和检测。在一些实施方案中，所述样品包含含组氨酸的肽，且样品中含组氨酸的肽被分离和检测。在一些实施方案中，所述样品包括磷酸肽，且样品中的磷酸肽被分离和检测。
在一些实施方案中，所述方法还包括检测所述分离通道下游的样品的成分，其中所述样品包括一种或多种蛋白质或肽，并且样品中的所述一种或多种蛋白质或肽以小于1.3的拖尾因子被分离和检测。
另一方面，进行色谱分离的方法包括提供根据本文所述的任何实施方案的色谱分离装置，并使携带样品的流动相流动通过所述色谱分离装置，由此分离样品的成分。
本发明技术的一些示例性实施方案包括用于进行酶反应的装置或部件，其可以是固定化酶反应器(imer)系统的一部分。经构造用于进行酶反应的装置包括限定腔室的壁，所述腔室具有入口和出口，所述壁具有在使用期间暴露于液体样品的润湿表面。所述壁的润湿表面包括本文所述的任何合金材料。经构造用于进行酶反应的部件包括具有在使用期间暴露于液体样品的润湿表面的形体，所述润湿表面包括本文所述的任何合金。
在一些实施方案中，所述壁或所述形体包含表面部分和本体部分，所述表面部分包括润湿表面，并且所述润湿表面的合金材料的组成不同于所述本体部分的材料的组成。在一些实施方案中，所述表面部分扩散结合到所述本体部分。在一些实施方案中，所述表面部分由所述合金材料组成。
实施方案可以包括以下特征中的一个或多个。
在一些实施方案中，所述合金材料的钛的量被限于0.1wt%以内。在一些实施方案中，所述合金材料的钛的量被限于0.05wt%以内。在一些实施方案中，所述合金材料的钛的量被限于0.02wt%以内。在一些实施方案中，所述合金材料的钛的量被限于0.015wt%以内。在一些实施方案中，所述合金材料的钛的量被限于小于0.01wt%。在一些实施方案中，所述合金材料的钛的量被限于小于0.005wt%。在一些实施方案中，所述合金材料的钛的量被限于小于0.001wt%的钛。
在一些实施方案中，所述合金材料包括钴和铬两者作为组分。在一些实施方案中，所述合金材料进一步包括钼作为组分。
在一些实施方案中，所述合金材料包括以下组分：22wt%-45wt%钴；25wt%-45wt%镍；10wt%-30wt%铬；和0wt%-20wt%钼；和被限于总共5wt%以内的余量。在一些实施方案中，所述余量被限于总共3wt%以内。
在一些实施方案中，所述合金材料包括以下组分：30wt%-40wt%钴；30wt%-40wt%镍；15wt%-25wt%铬；和5wt%-15wt%钼；和被限于总共5wt%以内的余量。在一些实施方案中，所述余量被限于总共3wt%以内。
在一些实施方案中，所述合金材料包括以下组分：32wt%-38wt%钴；32wt%-38wt%镍；17wt%-23wt%铬；和7wt%-13wt%钼；且钛的量被限于0.1wt%以内；和被限于总共5wt%以内的余量。在一些实施方案中，所述余量被限于总共3wt%以内。
在一些实施方案中，所述合金材料包括以下组分：34wt%-36wt%钴；34wt%-36wt%镍；19wt%-21wt%铬；和9wt%-11wt%钼；且钛的量被限于0.05wt%以内；和被限于总共5wt%以内的余量。在一些实施方案中，所述余量被限于总共3wt%以内。
在一些实施方案中，润湿表面由所述合金材料组成。在一些实施方案中，润湿表面的大部分表面区域被所述合金材料覆盖。在一些实施方案中，润湿表面的超过90％的表面区域被所述合金材料覆盖。在一些实施方案中，润湿表面的超过95％的表面区域被所述合金材料覆盖。在一些实施方案中，润湿表面的超过98％的表面区域被所述合金材料覆盖。在一些实施方案中，润湿表面的超过99％的表面区域被所述合金材料覆盖。
在一些实施方案中，所述装置或部件经构造用于离子交换色谱。在一些实施方案中，所述装置或部件经构造用于反相色谱。
在一些实施方案中，所述装置或部件经构造以承受高效液相色谱中使用的压力。在一些实施方案中，所述装置或部件经构造以承受超高效液相色谱中使用的压力。在一些实施方案中，所述装置或部件经构造以承受15,000至20,000psi的压力。在一些实施方案中，所述装置或部件经构造以承受20,000psi至50,000psi的压力。在一些实施方案中，所述装置或部件经构造用于低压应用。
在一些实施方案中，所述合金材料抵抗蛋白质的吸附并抵抗肽的吸附。在一些实施方案中，所述合金材料抵抗含组氨酸的肽的吸附。在一些实施方案中，所述合金材料抵抗磷酸肽的吸附。
从下面结合附图考虑的详细描述中，其他优点和特征将变得显而易见。然而，应该理解的是，附图仅被设计为说明而不是作为本发明的限制的定义。
附图简述
为了帮助本领域技术人员制造和使用所述装置和部件以及相关方法，参考附图，其不一定按比例。
图1a是根据一个实施方案的实施例柱组件的侧视图。
图1b是图1a的实施例柱组件的侧面横截面图。
图1c是图1a的实施例柱组件的分解透视图。
图1d是图1b的细节图，显示了壁的一部分。
图1e是图1b的细节图，显示了根据一些实施方案的具有表面部分和本体部分的壁的一部分。
图1f是图1b的细节图，显示了柱组件的端部。
图2a是根据一个实施方案的外壳的透视图。
图2b是图2a的外壳的侧视图。
图2c是图2b的外壳的侧面横截面图。
图2d是图2a的外壳和相关的玻璃料的分解透视图。
图3是根据一个实施方案的包括密封环的柱组件的端部的横截面图。
图4a是根据一个实施方案的密封环的侧视图。
图4b是图4a的密封环的正视图。
图4c是图4a的密封环的透视图。
图4d是图4a的密封环的侧面横截面图。
图5a是根据一个实施方案的分配盘的透视图。
