本发明涉及材料科学领域，特别是涉及探测2，4，6-三硝基苯酚分子印迹的制备方法。
背景技术：
当今世界国际关系复杂多变，爆炸等恐怖暴力事件频繁发生，严重危害了世界各国人民群众的生命财产安全和社会稳定，并对国家、地区的安全与稳定构成了威胁。因此，爆炸物的检测分析引起了各国研究机构的高度重视，试图通过分析检测技术手段预判爆炸物存在，降低爆炸物对人类的伤害。2，4，6-三硝基苯酚（2，4，6-trinitrophenol，tnp）属于酚类物质，又称为苦味酸（picricacid，pa）。其原料易得，制备简单，爆炸威力大，是常见的爆炸物之一。同时，苦味酸也用于农业上的杀菌剂和除霉剂，医药上的杀菌剂和收敛剂。长期接触苦味酸会引发头痛、恶心、腹泻、发热等症状，对身体伤害很大。随着工业化的发展，大量的苦味酸排入水中，造成水源污染。苦味酸广泛的用途，不当的使用会对人类产生很大的危害，因此，迫切需要一种快速识别和敏感检测的技术手段来检测爆炸物以有效地降低爆炸物对人类的伤害，具有十分重要的现实意义。
目前检测爆炸物的方法有分光光度法、电化学法、毛细管电泳法、高效液相色谱法、气相色谱法等（bowerbankcr；smithpa；fetterolfdd.jchromatogr.a，2000，902(2)：413-419；waynehgriest；stacy-annbarshick.anal.chem.1998，70，3015-3020），但这些方法通用性差，易发生柱污染，因此，仍需要不断探索新的检测方法。ronital发表学术论文（talanta，2005，66(2)：581–590）高效液相色谱-光电辅助电化学检测（high-performanceliquidchromatographyphotoassistedelectro-chemicaldetection，hplc-paed）与紫外吸收（ultravioletabsorbance，uv）检测结合使用，用于测定环境样品中的爆炸物。该系统利用在线固相萃取技术（solid-phaseextract，spe）进行样品预处理（即分馏和浓缩），spe可根据简单的色谱原理进行分离和预浓缩目标分析物，适用于地下水中爆炸物的评估。rogert发表论文（anal.chem.1999，71，2739-2744）提出了快速连续进样分光光度法测定土壤样品中2，4，6-三硝基甲苯（2，4，6-trinitrotoluene，tnt）的方法。该方法基于tnt与亚硫酸钠在碱性丙酮介质中的衍生化反应。且反应中所用样品，采用的丙酮百分比，试剂体积以及混合旋管体积，反应的时间等条件均被优化。发现该反应对丙酮浓度特别敏感，在88％丙酮/水（v/v）介质中是最佳的。且该方法对其他爆炸物的响应研究表明，只对tnt有特定的选择性。信阳师范学院曹新华等人公开了发明专利（cn201610716172.8）“一种萘酰亚胺的有机凝胶化合物及其制备方法、凝胶及应用”，该发明用4-溴-1，8-萘酐与烷基胺按摩尔比1:1.2在甲苯溶液中加热回流反应生成n-烷基-4-溴1，8-萘酰亚胺；然后在碳酸钾存在的条件下，在二甲基亚砜溶液中n-烷基-4-溴1，8-萘酰亚胺与4-羟基吡啶按摩尔比1:1.5，100℃条件反应12小时，利用简单的烷基胺引入具有荧光性质萘酰亚胺基团，且可以形成凝胶，该凝胶用于检测2，4，6-三硝基苯酚。
荧光分析方法也是检测爆炸物的一种常用方法。arvinsaintanwar等人发表论文（acssens.2016，1，1070−1077）表述了一种新的聚芴衍生物，通过铃木偶联聚合方法合成了高产量的迅速和特异性地识别22.9pg水平的硝基爆炸性苦味酸，通过核磁共振、紫外可见、荧光、时间分辨光致发光光谱和循环伏安法对聚合物进行了良好的表征。该衍生物通过强大的内部滤波效应实现了专用于苦味酸的放大的信号响应，该现象不同于广泛报道的基于硝基芳烃检测的基态电荷转移或基于共振能量转移（fluorescencerenounceenergytransfer，fret）的探针，通过质子化辅助光致电子转移（photoinducedelectrontransfer,pet），即使在最常见的干扰性硝基爆炸物以及其他通常在天然水中发现的分析物存在下，聚芴衍生物侧链上的侧基胺基团也能提供更高的灵敏度和出色的选择性。