本发明涉及多孔材料与酶固定化领域，具体涉及一种孔径可调的多级孔金属有机骨架纳米材料的制备方法以及由此得到的纳米材料及其应用。
背景技术：
金属有机骨架(Metal-organic frameworks,MOFs)作为一种由金属团簇和有机配体自组装而成的多孔材料，在近几年得到了广泛的研究和飞速的发展。与传统多孔材料相比，MOFs具有可设计的拓扑结构、可调节的物理化学特性以及种类的多样性。已经在气体的吸附与分离、催化、分子传感以及药物释放等领域取得了广泛的应用(Chem.Soc.Rev.,2017,46,126-157；Chem.Rev.,2015,115,11079-11108；Dalton Trans.,2016,45,18003-18017；CrystEngComm,2015,17,706-718)。但是很明显，孔的尺寸和孔道环境决定了客体分子在金属有机骨架中的扩散情况，而客体分子在MOFs中能够很好的扩散是上述应用的前提。然而，目前能够合成的绝大多数MOFs都是纯微孔结构，这在很大程度上限制了MOFs在涉及大分子领域内的应用。因此，发展一种能够制备具有多级孔(既包含微孔又包含介孔)的MOFs是十分重要和有意义的。
最近几年，一些制备多级孔金属有机骨架的方法被陆续的提出。比如加州伯克利大学的Yaghi教授(Science,2012,336,1018-1023)通过延长配体尺寸制备了一系类的介孔金属有机骨架，MOF-74是由2,5-二羟基对苯二甲酸与二价金属形成的微孔MOFs，Yaghi教授将苯环的数目由一个增加到最多11个，从而增加MOFs的孔笼尺寸，最大能够达到10nm；德克萨斯A&M大学的周宏才教授(J.Am.Chem.Soc.,2012,134,126-129)通过采用CTAB作为模板剂合成了Cu-BTC多级孔金属有机骨架，由CTAB形成的胶束为模板剂，柠檬酸作为模板剂与金属位点的连接剂，使模板剂在MOFs内占据一定的空间，从而形成15个纳米左右的蠕虫状孔道；另外还有其他人发展出了刻蚀法(Chem.Sci.,2017,8,6799-6803)、配体断裂法(Nat.Commun.,2017,8,15356)以及构造缺陷(Angew.Chem.Int.Ed.,2017,129,578-582)等方法。但是这些方法都有比较大的缺陷和局限性。比如延长配体法，一方面配体的延长会造成孔道的穿插，导致孔隙率和比表面积的降低，另一方面配体的延长会导致结构的不稳定性，这对材料的应用是十分不利的；而通过模板法的确可以制备一些多级孔金属有机骨架，但是很多时候模板的移除会带来孔道的坍塌，并且在MOFs结晶的时候模板的存在会导致局部非晶化；而其他的大多数制备方法也仅适用于一些稳定性差的MOFs，制备出的多级孔MOFs也因化学稳定性和热稳定性差的原因在很多领域的应用受到限制。从以上国内外的研究现状可以看出，研究者在发展多级孔的制备方法方面具有很高的热情，但是所研究出的方法具有很大局限性，制备的多级孔的MOFs稳定性差是一个亟待解决的事情，因此，发展一种简单有效的方法去制备稳定的分级孔MOFs是一项非常有应用价值并且具有挑战性的工作。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种孔径可调的多级孔金属有机骨架纳米材料的制备方法以及由此得到的纳米材料及其应用，从而利用该纳米材料的介孔结构对生物大分子进行吸附或者对酶分子进行固定化，而利用该纳米材料的微孔结构既维持了骨架良好的稳定性又为小分子催化底物提供传输通道。