图5b是图5a的分配盘的正视图。
图5c是根据一个实施方案的分配盘和附带的外壳的分解透视图。
图6a是根据一个实施方案的双层平面色谱装置的分解透视图。
图6b是图6a的装置沿a-a线截取的横截面细节图。
图6c是图6a的装置沿a-a线截取的横截面细节图，显示了根据一个实施方案的具有表面部分和本体部分的两个层。
图7a是根据一些实施方案的堰的顶视图。
图7b是图7a的堰沿b-b线截取的横截面图。
图7c是图7a的堰沿c-c线截取的横截面图。
图8a是根据一些实施方案的具有在较宽的通道和较窄的通道之间的颈部的堰的俯视图。
图8b是图8a的堰沿d-d线截取的横截面图。
图9a是根据一些实施方案的具有电喷尖端的装置的端部部分的透视图。
图9b是图9a的电喷尖端的细节图。
图10a是根据一个实施方案的三层平面色谱装置的分解透视图。
图10b是图10a的装置沿f-f线截取的横截面细节图。
图10c是图10a的装置沿线f-f截取的横截面图，示出了根据一个实施方案的具有表面部分和本体部分的第一层和第三层。
图11包括使用不锈钢柱进行的烯醇酶样品的胰蛋白酶消化物的色谱图。
图12包括使用熔融二氧化硅柱进行的烯醇酶样品的胰蛋白酶消化物的色谱图。
图13是在使用不锈钢柱进行的烯醇酶胰蛋白酶消化物样品分析期间，作为注射次数函数的峰宽度的图。
图14是在使用熔融二氧化硅柱进行的烯醇酶胰蛋白酶消化物样品分析期间，作为注射次数函数的峰宽度的图。
图15包括根据一些实施方案的使用实施例柱进行的烯醇酶胰蛋白酶消化物样品的色谱图。
图16是在使用实施例柱进行的烯醇酶胰蛋白酶消化物样品分析期间，作为注射次数的函数的峰宽度的图。
图17包括使用熔融二氧化硅管进行和使用具有1wt％钛的镍-钴合金管进行的烯醇酶胰蛋白酶消化物样品分析的色谱图。
示例性实施方案的详细描述
不锈钢已被广泛用作色谱分离的柱硬件(例如，hplc硬件或uplc硬件)。然而，已经发现生物样品的一些成分，如肽和蛋白质，在分析期间常常吸附到不锈钢和类似金属的柱硬件上。据推测该吸附是由于肽和金属中所含的铁之间的相互作用引起的。在分析期间吸附到柱硬件会导致色谱图中来自这些成分的信号消失或减少，或峰显著增宽(参见下面图11所附的描述)。
此外，对于随后的注射，直到硬件上的吸附达到饱和水平之前，吸附对色谱的影响可能不同，这表明色谱柱需要在分析之前进行调节(参见下面图14所附的描述)。通过在分析之前注入大量的肽或蛋白质可以调节不锈钢柱硬件，这会减少分析期间来自样品的这些成分的吸附量。但是，这可能只是临时修复。此外，调节可能会浪费样品，并增加获得有用结果所需的时间和精力。
解决分析期间生物样品成分吸附的另一种途径是钝化在分析期间将与样品接触的硬件表面。据推测，吸附是由成分(诸如肽)与用于柱硬件的不锈钢中所含的铁或其他金属之间的相互作用引起的。在一种途径中，不锈钢硬件可暴露于酸，其优先溶解铁，在不锈钢硬件表面产生缺铁和富铬材料，并可能会减少吸附。但是，这种钝化可能只是临时解决方案。例如，在使用期间缺铁表面可能被损坏(例如被固定相刮擦)，暴露下面的富铁不锈钢。此外，在制造环境中，难以可再现且廉价地进行窄孔管(例如内径为300μm以下的管)的钝化。
或者，非金属材料可用于柱硬件的表面以避免生物样品成分在金属表面上的吸附问题。聚醚醚酮(peek)等聚合物可代替金属比如不锈钢用于柱硬件，只是聚合物材料不具有足以在hplc和uhplc所需的高压下使用的机械强度。或者，不锈钢柱可以用聚合物比如peek或聚四氟乙烯(例如来自dupont的teflon)装套或涂覆。虽然这种途径会增加柱的机械强度，但是制造小直径的涂覆或装套的柱、特别是那些直径小于2mm的柱是困难的。此外，当使用高度水性的流动相(例如尺寸排阻和离子交换色谱中使用的流动相)时，聚合物材料可能通过疏水相互作用有害地吸附蛋白质和肽。或者，可以使用熔融二氧化硅代替不锈钢用于柱；然而，用熔融二氧化硅制造柱比用不锈钢制造更困难。另外，熔融二氧化硅表面上的硅醇可通过离子交换与蛋白质和肽相互作用。
本文描述的一些实施方案解决或避免了在对包括肽(例如，含组氨酸的肽)和蛋白质的生物样品进行色谱法时，色谱柱部件使用常规柱材料(例如不锈钢、聚合物比如peek、和二氧化硅)引起的问题。实施方案包括用于通过色谱分离样品的装置、经构造在用于通过色谱分离样品的装置中使用的部件、以及用于对样品进行色谱分离的方法。在装置和部件实施方案中，装置或部件包括在色谱分离期间暴露于包括样品的流动相的润湿表面，其中壁的润湿表面包括合金材料。所述合金材料包括镍、钴和/或铬，以及被限于一定量以内的钛。在一些实施方案中，所述合金抵抗蛋白质的吸附并抵抗肽(例如，含组氨酸的肽)的吸附。
图1a至1c描绘了根据一个实施方案的用于通过色谱分离样品的色谱柱组件形式的装置10。装置10包括具有润湿表面14的壁12，润湿表面14在色谱分离期间暴露于包括样品的流动相。壁的润湿表面14包括合金材料，该合金材料包括以下组分：镍，钴和/或铬；且钛的量被限于1wt%以内。在一些实施方案中，如图所示，壁的润湿表面限定分离通道16。
在一些实施方案中，所述合金材料的钛的量被限于0.1wt%以内。在一些实施方案中，所述合金材料的钛的量被限于0.02wt%以内。在一些实施方案中，所述合金材料的钛的量被限于0.015wt%以内。
在一些实施方案中，所述合金包括钴和铬两者作为组分。在一些实施方案中，所述合金材料进一步包括钼作为组分。
