本发明涉及磺酸化海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质及制备方法和应用，属于生物技术领域中的蛋白质色谱分离技术。
背景技术：
离子交换色谱作为一种高效的分离技术，被广泛应用于蛋白质的分离纯化中。近年来，接枝型离子交换色谱通过在基础介质上进行聚合物接枝能提高蛋白质的吸附容量和传质速率，成为研究的热点。
海藻酸钠是一类从褐藻中提取的天然线性多糖，是由β-d-甘露糖醛酸(m单元)和α-l-古洛糖醛酸(g单元)通过1,4-糖昔键连接，并由不同的gg、gm或mm片段以一定比例构成的无规嵌段共聚物(journalofcontrolledrelease,2006,114(1):1-14)。目前，海藻酸钠因其价格低廉，安全可靠及生物相容性良好，被广泛应用制备水凝胶。最近研究者基于海藻酸钠含有大量羧基，将海藻酸钠作为聚合物型离子交换配基偶联在琼脂糖凝胶sepharoseff上，制备出一种新型聚合物接枝型阳离子交换色谱(biochemicalengineeringjournal,2017,126:50-57)。与传统非接枝介质相比，海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶介质对蛋白质显示出了优越的吸附和传质性能，且在一定的盐浓度和流速范围内其动态结合容量也高于商品化非接枝介质。
然而，海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶介质由于接枝聚合物上所带电荷密度较低，导致其只能够在低盐浓度范围提升蛋白的吸附容量和传质速率。另外，一些传统的介质由于耐盐性较低，需要在进样前将含有高盐的样品稀释，这在生物产品的分离过程中十分耗时和昂贵(biotechnologyjournal,2015,10(12):1929-1934)。基于上述海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶介质在蛋白质分离过程中的缺点，本发明采用在海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶介质表面修饰磺酸基制备出具有较高的电荷密度的磺酸化海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质，提高介质对蛋白质的吸附性能，使其在较高盐浓度下依然发挥对蛋白质的吸附作用。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，进而提供一种提高蛋白质吸附性能的磺酸化海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质。磺酸化海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质具有高吸附容量的优点。本发明即为将磺酸化海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质应用于蛋白质的高效吸附中，具有高吸附容量和高动态结合容量的优点，相较于传统非接枝型色谱介质及海藻酸钠修饰的离子交换色谱介质，能够大幅度的提升吸附容量，制备工艺简单，成本低廉，生物相容性好。因此，磺酸化海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质非常适用于蛋白质的高效分离纯化中。
本发明的技术方案概述如下：
一种用于提高蛋白质吸附容量的磺酸化海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质的制备方法，为在海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶介质表面修饰磺酸基以提高色谱介质的电荷密度。
磺酸化海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质的结构式如下：
本发明磺酸化海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质中，海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶介质的离子交换容量为210-230mmol/l。
本发明在海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶介质表面修饰磺酸基的制备方法如下：
1)在海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质中加入氢氧化钠溶液、二甲基亚砜和烯丙基溴，置于恒温水浴摇床中反应，反应产物经反复洗涤后抽干；
2)将步骤1)中反应得到的介质加入到焦亚硫酸钠溶液中，并用氢氧化钠溶液调节ph值6.0-6.5，置于恒温水浴摇床中反应；反应产物经去离子水反复冲洗，得到如结构式所示的磺酸化海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质。
所述步骤1)中氢氧化钠溶液浓度为0.6-6.0mol/l，体积为0.5-1.0ml/g海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶介质，二甲基亚砜体积用量为0.3-0.6ml/g海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶介质，烯丙基溴体积用量为0.3-0.6ml/g海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶介质。
所述步骤1)中置于20-30℃恒温水浴摇床中反应12-48h。
所述步骤2)中焦亚硫酸钠溶液浓度为20-200mg/ml，体积为1-10ml/g烯丙基溴活化介质。
所述步骤2)中置于20-30℃恒温水浴摇床中120-200rpm反应12-48h。
本发明磺酸化海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质应用于蛋白质高效分离纯化中，提升蛋白质的静态吸附容量和动态结合容量。