本发明提供的孔径可调的多级孔金属有机骨架纳米材料的制备方法，包括如下步骤：S1，将对苯二甲酸在调节剂存在的条件下与锆盐通过溶剂热的方法合成微孔锆基金属有机骨架，其中，锆盐提供锆氧团簇作为节点，对苯二甲酸作为连接体与锆氧团簇配位自组装形成三维多孔晶体骨架；S2，将微孔锆基金属有机骨架用低沸点溶剂活化之后干燥，得到活化的微孔锆基金属有机骨架；S3，将活化的微孔锆基金属有机骨架在25-180℃下分散在0.8-5.6mol/L的一元羧酸中刻蚀，得到多级孔金属有机骨架纳米材料，其中，一元羧酸取代有机配体而与锆氧团簇配位。
在本发明中，调节剂通过与对苯二甲酸有机配体竞争配位的作用来控制颗粒尺寸的大小，当一个有机配体被两个一元羧酸取代的时候，这个有机配体将会从骨架中脱离；当一个锆氧团簇所配位的有机配体均被一元羧酸取代的时候，这个锆氧团簇也会从骨架中掉落，骨架中大量的有机配体和锆氧团簇的脱离使得多级孔诞生。因此，通过控制一元羧酸的酸度和浓度、刻蚀的时间、或刻蚀的温度，可以控制有机配体和锆氧团簇脱离的数量，从而达到控制多级孔孔参数的目的。例如，通过浓度调节，可以使得孔径在3-100nm的范围内变化；通过温度调节，可以使得孔径在3-50nm的范围内变化；通过时间调节，可以使得孔径在3-25nm的范围内变化。
该锆盐为氯化锆、六水氧氯化锆、或者硝酸锆。
该调节剂为苯甲酸。
对苯二甲酸、锆盐和调节剂的摩尔比为1：1：20。
该步骤S1具体为：将四氯化锆、对苯二甲酸溶解在溶剂中形成第一溶液，将调节剂加入第一溶液中形成第二溶液，将无机酸加入第二溶液中形成第三溶液，超声后于120℃静置得到微孔锆基金属有机骨架。
该溶剂为N,N二甲基酰胺，该无机酸为浓盐酸。
该步骤S2具体为：丙酮浸泡微孔锆基金属有机骨架。
该一元羧酸为甲酸、乙酸、丙酸、或丁酸。显然，甲酸的酸性>乙酸的酸性>丁酸的酸性>丙酸的酸性，酸性越高刻蚀能力越强。而且，刻蚀时间在0-6h范围内刻蚀程度逐渐加深，6h之后刻蚀程度基本不再变化。25-180℃温度范围内随着温度升高，刻蚀程度加深。例如，对于丙酸来说，浓度0.8-5.6mol/L范围内随着浓度增加刻蚀程度也增加，浓度低于0.8mol/L，丙酸不足以替换配体，而浓度太高又会替换过量的配体导致结构彻底破坏。
本发明提供的根据上述的制备方法得到的孔径可调的多级孔金属有机骨架纳米材料，其中，该多级孔金属有机骨架纳米材料具有介孔结构和微孔结构。
本发明还提供一种根据上述的多级孔金属有机骨架纳米材料的应用，其中，该多级孔金属有机骨架纳米材料用于吸附生物大分子细胞色素c和固定化辣根过氧化物酶。
该应用包括如下步骤：B1，将多级孔锆基金属有机骨架纳米颗粒分散于HEPES缓冲液中(pH＝7.4)溶液中；B2，在水溶液中加入生物大分子，搅拌使得生物大分子充分扩散至纳米颗粒的孔道内。将吸附前后的上清夜进行紫外-可见光谱吸收测试，根据吸收峰400到410之间吸收峰强度的变化来确定酶的吸附量(对应图10A)。
所述多级孔锆基金属有机骨架纳米颗粒可以吸附214mg/g的细胞色素c和94mg/g的辣根过氧化物酶。
该应用还包括如下步骤：C1，将辣根过氧化物酶装载在180℃下刻蚀的多级孔锆基金属有机骨架中，并在HEPES缓冲溶液中对邻苯二胺进行催化以测试其固定化后的酶催化性能，结果显示单纯的多级孔锆基金属有机骨架不具备催化性能，而负载辣根过氧化物酶后具有良好的催化性能(对应图10B)；C2，将装载了辣根过氧化物酶的多级孔锆基金属有机骨架在存在不同有机溶剂的HEPES缓冲溶液中对邻苯二胺进行催化，测试固定化酶的酶活性，以确定固定化酶的抗有机溶剂性能，结果显示负载在多级孔锆基金属有机骨架上的辣根过氧化物酶比游离的酶具有更好的耐四氢呋喃、二甲基亚砜和丙酮的性能(对应图10C)；以及C3，将装载了辣根过氧化物酶的多级孔锆基金属有机骨架在HEPES缓冲溶液中对邻苯二胺进行催化，然后洗涤再次催化，循环几次，以测试固定化酶的循环性能，结果显示固定在多级孔锆基金属有机骨架上的辣根过氧化物酶循环催化五次后依然保持大约75％的活性(对应图10D)。