在一些实施方案中，所述合金材料包括以下组分：25wt%-45wt%钴；25wt%-45wt%镍；10wt%-30wt%铬；和0wt%-20wt%钼；钛的量被限于1wt%以内；和被限于总共5wt%以内的余量。在一些实施方案中，所述余量被限于总共3wt%以内。
在一些实施方案中，所述合金材料包括以下组分：30wt%-40wt%钴；30wt%-40wt%镍；15wt%-25wt%铬；和5wt%-15wt%钼；钛的量被限于1wt%以内；和被限于总共5wt%以内的余量。在一些实施方案中，所述余量被限于总共3wt%以内。
在一些实施方案中，所述合金材料包括以下组分：32wt%-38wt%钴；32wt%-38wt%镍；17wt%-23wt%铬；和7wt%-13wt%钼；钛的量被限于0.1wt%以内；和被限于总共5wt%以内的余量。在一些实施方案中，所述余量被限于总共3wt%以内。
在一些实施方案中，所述合金材料包括以下组分：34wt%-36wt%钴；34wt%-36wt%镍；19wt%-21wt%铬；和9wt%-11wt%钼；钛的量被限于0.05wt%以内；和被限于总共5wt%以内的余量。在一些实施方案中，所述余量被限于总共3wt%以内。
例如，在一些实施方案中，所述合金可以是jenkintown,pa的spstechnologies,llc的商标mp35nlt，其包含大约35wt%钴，35wt%镍，20wt%铬和10wt%钼，以及小于0.01wt%钛。已知这种合金具有很强的机械性能并且可以承受高压，例如在uhplc中使用的那些。
在一些实施方案中所述合金材料抵抗蛋白质的吸附并抵抗肽的吸附。在一些实施方案中所述合金材料抵抗含组氨酸的肽的吸附。在一些实施方案中，所述合金材料抵抗磷酸肽的吸附。
本发明人已经确定，润湿表面上采用钛的量被限于小于1wt%的镍-钴合金的色谱分离部件，在进行生物样品的色谱分离时，与不锈钢成分相比，表现出在抵抗生物样品成分(例如，蛋白质和肽)的吸附方面优越的性能。此外，本发明人确定，降低合金中钛的量提高了色谱分离的品质。具体而言，本发明人确定，具有mp35nlt合金的润湿表面的分离柱在含组氨酸的肽的分析期间未显示显著的峰增宽或峰拖尾。此外，本发明人确定具有mp35nlt的润湿表面的分离柱不需要对柱进行调节，并且在含肽样品分析期间在连续注射中显示一致的峰宽度。镍-钴合金在具有肽和蛋白质的样品的色谱分离中令人印象深刻的表现是预想不到的，因为已知镍离子和钴离子通过金属螯合相互作用色谱来螯合某些类型的肽或蛋白质，这会导致预期合金中的镍和钴将导致与肽或蛋白质的更大相互作用。下面在实施例部分关于图11至15详细描述了比较不锈钢、熔融二氧化硅和mp35nlt合金色谱分离部件在具有生物成分的样品分离期间的性能的实验结果。
再次转向图1a-1e的装置10，在一些实施方案中，壁12的大部分或全部厚度可由所述合金制成。例如，图1d显示了根据一些实施方案的壁12的细节图，其中壁12的大部分或全部厚度由所述合金材料(例如mp35nlt)制成。
在一些实施方案中，所述壁12包括表面部分，所述表面部分包括所述润湿表面和本体部分，且所述润湿表面的合金材料的组成不同于所述本体部分的材料的组成。例如，图1e示出了根据另一实施方案的细节图，其中壁12包括表面部分18和本体部分20。所述润湿表面14布置在所述合金材料(例如mp35nlt)的表面部分18，且所述本体部分20具有不同的组成(例如不锈钢)。可以为了期望的机械性质或化学性质(例如，强度或耐腐蚀性)和/或与成本相关的问题(例如本体部分的材料可以比合金材料更便宜)，选择所述本体部分20的材料。可用于所述本体部分的其它材料包括但不限于不锈钢、钛、铝、碳纤维复合材料、peek、聚烯烃、陶瓷等。在一些实施方案中，所述表面部分18沉积在所述本体部分20上。在一些实施方案中，所述表面部分18扩散结合到所述本体部分20。在一些实施方案中，所述表面部分18焊接到所述本体部分20。在一些实施方案中，所述本体部分20是在所述表面部分18边缘的套筒并与其接触。
在一些实施方案中，所述润湿表面14由所述合金材料组成。在一些实施方案中，所述润湿表面的大部分表面区域被所述合金材料覆盖。在一些实施方案中，所述润湿表面的超过90%的表面区域被合金材料覆盖。在一些实施方案中，所述润湿表面的超过95%的表面区域被合金材料覆盖。在一些实施方案中，所述润湿表面的超过98%的表面区域被合金材料覆盖。在一些实施方案中，所述润湿表面的超过98%的表面区域被合金材料覆盖。
在一些实施方案中，如图所示，壁12的润湿表面14限定分离通道16。在一些实施方案中，所述合金被用在分离通道16的壁12中，或分离通道16的壁12的至少表面部分18中。在一些实施方案中，所述合金还用在装置12的一个或多个附加部件的一个或多个润湿表面中。
例如，在一些实施方案中，装置10还包括端部配件22，该端部配件的润湿表面包含所述合金材料(参见图1f的细节图)。在一些实施方案中，装置10还包括玻璃料24，该玻璃料24的润湿表面25包含所述合金材料(参见图1f)。在一些实施方案中，装置10进一步包括外壳26，其包括玻璃料24。图1f的细节图示出了作为柱组件装置10的一部分的外壳26和玻璃料24。图2a-2d示出了外壳26的不同视图。
在一些实施方案中，装置还包括密封环28，并且该密封环的润湿表面30包括所述合金材料。图3描绘了包括壁12'、润湿表面14'、端部配件22'、玻璃料24'和具有润湿表面30的密封环28的柱组件10'的端部的横截面图。图4a-4d描绘了密封环28的不同视图。