本发明首先是海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质的选择，离子交换容量较高的色谱介质具有优越的吸附和传质性能；其次，烯丙基溴活化过程中氢氧化钠浓度的控制，高浓度的氢氧化钠有利于获得高活化率的介质，从而为获得高电荷密度的磺酸基修饰介质提供基础；最后，焦亚硫酸钠浓度的确定，合适的溶液ph值，充足的磺酸化时间有助于获得高电荷密度的磺酸化海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质。
经实验证明，磺酸化海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质在不同的磺酸基修饰密度下对蛋白质均具有很强的吸附特性，表现出了很高的吸附容量，提高了分离效率。介质清洗方便，易于再生，生物相容性好，制备方法简单，本发明中磺酸化海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质对溶菌酶的静态饱和吸附容量可高达358mg/ml，在10％穿透条件下动态结合容量最低也在100mg/ml以上。该介质制备方法简单，成本低，在蛋白质高效分离纯化中将有广阔的应用前景。
附图说明
图1：海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质、实施例1制备的介质和实施例3制备的介质在20mmol/ltris–hcl缓冲液(ph8.0)中对溶菌酶的吸附等温线；
图2：实施例3制备的介质、商品化介质cmsepharoseff和海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质在含有不同浓度氯化钠(0、50、100、150mmol/l)的20mmol/ltris–hcl缓冲液(ph8.0)中对溶菌酶的动态结合容量。
具体实施方式
下面的实例将对本发明提供的方法予以进一步的说明。
本发明磺酸化海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质的制备方法如下：
1)在海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质中加入浓度为0.6-6.0mol/l，体积为0.5-1.0ml/g海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶介质的氢氧化钠溶液、体积用量为0.3-0.6ml/g海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶介质的二甲基亚砜和体积用量为0.3-0.6ml/g海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶介质的烯丙基溴，置于20-30℃的恒温水浴摇床中，120-200rpm搅拌混合12-48h，反应产物经0.1mol/l的氢氧化钠溶液、25％v/v乙醇、0.5mol/l的氯化钠溶液以及去离子水反复交替清洗至清洗液经高锰酸钾检测不变色。
2)将步骤1)中反应得到的介质加入到浓度为20-200mg/ml，体积为1-10ml/g烯丙基溴活化介质的焦亚硫酸钠溶液中，并用1mol/l的氢氧化钠溶液调节混合液ph值为6.0-6.5，置于20-30℃恒温水浴摇床中，120-200rpm下反应12-48h；反应产物经去离子水反复冲洗，得到如结构式所示的磺酸化海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质。
其中，离子交换容量为210-230mol/l的海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质可通过相关文献报导的方法制备(biochemicalengineeringjournal,2017,126:50-57)，具体实验方法如下所示：
在琼脂糖凝胶中加入二甲基亚砜和环氧氯丙烷，混合制得混合悬浮液，二甲基亚砜体积用量为琼脂糖凝胶介质体积的2倍；环氧氯丙烷体积用量为琼脂糖凝胶介质体积的1倍；再向混合悬浮液中加入浓度为1.0mol/l氢氧化钠溶液，氢氧化钠溶液体积为琼脂糖凝胶介质体积的2倍，置于25℃的恒温水浴摇床中，170rpm活化2-4h后，用去离子水洗涤介质至无游离环氧氯丙烷，重复此反应两遍，得到表面带有活性环氧基的琼脂糖凝胶介质。在含有环氧基的介质中加入1.5ml/g活化介质的浓氨水(25％，w％)于40℃的恒温水浴摇床中，170rpm反应3h，将介质表面的环氧基转变为氨基，用去离子水洗涤介质至清洗液经酚酞检测不变红。然后在表面带有氨基的介质中加入0.2mol/l磷酸二氢钠缓冲液(ph5.0)，混合制得混合悬浮液，磷酸二氢钠缓冲液体积用量为介质体积的1倍；再向混合悬浮液中加入海藻酸钠，所加海藻酸钠的粘度为4-12cp(1％solution)，海藻酸钠加入量为介质质量的0.06-0.09倍，置于25℃的恒温水浴摇床中，170rpm搅拌24h使海藻酸钠充分扩散至介质孔道中；然后加入总体系浓度为0.68mol/l的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和总体系浓度为0.17mol/l的n-羟基琥珀酰亚胺，置于25℃的恒温水浴摇床中，170rpm反应24h后，用大量去离子水清洗清洗介质，制备得到离子交换容量为210-230mol/l的海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质。
实施例1：
1)将5.0ml的naoh(1.0mol/l)，3.0ml的dmso和3.0ml的烯丙基溴加入到5g海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶介质中，置于30℃水浴摇床中，120rpm反应24h。反应产物依次用0.1mol/lnaoh、25％v/v乙醇、0.5mol/l的nacl和大量去离子水清洗，直到清洗液经高锰酸钾溶液检测不变色；
2)将5g步骤1)中反应得到的介质悬浮于5ml的焦亚硫酸钠水溶液(200mg/ml)中，用1mol/l的naoh滴定至ph6.3以产生磺酸钠，置于20℃水浴摇床中，200rpm反应12h。反应产物用去离子水反复冲洗，获得如结构式所示的离子交换容量为276mmol/l的磺酸化海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质。
实施例2：