在根据本发明的孔径参数可调的分级孔锆基金属有机骨架可有效吸附生物大分子，并且可以固定化酶分子进行高效酶催化。对细胞色素c装载实验表明，本发明的孔径参数可调的多级孔金属有机骨架的装载量可达到214mg/g，同时对辣根过氧化物酶的固定量可达到94mg/g。酶催化实验表明，本发明的孔径参数可调的多级孔锆基金属有机骨架多级在固定辣根过氧化物酶后，对邻苯二胺表现出高效的催化能力、良好的循环能力以及优秀的抗有机溶剂能力。根据本发明的制备过程简单高效，重复性好，通过简单的刻蚀步骤即可得到稳定的多级孔结构，实现对生物大分子的吸附和酶分子的有效固定。
总之，根据本发明的制备方法，在一元羧酸刻蚀形成多级孔的过程中，部分微孔被保留下来，这使得得到的多级孔金属有机骨架具有和原微孔骨架相似的化学稳定性和热稳定性。根据本发明的纳米材料，金属有机骨架能够有效地吸附和固定生物大分子，在吸附分离、酶的固定化以及催化领域展现出良好的应用前景。根据本发明的应用，多级孔金属有机骨架固定的辣根过氧化物酶具有良好的循环性能和抗有机溶剂性能。
附图说明
图1是根据本发明的孔径可调的多级孔金属有机骨架纳米材料的制备方法的工艺流程图；
图2是根据本发明的实施例1得到的各多级孔金属有机骨架纳米材料的XRD图谱；
图3A是根据本发明的实施例1得到的各多级孔金属有机骨架纳米材料的氮气吸附-脱附图；
图3B是根据本发明的实施例1得到的各多级孔金属有机骨架纳米材料的孔径分布图；
图4a是根据本发明的实施例1的利用甲酸刻蚀得到的多级孔金属有机骨架纳米材料的扫描电镜图；
图4b是图4a的局部放大图；
图4c是根据本发明的实施例1的利用乙酸刻蚀得到的多级孔金属有机骨架纳米材料的扫描电镜图；
图4d是图4c的局部放大图；
图4e是根据本发明的实施例1的利用丙酸刻蚀得到的多级孔金属有机骨架纳米材料的扫描电镜图；
图4f是图4e的局部放大图；
图4g是根据本发明的实施例的利用丁酸刻蚀得到的多级孔金属有机骨架纳米材料的扫描电镜图；
图4h是图4g的局部放大图；
图5A是根据本发明的实施例2得到的各多级孔金属有机骨架纳米材料的氮气吸附-脱附图；
图5B是根据本发明的实施例2得到的各多级孔金属有机骨架纳米材料的孔径分布图；
图6A是根据本发明的实施例3得到的各多级孔金属有机骨架纳米材料的氮气吸附-脱附图；
图6B是根据本发明的实施例3得到的各多级孔金属有机骨架纳米材料的孔径分布图；
图7a是根据本发明的实施例3的利用0.4mol/L的丙酸刻蚀得到的多级孔金属有机骨架纳米材料的透射电镜照片；
图7b是根据本发明的实施例3的利用0.8mol/L的丙酸刻蚀得到的多级孔金属有机骨架纳米材料的透射电镜照片；
图7c是根据本发明的实施例3的利用1.6mol/L的丙酸刻蚀得到的多级孔金属有机骨架纳米材料的透射电镜照片；
图7d是根据本发明的实施例3的利用3.2mol/L的丙酸刻蚀得到的多级孔金属有机骨架纳米材料的透射电镜照片；
图7e是根据本发明的实施例3的利用4.8mol/L的丙酸刻蚀得到的多级孔金属有机骨架纳米材料的透射电镜照片；
图7f是根据本发明的实施例3的利用5.6mol/L的丙酸刻蚀得到的多级孔金属有机骨架纳米材料的透射电镜照片；
图8A是根据本发明的实施例4得到的各多级孔金属有机骨架纳米材料的氮气吸附-脱附图；