在一些实施方案中，装置10还包括分配盘32，并且分配盘32的润湿表面33包括所述合金(参见图5a和5b)。图5c示出了分配盘32和具有相关过滤器或玻璃料34的外壳组件35。在一些实施方案中，包括分配盘32和相关过滤器或玻璃料34的外壳组件35位于分离柱的壁的上游和下游。
色谱分离组件通常包括在分离通道16内的固定相(未示出)。在所述装置的一些实施方案中，除固定相之外，在分离通道16的出口端的上游且经构造以在使用期间与包括样品的流动相接触的装置10的所有表面包含所述合金材料。例如在一些实施方案中，壁12、端部配件22和玻璃料24的润湿表面包括所述合金材料。
实施方案包括在用于通过色谱分离样品的装置中使用的部件。该部件具有具有润湿表面的形体，所述润湿表面在色谱分离期间暴露于包括样品的流动相。润湿表面包括如上关于装置实施方案所述的合金材料。例如，在一些实施方案中，部件是具有限定色谱分离通道16的润湿表面14的壁12。在一些实施方案中，该部件是端部配件22。在一些实施方案中，该部件是玻璃料24，并且润湿表面是玻璃料24的润湿表面。在一些实施方案中，该部件是固定相保持元件，其经构造以保持固定相在所述装置的分离通道内。在一些实施方案中，固定相保持元件是玻璃料24。在一些实施方案中，玻璃料在色谱分离通道上游附加地或备选地过滤固体颗粒。在一些实施方案中，玻璃料位于色谱分离通道的上游，并且可用于避免颗粒接近在色谱分离通道的直接上游的单独的柱入口玻璃料。
实施方案不限于具有圆柱形柱的色谱分离装置。本领域的普通技术人员将会理解，色谱分离装置的实施方案可以采用其他几何形状用于分离通道。例如，图6a至9b中所示的装置100具有平面色谱芯片几何形状。装置100可备选地被描述为经构造在用于通过色谱分离样品的装置中使用的部件。图6a是装置100的各层的分解图。装置100包括第一层111(例如顶板)和第二层112(例如底板)。第二层112包括凹槽113和114，其可以通过电化学微加工(emm)，也称为电蚀刻或通过光掩模的电化学微加工)或者铣削形成，其形成色谱分离通道的各部分。第一层111包括孔102、103、104、105、106、107和108以及槽109，并且第二层10b包括孔115、116、117、118和119以及槽120，其可以由微型放电加工(微-edm)、线edm、机械钻孔和/或激光钻孔制成。孔102和103用作流体通路端口或通孔。孔104、105、106、107、115、116、117和118用于连接在装置100的外部边缘处的配件，以在装置100的边缘或侧面110上提供流体通路。孔108、119和槽109、120用于第一层111和第二层112的对准。
第一层111接合到第二层112以形成装置100。在一些实施方案中，第一层111通过扩散结合或其他合适的技术(例如用垫圈密封夹紧)接合到第二层112。图6b示意性地描绘了在第一层111和第二层112已经接合在一起之后，通过图6a的线a-a截取的装置的横截面图。图6a和图6b没有按比例，并且为了便于说明而改变了一些相对尺寸。如图6b所示，在第一层111和第二层112接合之后，凹槽114与第一层111的表面形成能够在高液压下气密地保持流体的通道122。类似地，当第一层111和第二层112结合时，凹槽113与第一层111形成通道122的另一部分。在一些实施方案中，通道122的宽度w在50-500μm的范围内。
第一层111和第二层112一起形成具有润湿表面124的装置的壁。或者，第一层111、第二层202可被描述为一起形成具有润湿表面124的形体。润湿表面124包括含有以下组分的合金：镍；和钴和/或铬；且钛的量被限于1wt%以内。以上关于装置10所描述的合金的所有特征和变化也适用于装置100。
在一些实施方案中，第一层111和第二层112各自包括如图6c所描绘的表面部分和本体部分。第一层111包括包含所述合金的表面部分126和不同材料(例如不锈钢)的本体部分128，并且第二层112包括包含所述合金的表面部分130和不同材料(例如不锈钢)的本体部分132。本体部分和表面部分可以通过任何合适的技术接合在一起，所述技术包括但不限于扩散结合、夹紧、包覆模制等。
在第一层和第二层的制造和结合或接合之后，通道122通常填充有固定相(例如，微米尺寸的颗粒)。装置100可以包括在通道122的分离柱部分的一个或多个端部处的一个或多个固定相保持元件，以防止固定相从通道122流出。在一些实施方案中，固定相保持元件是玻璃料，其可以通过在分离柱的一些部分中将固定相颗粒烧结在一起而形成，或者通过使用一些其他合适的方法固定一些固定相颗粒来形成。在一些实施方案中，固定相保持元件是通过使在第二层112中形成的凹槽114的一部分变窄而在装置100中形成的堰，从而使得到的通道的对应部分变窄。例如，图7a-7c示意性地描绘了在根据一些实施方案的装置100中包括的堰。凹槽114在堰140处变窄，在堰的下游形成变窄的凹槽142和相应的变窄的通道144。堰140具有润湿表面146。作为另一例子，图8a-8b示意性地描绘了根据一些实施方案的包括在装置100中的堰的备选几何形状。在图8a-8b中，凹槽114在堰150处变窄并变得较浅，然后变宽和加深以分别形成通过较窄且较浅的颈部154连接的两个通道122、152。堰150具有润湿表面156。在一些实施方案中，多个堰可以形成在通道的端部。在一些实施方案中，一个或多个固定相保持元件的一个或多个润湿表面包括所述合金。例如，堰140的润湿表面146或堰150的润湿表面包括一些实施方案中的所述合金。