1)将2.5ml的naoh(0.6mol/l)，1.5ml的dmso和1.5ml的烯丙基溴加入到5g海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶介质中，置于20℃水浴摇床中，200rpm反应12h。反应产物依次用0.1mol/lnaoh、25％v/v乙醇、0.5mol/l的nacl和大量去离子水清洗，直到清洗液经高锰酸钾溶液检测不变色；
2)将5g步骤1)中反应得到的介质悬浮于50ml焦亚硫酸钠水溶液(20mg/ml)中，用1mol/l的naoh滴定至ph6.0以产生磺酸钠，置于25℃水浴摇床中，150rpm反应18h。反应产物用去离子水反复冲洗，获得如结构式所示的离子交换容量为256mmol/l的磺酸化海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质。
实施例3：
1)将1.5ml的naoh(4.0mol/l)，0.9ml的dmso和0.9ml的烯丙基溴加入到3g海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶介质中，置于25℃水浴摇床中，120rpm反应48h。反应产物依次用0.1mol/lnaoh、25％v/v乙醇、0.5mol/l的nacl和大量去离子水清洗，直到清洗液经高锰酸钾溶液检测不变色；
2)将3g步骤1)中反应得到的介质悬浮于6ml焦亚硫酸钠水溶液(100mg/ml)中，用1mol/l的naoh滴定至ph6.5以产生磺酸钠，置于30℃水浴摇床中，120rpm反应48h。反应产物用去离子水反复冲洗，获得如结构式所示的离子交换容量为378mmol/l的磺酸化海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质。
实施例4：
1)将8ml的naoh(6.0mol/l)，5.0ml的dmso和5.0ml的烯丙基溴加入到10g海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶介质中，置于30℃水浴摇床中，170rpm反应48h。反应产物依次用0.1mol/lnaoh、25％v/v乙醇、0.5mol/l的nacl和大量去离子水清洗，直到清洗液经高锰酸钾溶液检测不变色；
2)将10g步骤1)中反应得到的介质悬浮于50ml焦亚硫酸钠水溶液(40mg/ml)中，用1mol/l的naoh滴定至ph6.0以产生磺酸钠，置于25℃水浴摇床中，170rpm反应24h。反应产物用去离子水反复冲洗，获得如结构式所示的离子交换容量为360mmol/l的磺酸化海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质。
实施例5：
将实施例1中的介质和实施例3中的介质分别用20mmol/ltris–hcl缓冲液(ph8.0)平衡后，用g3漏斗抽干，称取0.05g平衡后介质分别加入到5ml用平衡缓冲液配制的不同浓度的溶菌酶溶液中，上述介质悬浮液置于25℃，170rpm恒温水浴振荡24h后，离心后取上清液在280nm下测吸光值，通过物料衡算确定蛋白质在介质上的吸附量，并使用langmuir模型描述蛋白质的吸附行为。
比较：将海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶介质用20mmol/ltris–hcl缓冲液(ph8.0)平衡后，用g3漏斗抽干，称取0.05g平衡后介质分别加入到5ml用平衡缓冲液配制的不同浓度的溶菌酶溶液中，上述介质悬浮液置于25℃，170rpm恒温水浴振荡24h后，离心后取上清液在280nm下测吸光值，通过物料衡算确定蛋白质在介质上的吸附量，并使用langmuir模型描述蛋白质的吸附行为。
实施例1和实施例3中获得的磺酸化海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质和海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶介质分别对溶菌酶的静态饱和吸附量如表1所示，相应的吸附等温线如图1所示。
表1不同介质对溶菌酶的吸附容量
由结果可知，三种介质对溶菌酶的饱和静态吸附容量均达到200mg/ml以上，且随着介质离子交换容量的升高而增加。其中，实施例3中的介质对溶菌酶的静态饱和吸附容量可高达358mg/ml。在相同的实验条件下，商品化介质cmsepharoseff对溶菌酶的静态饱和吸附容量为190mg/ml，这说明经过磺酸基修饰后的介质对溶菌酶的吸附容量显著提高，吸附性能优于商品化介质。
实施例6：
取1.0ml实施例3中的介质装填于tricorntm5/50色谱柱中，分别用含有不同浓度氯化钠(0、50、100、150mmol/l)的20mmol/ltris–hcl缓冲液(ph8.0)平衡后，以迎头分析模式上样考察溶菌酶的动态结合容量(以10％穿透点计算蛋白质的动态结合容量)。
比较：将商品化介质cmsepharoseff和海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶介质分别装填于tricorntm5/50色谱柱中，分别用含有不同浓度氯化钠(0、50、100、150mmol/l)的20mmol/ltris–hcl缓冲液(ph8.0)平衡后，以迎头分析模式上样考察溶菌酶的动态结合容量(以10％穿透点计算蛋白质的动态结合容量)。
实施例3中获得的介质与商品化介质cmsepharoseff、海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶介质在不同氯化钠浓度下分别对溶菌酶的动态结合容量如图2所示。
由结果可知，三种介质对蛋白质的动态结合容量随离子强度的增加而下降，在氯化钠浓度为150mmol/l下实施例3中的介质对蛋白质的动态结合容量依然可以保持在较高的水平，是商品化介质cmsepharoseff和海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶介质的5倍左右。
本发明提出的磺酸化海藻酸钠接枝琼脂糖凝胶色谱介质的制备方法与在提高蛋白质静态吸附容量和动态结合容量的应用，已通过现场较佳实验例进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。