图8B是根据本发明的实施例4得到的各多级孔金属有机骨架纳米材料的孔径分布图；
图9a是根据本发明的实施例1的步骤b得到的微孔锆基金属有机骨架(micro-UiO-66)的透射电镜照片；
图9b是根据本发明的实施例4的25℃下刻蚀得到的多级孔金属有机骨架纳米材料的透射电镜照片；
图9c是根据本发明的实施例4的60℃下刻蚀得到的多级孔金属有机骨架纳米材料的透射电镜照片；
图9d是根据本发明的实施例4的100℃下刻蚀得到的多级孔金属有机骨架纳米材料的透射电镜照片；
图9e是根据本发明的实施例4的140℃下刻蚀得到的多级孔金属有机骨架纳米材料的透射电镜照片；
图9f是根据本发明的实施例4的180℃下刻蚀得到的多级孔金属有机骨架纳米材料的透射电镜照片；
图10A是根据本发明的实施例4的180℃下刻蚀得到的多级孔金属有机骨架纳米材料的吸附辣根过氧化物酶的紫外-可见吸收光谱图；
图10B是根据本发明的实施例4的180℃下刻蚀得到的多级孔金属有机骨架纳米材料的固定化酶对邻苯二胺的催化效果对比图；
图10C是根据本发明的实施例4的180℃下刻蚀得到的多级孔金属有机骨架纳米材料的固定化酶的抗有机溶剂性能测试；
图10D是根据本发明的实施例4的180℃下刻蚀得到的多级孔金属有机骨架纳米材料的固定化酶的循环性能测试。
具体实施方式
下面结合附图，给出本发明的较佳实施例，并予以详细描述。
在本发明中，MOF指的是金属有机骨架(Metal Organic Framework)；micro指的是微孔(microporous)；UiO-66指的是MOF的名称，根据首次合成出该MOF所在大学命名得来，其中，UiO是挪威奥斯陆大学的英文缩写，66是该大学合成的第66个金属有机骨架。
实施例1
如图1所示，在室温条件下，
a.将4毫摩尔的四氯化锆溶解在72mlN,N二甲基酰胺中(DMF)，然后加入80毫摩尔的苯甲酸做有机配体，溶解后加入对苯二甲酸和660微升的浓盐酸(质量分数37％)，超声30min后在120℃烘箱中静置24小时；
b.将冷却至室温的材料离心，用DMF洗涤三次，分散于丙酮中置换DMF，置换三天，每12小时换一次丙酮。然后100℃真空干燥24小时得微孔锆基金属有机骨架(micro-UiO-66)；
c.将100mg微孔锆基金属有机骨架(micro-UiO-66)分散在1.6mol/L的不同一元羧酸(甲酸FA、乙酸AA、丙酸PA和丁酸BA)溶液中，100℃静置6小时后，水和乙醇各洗几次，100℃干燥24小时得不同一元羧酸刻蚀出的多级孔金属有机骨架纳米材料。
图2是根据本实施例得到的各多级孔金属有机骨架纳米材料的XRD图谱，所有多级孔金属有机骨架纳米材料的布拉格衍射峰与模拟的UiO-66相一致，说明成功合成了通过不同酸刻蚀的多级孔金属有机骨架纳米材料。
图3是根据本实施例得到的各多级孔金属有机骨架纳米材料的氮吸附-脱附曲线以及孔径分布。可以看出丙酸和乙酸刻蚀后依然有好的XRD衍射峰和比较均一的孔径分布。
图4是根据本实施例得到的各多级孔金属有机骨架纳米材料的透射电镜照片，可以很明显的看到多级孔的存在。下表1中给出了各酸刻蚀前后样品的孔结构参数，由此可知，通过甲酸FA、乙酸AA、丙酸PA和丁酸BA均能实现刻蚀而产生分级孔。
表1
实施例2
将100mg微孔锆基金属有机骨架(micro-UiO-66)分散在1.6mol/L的丙酸溶液中，100℃静置不同时间后，水和乙醇各洗几次，100℃干燥24小时得不同刻蚀时间的多级孔金属有机骨架纳米材料。