在一些实施方案中，装置100包括电喷尖端。例如，图9a和9d示出了具有集成的电喷尖端160的装置的端部110'的实施方案。电喷尖端160通过切割装置100的端部110(例如使用emm和/或edm)形成尖端几何形状来形成。通道122在堰140处变窄以变为变窄的通道142，其在电喷尖端160处离开装置100。在一些实施方案中，电喷尖端的润湿表面包括所述合金。
在一些实施方案中，装置100进一步包括一个或多个集成阀(未示出)，并且所述一个或多个集成阀的润湿表面包括所述合金材料。
在一些实施方案中，装置可以包括采用槽来限定通道的三个层。例如，图10a-10c示意性地描绘了具有第一层201、第二层202和第三层203的装置200。装置200可以备选地描述为经构造以在用于通过色谱分离样品的装置中使用的部件。第一层201具有与上面关于装置100的第一层111所描述的类似的孔和槽。第二层202具有与上面关于装置100的第二层111所述的类似的孔和槽；然而，代替凹槽，第二层202具有槽213和214。第三层203具有用于对准的孔和槽，类似于上面关于装置100的第二层111所述的那些。第一层201、第二层202和第三层203接合在一起。图10b中的横截面图描绘了第一层201和第三层203的表面如何与第二层202的槽214形成气密密封的通道222。当接合在一起时，第一层201、第二层202和第三层203可以被描述为形成装置200的壁。或者，第一层201、第二层202和第三层203可以被描述为形成装置200的形体。槽214的表面与第一层201和第三层203的表面形成包括所述合金的壁或形体的润湿表面224。
在一些实施方案中，第一层201和第三层203各自包括如图10c所描绘的表面部分和本体部分。第一层201包括包含所述合金的表面部分226和不同材料(例如不锈钢)的本体部分228，并且第三层203包括包含所述合金的表面部分230和不同材料(例如不锈钢)的本体部分232。本体部分和表面部分可以通过任何合适的技术接合在一起，所述技术包括但不限于扩散结合、夹紧、包覆模制等
关于用于这种装置的平面几何色谱分离装置和制造方法的附加信息出现在名称为“具有扩散结合和表面改性部件的色谱设备(chromatographyapparatushavingdiffusion-bondedandsurface-modifiedcomponents)”的美国专利公布no.2013/0014567中，该专利通过引用整体并入本文中。在一些实施方案中，分离装置可以是微流体筒的一部分。
在一些实施方案中，所述装置经构造用于低压应用。例如，所述装置可以经构造用于固相萃取。在另一个实施方案中，所述装置经构造用于超临界流体色谱(sfc)。在另一个实施方案中，所述装置经构造用于气相色谱。如本文所用，低压应用指的是其中装置中的压力落入大气压至1000psi的范围内的应用。
在一些实施方案中，所述装置经构造以承受高效液相色谱中使用的压力。如本文所用，高效液相色谱是指其中流动相经受1,000和6,000psi之间的压力的液相色谱。
在一些实施方案中，所述装置经构造以承受在超高效液相色谱中使用的压力。如本文所用，超高效液相色谱是指其中流动相经受大于6,000psi的压力的液相色谱。
在一些实施方案中，所述装置经构造以在使用期间承受6,000至15,000psi的压力。在一些实施方案中，所述装置经构造以在使用期间承受6,000psi至18,000psi的压力。在一些实施方案中，所述装置经构造以在使用期间承受15,000至20,000psi的压力。在一些实施方案中，所述装置经构造以在使用期间承受20,000psi至50,000psi的压力。
在一些实施方案中，装置或部件的分离通道的宽度或直径落入10μm至25mm的范围内。在一些实施方案中，装置或部件的分离通道的宽度或直径落入20μm至7.8mm的范围内。对于制备型柱，宽度或直径可能大至100mm。在一些实施方案中，例如微流体装置或微流体部件，分离柱的宽度或直径可以在20μm至500μm的范围内。
由于与在微流体系统中实现有效表面处理有关的困难，与将经表面处理的不锈钢用于润湿表面相反，将所述合金用于装置或部件的润湿表面可能在微流体系统中特别有利。
与使用经表面处理的熔融二氧化硅相比，将所述合金用于装置或部件的润湿表面可能是有益的，这是因为由金属例如所述合金制造分离柱比由二氧化硅制造更容易，并且因为熔融二氧化硅润湿表面的硅醇可通过离子交换与蛋白质和肽相互作用。
仅出于说明的目的，将参照上面关于图1a-1f描述的装置10来描述本文教导的装置的使用。在使用中，提供了包括分离通道16的色谱分离装置10。分离通道16具有包括合金材料的润湿表面14。合金材料包括以下组分：镍；和钴和/或铬；并且钛的量被限于1wt%以内。以上描述了根据各种实施方案的合金材料的其他特征和方面。流动相携带样品流动进入并通过分离通道16，从而对样品进行色谱分离。在一些实施方案中，该方法进一步包括检测样本的成分。在一些实施方案中，样品包括蛋白质，且样品中的蛋白质被分离和检测。在一些实施方案中，样品包括肽，且样品中的肽被分离和检测。在一些实施方案中，样品包含含组氨酸的肽，且样品中含组氨酸的肽被分离和检测。在一些实施方案中，样品包括磷酸肽，且样品中的磷酸肽被分离和检测。在一些实施方案中，样品包括一种或多种肽或蛋白质，并且样品中的一种或多种蛋白质或肽以小于1.3的美国药典(usp)拖尾因子被分离和检测。usp拖尾因子是作为峰宽度与峰前部宽度(两者都在峰高度的5％处测量)的2倍之比而计算的，如以下拖尾因子的公式中所示：
其中t是拖尾因子，f5％是在最大峰高度的5％处的峰的前部的宽度，并且t5％是在最大峰高度的5％处的峰的尾部的宽度。
另一方面提供具有包括本文所述的合金材料的固定相的多种分离装置。在各种实施方案中，具有包括本文所述的合金材料的固定相的分离装置例如包括：色谱柱；薄层板；过滤膜；样品清除装置和微量滴定板；hplc柱填料；固相萃取(spe)装置；离子交换色谱装置；磁珠；亲和色谱和spe吸附剂；多价螯合试剂；用于组合化学的固体载体；用于寡糖、多肽和/或寡核苷酸合成的固体载体；固体负载的生物分析物；用于质谱法的毛细管生物分析装置；用于受控大孔聚合物膜的模板；毛细管色谱装置；电动泵填充材料；微流体装置的填充材料；聚合物添加剂；催化载体；和用于微芯片分离装置的填充材料。
在一些实施方案中，可以将如本文所述的合金材料填充到预备、微孔、毛细管和微流体装置中。在一些实施方案中，装置中的固体固定相包含如本文所述的合金材料。在一些实施方案中，装置中固体固定相的表面包括本文所述的合金材料。在一些实施方案中，装置的固相和壁的润湿表面两者均包括如本文所述的一种或多种合金。
实施方案可以用于所有色谱模式。分离模式包括但不限于反相、正相、尺寸排阻、离子交换、亲和力、疏水相互作用和亲水相互作用。另外，本文所述的合金可以用于所有上述模式的样品制备装置。
一些实施方案包括固定化酶反应器(imer)。在一些实施方案中，imer包括限定腔室的壁，所述腔室具有入口和出口以及与腔室内的酶共价连接的固体固定相。在使用中，包括聚合物和分析物的液体样品通过入口流入腔室，与固定化的酶相互作用并通过出口流出腔室。在一些实施方案中，imer的固体固定相包括本文所述的合金。在一些实施方案中，腔室的壁的润湿表面(即，在使用期间与液体样品接触的表面)包括本文所述的合金。在一些实施方案中，腔室的壁的润湿表面和imer的固体固定相两者包括本文所述的一种或多种合金。在一些实施方案中，imer装置包括附加部件或配件，并且一个或多个附加部件或配件的润湿表面包括本文所述的一种或多种合金。在一些实施方案中，imer适于在约2,500至35,000psi范围内的压力下操作。在一些实施方案中，imer适于在8,000至15,000psi范围内的压力下操作。在2014年6月12日公布的名称为“固定化酶反应器(immobilizedenzymaticreactor)”的美国专利申请公开no.2014/0162298中提供了关于imer装置和系统的附加细节，其通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，imer的腔室可以具有与本文所述的色谱分离装置相似的构造。鉴于本公开，本领域的普通技术人员将会理解，这里关于用于色谱分离的装置、柱和部件的附图和描述在很大程度上也适用于imer。例如，本文中描述为分离柱或分离通道的结构也可以或备选地被视为并描述为其中可以设置固定相用于imer的腔室。
可固定在imer中的固定相上的酶包括但不限于：胃蛋白酶、蛋白酶、纤维素、脂肪酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖异构酶、木聚糖酶、磷酸酶、阿拉伯聚糖酶、多聚半乳糖醛酸酶、水解酶、凝乳酶、脲酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、连接酶、糖苷酶、聚合酶、磷酸酶、激酶、神经酰胺酶。在某些实施方案中，酶是胰蛋白酶、pngasef、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、肽酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、ides或idez，或它们的混合物。
在一些实施方案中，固定相包括固定化亲和试剂，其包括但不限于：蛋白g、λ、κ、蛋白y、蛋白l、适体、亲和体、淀粉状蛋白、凝集素、或用于使用者产生的亲和相的活化树脂如抗生蛋白链菌素和环氧树脂。固定化的亲和试剂的靶分子包括但不限于：蛋白质、igg、igm、胰岛素、肽、小分子、毒素、黄曲霉毒素、霉菌毒素、桔霉素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、呕吐毒素、伏马菌素、赭曲霉毒素、玉米烯酮、镰刀菌素，或它们的混合物。在一些实施方案中，将固定化亲和固定化亲和试剂或固定化亲和试剂的靶分子加入技术平台中，如来自siscapaassaytechnologiesinc.的稳定同位素标准和用抗肽抗体捕获亲和力工作流(参见例如us9,274,124；9,261,506；9,170,263；9,163,276；9,018,580；8,916,680；8,633,031；8,580,491；8,574,860；8,569,071；8,568,988；8,455,202；8,187,893；8,119,356；8,097,425；7,955,810；和7,807,172)。
在一些实施方案中，将固定相改性以包括一种或多种固定化亲和性和固定化酶材料。
在一些实施方案中，用于分离装置或用于imer的柱具有1.0mm、2.1mm、3.0mm、4.6mm、10mm、19mm、30mmid的内径或它们之间的直径。在一些实施方案中，用于分离装置或用于imer的柱具有落入0.5-100mm范围内的内径。
在一些实施方案中，用于分离装置或用于imer的柱具有5mm、10mm、30mm、50mm、75mm、100mm、150mm、200mm、300mm、500mm、1000mm、2000mm的长度，或落入它们之间的长度。