图5是根据本实施例得到的各多级孔金属有机骨架纳米材料的氮吸附-脱附曲线以及孔径分布。可以看出6小时刻蚀达到平衡。下表2中给出了不同刻蚀时间样品的孔结构参数，由此可知，刻蚀时间选择6小时已经足够了。
表2
实施例3
实施方法以及基本配方与实施例2相同，只改变丙酸的浓度为0.4、0.8、3.2、4.8和5.6mol/L，得到得不同丙酸浓度调节的多级孔金属有机骨架纳米材料。
图6是根据本实施例得到的各多级孔金属有机骨架纳米材料的氮吸附-脱附曲线以及孔径分布图，图7是根据本实施例得到的各多级孔金属有机骨架纳米材料的的透射电镜照片。可以发现介孔的出现至少需要0.8mol/L的酸浓度，并且随着酸浓度的增加孔的范围越来越大。下表3中给出了不同酸浓度刻蚀样品的孔结构参数由此可知，一元羧酸的浓度应该选择在0.8～5.6mol/L。
表3
实施例4
实施方法以及基本配方与实施例2相同，只改变刻蚀的温度为25、60、100、140、180℃，得到得不同温度调节的多级孔金属有机骨架纳米材料。
图8是根据本实施例得到的各多级孔金属有机骨架纳米材料的氮吸附-脱附曲线以及孔径分布图，图9是根据本实施例得到的各多级孔金属有机骨架纳米材料的透射电镜照片。随着酸温度的增加孔的范围越来越大。下表4中给出了不同温度刻蚀样品的孔结构参数，由此可知，刻蚀在不同温度下均可以发生，在25℃～180℃范围内随着温度升高刻蚀程度增加。
表4
实施例5
将实施例4所得的180℃刻蚀出的多级孔金属有机骨架纳米材料分散于辣根过氧化物酶(HRP)的HEPES(pH7.4)溶液中，于4℃搅拌24h，离心后得到HRP-UiO-66-180。图10A是吸附辣根过氧化物酶的紫外-可见吸收光谱图。由此可知，180℃刻蚀后的多级孔锆基金属有机骨架对辣根过氧化物酶有明显的吸附量，并且吸附量要高于100℃刻蚀的。
实施例6
将实施例5所得的HRP-UiO-66-180分散于邻苯二胺的HEPES(pH7.4)溶液中，加入不同浓度的双氧水，通过监测溶液在418nm处的吸光度变化来测定催化活性。图10B是固定化酶对邻苯二胺的催化效果对比图。由此可知，负载酶后的材料具有明显的催化活性，而未负载的以及负载后材料的洗涤液都没有酶活性，这也说明负载的酶不会脱落。
实施例7
将实施例5所得的HRP-UiO-66-180分散于邻苯二胺的HEPES(pH7.4)溶液中，加入同等体积的有机溶剂，然后加入不同浓度的双氧水，通过监测溶液在418nm处的吸光度变化来测定固定化酶活性，从而得到固定化酶抗有机溶剂性能。图10C是固定化酶的抗有机溶剂性能测试。由此可知，固定化酶比游离酶具有更好的抗四氢呋喃、二甲基亚砜和丙酮的能力。
实施例9
将实施例5所得的HRP-UiO-66-180分散于邻苯二胺的HEPES(pH7.4)溶液中，加入不同浓度的双氧水，通过监测溶液在418nm处的吸光度变化来测定固定化酶活性，然后离心，用HEPES溶液洗涤两次后再次如上方法测定酶活性，如此循环五次。图10D是固定化酶的循环性能测试图。由此可知，固定在多级孔锆基金属有机骨架上的辣根过氧化物酶循环催化五次后依然保持大约75％的活性。
本发明按照合适的配方，通过一元羧酸取代有机配体而造成大量有机配体和金属团簇脱落的机理构造了多级孔锆基金属有机骨架。其中，通过调变一元羧酸种类、改变酸浓度、改变酸刻蚀时间、改变反应温度可以对多级孔的参数进行有效调节；此外，得到的多级孔结构继承了原微孔结构的化学稳定性和热稳定性。这种多级孔结构能够吸附生物大分子、能够有效地固定化酶分子，在吸附分离和酶催化等领域展现出良好的应用前景。
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。