在一些实施方案中，用于分离装置或用于imer的部件与以下装置兼容或经构造以与以下装置一起使用：1mmid柱硬件、2.1mmid柱硬件、3.0mmid柱硬件、4.6mmid柱硬件、10mmid柱硬件、19mmid柱硬件、30mmid柱硬件、0.5-100mmid柱硬件、平面几何色谱分离装置、扩散结合分离装置或微流体筒。
在一些实施方案中，由于合金材料与通常用在这些装置的表面上的其他材料相比改善的耐腐蚀性，所以将本文描述的合金材料结合到装置中可以提高装置的寿命。具有包括如本文所述的合金的固定相的装置的实施方案可展现改善的寿命。具有包括如本文所述的合金的一个或多个润湿表面的装置的实施方案可以表现出改善的寿命。
显示由本文公开的合金制成的色谱硬件与不锈钢的耐腐蚀性相比改善的耐腐蚀性的实验数据在以下实施例部分中给出。
一些实施方案提供了包括如本文所述的装置或装置的一个或多个部件以及使用说明的试剂盒。在一个实施方案中，说明书与以色谱柱、薄层板、过滤膜、样品清除装置、固相萃取装置、微流体装置和微量滴定板为例的分离装置一起使用。在一个实施方案中，说明书与固定化酶反应器装置一起使用。
实施例
使用镍-钴合金、不锈钢和二氧化硅柱的包括肽的样品的色谱分离比较
本发明人对包括肽的样品进行色谱分离，以将常规不锈钢和二氧化硅分离柱与实施例分离柱的性能进行比较。
图11包括用常规不锈钢分离柱分析的烯醇酶样品的胰蛋白酶消化物的色谱图。色谱图310显示样品中肽1的提取质量312的显著峰增宽。色谱图314显示样品中肽2的提取质量316的显著峰增宽。色谱图318显示样品中肽3的提取质量320甚至更显著的峰增宽。总离子流的色谱图322分别显示肽1、肽2和肽3的增宽峰312、316、320。肽1、2和3的峰显示出相对低的信噪比以及显著的增宽。这些色谱图说明了使用不锈钢色谱柱用于包括肽的样品的问题。当在不锈钢柱上分析包括烯醇酶的样品时，某些肽(如含组氨酸的肽)不会出现在色谱图中，或者具有非常宽的峰形，通常观察到具有显著的峰拖尾。这些肽是烯醇酶的胰蛋白酶消化物，其包括在可得自milford,ma的waters公司的massprepenolasedigestwithphosphopeptidesmix中。肽1是t3(序列wltgpqladlyhslmk)，肽2是t44(序列aaqdsfaagwgvmvshr)，且肽3是t51-52(序列ieeelgdnavfagenfhhgdkl)。有关这些肽的进一步信息可以在waters公司的的出版物“massprepenolasedigestwithphosphoptitiesmix-careandusemanual”中获得，其可得自http：//www.waters.com/webassets/cms/support/docs/715001713.pdf，其内容整体并入本文。
为了比较，图12包括用熔融二氧化硅管构建的柱(具体是来自milford,massachusetts的waters公司的nanoease柱)分析的相同烯醇酶样品的胰蛋白酶消化物的色谱图。与来自不锈钢柱的色谱图310相反，色谱图330显示样品中肽1的提取质量312的窄峰和高信噪比。与来自不锈钢柱的色谱图314相反，色谱图334显示样品中肽2提取质量316的窄峰和高信噪比。与来自不锈钢柱的色谱图318相反，色谱图338显示样品中肽3提取质量320的窄峰和高信噪比。色谱图340分别显示肽1、肽2和肽3的峰312、316、320的总离子流和优异的信噪比。在图11和图12中的色谱图之间的对比说明了不锈钢柱对分离这三种肽的表现有多差。
不锈钢柱硬件的另一个问题是对于某些肽，需要几次注射才能获得可接受的峰形，表明需要对该柱进行调节用于该分析。图13中的曲线图350显示了不锈钢柱中肽的峰宽如何在10次注射内显著改变，证实不锈钢柱需要显著调节以获得一致的结果。这种调节浪费了样品和实验时间。相反，图14的曲线图360证实了该肽的峰宽如何从注射2至10一致，表明熔融二氧化硅柱不需要显著调节。
尽管熔融二氧化硅柱对于这三种肽表现良好，但与由金属材料制造装置和部件相比，由于难以由熔融二氧化硅制造装置和部件，熔融二氧化硅可能是对于许多应用不合宜的材料。
可以在不锈钢分离柱中进行一些表面改性，以对含肽的样品获得更好的性能，例如润湿表面的表面钝化或可施加到润湿表面的涂层(例如用聚合物产生缺铁和富铬的表面或涂层)；然而，如果表面或涂层在使用期间受损，这种表面改性和涂层可能会失效。此外，这些表面处理和涂层难以在微型装置中完成。使用本文所述合金的实施方案避免了对润湿表面上的表面处理或涂层的需要，从而降低了制造的复杂性。
构建实施例分离柱，柱硬件使用镍-钴合金材料，具体是mp35nlt。该合金具有约35wt%的钴、35wt%的镍、20wt%的铬和10wt%的钼以及小于0.01wt%的钛。实施例分离柱用于分离和检测烯醇酶肽样品，结果显示在图15和16中。
与不锈钢柱的色谱图310相反，实施例柱的色谱图370显示样品中肽1的提取质量312的窄峰和高信噪比。与不锈钢柱的色谱图314相反，实施例柱的色谱图374显示样品中肽2的提取质量316的窄峰和高信噪比。与不锈钢柱的色谱图318相反，实施例柱的色谱图378显示样品中肽3的提取质量320的窄峰和高信噪比。实施例柱的色谱图380分别显示肽1、肽2和肽3的峰312、316、320的总离子流和优异信噪比。图11和图15中的曲线图之间的对比证实了实施例柱与不锈钢柱相比，用于分离和检测这三种肽的优越性能。在不锈钢柱数据中峰增宽或缺失的肽在实施例柱数据中存在、窄且具有良好的信噪比。实施例柱的图15与熔融二氧化硅柱的图12的比较显示，实施例柱用于分离和检测这三种肽至少与熔融二氧化硅表现同样好。
图16包括实施例柱中后续样品注射的肽峰宽度的曲线图382。如图所示，第2到第10次样品注射的峰宽度变化非常小，证明不像不锈钢柱，实施例柱不需要调节。因此，相对于使用不锈钢柱，通过避免柱调节的需要，使用实施例柱将节省样品和时间。
如上所述，已知镍离子和钴离子通过金属螯合相互作用色谱螯合某些类型的肽或蛋白质，这将表明镍-钴合金可能对于减少与肽和蛋白质的相互作用不合宜。然而，本发明人已经证实了出人意料的结果，即与不锈钢相比，具有小于1wt%的钛的镍-钴合金显示与肽的相互作用较小。
本文描述的合金还预期在诸如离子交换分离、尺寸排阻色谱(sec)的应用和其他常用高缓冲液和盐浓度的应用中表现良好。为了抵消不锈钢的不良性能，用于这些分离类型的色谱柱通常采用诸如玻璃和peek的材料，这两者都可以限制柱的设计压力和/或显著影响柱设计的成本和复杂性。
在开发本发明的期间，本发明人还探索了具有更高水平的钛的镍-钴合金。对于下面描述的这些实验，将管材料样品与分离柱成流水线地放置，并在样品分离期间暴露于压力梯度和样品。参考管材料是熔融二氧化硅，并且被评价的管材料是mp35n(jenkintown,pa的spstechnologies,llc的商标合金)，其包括35wt％的钴、35wt％的镍、20wt％的铬、10wt％的钼和约1wt%的钛。图17包括对包括烯醇酶肽的样品的lc/ms色谱图，对于熔融二氧化硅管(色谱图400)和mp35n管(色谱图410)两者。如图所示，如方框412所指明，由包括熔融二氧化硅管的系统产生的色谱图400中明显存在的磷酸肽不存在于由包括mp35n管的系统产生的色谱图410中。因此，本发明人确定肽的吸附对合金中的钛水平敏感，并且所述镍-钴合金中的钛水平应为小于1wt%的钛。
使用镍-钴合金柱的imer
通过将颗粒表面上具有固定化胃蛋白酶的多孔颗粒的固定相填充在由mp35n制成的uplc柱硬件(2.1×30mm)中，来制备固定化酶反应器。经填充的mp35n柱与超高效液相色谱系统一起使用，具体是来自milford,ma的waters公司的nanoacquityultraperformancelc系统。关于制备和使用具有由不同材料制成的柱的imer的进一步细节出现在2014年6月12日公布的名称为“固定化酶反应器(immobilizedenzymaticreactor)”的美国专利申请公开no.2014/0162298中，其通过引用整体并入本文。与传统不锈钢硬件相比，经填充的mp35n色谱柱可承受高压，表现出良好的消化性能，并显示出在线消化中产生的肽的吸附损失下降。
镍-钴合金柱的改善的耐腐蚀性
具有低或最小限度的腐蚀、锈蚀或金属从色谱硬件渗漏在几种类型的分离中非常重要，包括(但不限于)：离子交换色谱、离子色谱、尺寸排阻色谱、反相色谱、疏水相互作用色谱、亲水相互作用色谱、凝胶渗透色谱、正相色谱、手性色谱、超临界流体色谱和亚临界流体色谱。避免色谱硬件中的腐蚀在离子交换色谱中尤为重要。为了避免暴露于高ph或低ph且含有高盐的流动相时的腐蚀，许多离子交换柱的商业供应商使用非金属硬件，如塑料柱，特别是peek色谱硬件。
应该注意的是，塑料或peek色谱硬件不适用于超高效液相色谱。当色谱硬件包括peek或塑料内衬钢时，在超高效液相色谱所需的压力下难以有效地填充色谱介质，且超高效液相色谱的使用条件超出了塑料或peek色谱硬件的正常操作范围。
因此，需要具有比不锈钢更低的腐蚀倾向的机械强度高、耐压的色谱硬件，其可用于超高效液相色谱。
为了比较耐腐蚀性，将不锈钢和镍-钴合金材料(具体为mp35nlt)色谱柱硬件管(2.1×100mm)分别填充酸(20mm1,4-二甲基哌嗪缓冲液连同1mnacl和0.05％叠氮化钠，用稀盐酸调节至ph3.5)，每一端用塑料配件盖住，并在60℃下保存一周。如上所说明的，mp35nlt是低钛等级(小于0.01wt%ti)的mp35n。在这种酸暴露之后，将管倒空到塑料小瓶中。分析两种样品以及对照酸溶液的金属含量(icp-ms，vhglabs，manchesternh，不确定度估计为+/-10%)。这些研究的结果显示在下表中。
与对照酸溶液相比，储存在不锈钢管和mp35nlt管中的酸溶液中存在的金属增加的水平表明酸与金属表面之间的反应，指明腐蚀发生。如表中所示，与存储在不锈钢柱中的酸相比，储存在mp35nlt柱中的酸具有降低的总金属浓度。因此，可以得出结论，与传统不锈钢色谱柱相比，mp35nlt在酸暴露下的腐蚀减少。这种耐腐蚀性表明低钛镍-钴合金(如mp35nlt)机械强度高到足以用于超高效液相色谱，可能特别适用于多种色谱分离，包括(但不限于)：离子交换色谱、离子色谱、尺寸排阻色谱、反相色谱、疏水相互作用色谱、亲水相互作用色谱、凝胶渗透色谱、正相色谱、手性色谱、超临界流体色谱和亚临界流体色谱。mp35nlt色谱硬件的使用特别适合用于离子交换色谱和超高效离子交换液相色谱。
虽然已经在此描述了示例性实施方案，但是应明确注意到，这些实施方案不应被解释为限制，相反，对本文明确描述的内容的添加和修改也包括在本发明的范围内。此外，应该理解，这里描述的各种实施方案的特征不是相互排斥的，并且，只要不背离本发明的精神和范围，就可以以各种组合和排列的形式存在，即使这些组合或排列没有在此作出表达。