因此，基于聚芴衍生物的平台即使在溶液和固态的竞争环境中也能以非常低的水平监测pa的痕迹。lisac等人在（anal.chem.1995，67，2431-2435）为了检测最广泛使用的炸药tnt，开发了竞争性免疫测定法。三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzenesulfonicacid，tnb）是tnt的类似物，用荧光团标记并用作分析物竞争者。将含有7.5ng/ml磺基靛菁5-乙二胺标记的tnb（cy5-eda-tnb）的溶液暴露于抗体包覆的光纤，产生高于背景的对应于100％或参照信号的特定信号，100％信号的抑制与样品中的tnt浓度成比例。可以检测缓冲液中10ng/ml的tnt（8ppb）的灵敏度。因为有其他分析物，容易产生干扰，降低了检测的准确度。南京邮电大学石乃恩等人公开发明专利（cn201610219036.8）“一种铕基金属有机框架六棱片及其制备方法与应用”，制备出铕基金属有机框架六棱片的n，n-二甲基甲酰胺（n，n-dimethylformamide，dmf）分散液，经滤纸过滤，得到六棱片材料制备的薄膜，在波长为365nm的紫外光激发光下，该薄膜发出红色荧光，滴加了pa的dmf溶液之后，在波长为365nm的紫外光下，原来的红色荧光几乎完全猝灭，滴加2，4-二硝基甲苯（2，4-dinitrotoluene，dnt）的dmf溶液后，在波长为365nm的紫外光下，原来的红色荧光明显减弱。猝灭程度的不同是因为该铕基金属有机框架六棱片薄膜对不同的爆炸物有不同的检测效果。结合荧光分析原理，光学传感器成为十分流行的检测装置，priyankadutta等人（acsappl.mater.interfaces2015，7，24778−24790）报道了一种高荧光材料聚乙烯醇接枝聚苯胺（ppa）及其与2-巯基琥珀酸（msa）封端的cdte量子点（ppa-q）和msa封端的cdte/zns核/壳量子点（ppa-csq）的纳米复合材料单步合成自由基聚合反应。在cdte核上形成zns壳增加了量子点（quantumdots，qds）的稳定性和量子产率，并且在很大程度上降低了其毒性。这项工作报道了高荧光材料的发展，以选择性和有效的检测纳米范围内的苦味酸爆炸物荧光猝灭现象，在淬灭现象中运行的机理被认为是聚合物与苦味酸之间的强内部过滤效应和基态静电相互作用的结合。且用传感系统对苦味酸进行视觉检测的便携式和低成本的电子设备已经成功制造出来，该装置进一步用于实际水样中苦味酸的定量检测。该方法选择性差，容易受到其他淬灭剂的干扰。varunvij等人发表学术论文（acsappl.mater.interfaces2013，5，5373−5380）中设计合成了己六苯并壬烯5和6的衍生物（hbc），它们在混合水性介质中形成荧光聚集体，这些衍生物在外围具有空间要求的叔丁基，溶解度大大增加。此外，引入两个可旋转的苯基作为转子，这使得在六苯并苯分子中产生聚集诱导发射增强现象，增加hbc作为荧光化学传感器的效用，这些聚集体能够检测蒸汽状态的pa。这是hbc首次报道聚集诱导排放增强（aiee）现象，给出荧光聚集体作为选择性化学传感器来检测溶液中的pa以及蒸气状态。为了便捷和低成本检测pa，制备了荧光试纸，这种试纸条可以检测到蒸汽和接触模式下的超痕量pa，有助于pa的微量检测。akhtarhussainmalik等人在论文（acsappl.mater.interfaces2015，7，26968−26976）中制备一种新型共轭聚合物材料pfmi，在聚合物pfmi侧链上的阳离子咪唑鎓盐基团作为pa的特异性识别位点，也促进了该探针在极性溶剂（dmso、甲醇等）中的溶解度。采用自发性再沉淀方法生成良好的纳米颗粒，在皮摩尔水平上首次实现了苦味酸的检测。分别在100%的水介质中使用共轭聚合物纳米粒子（cpns）和在固体状态下使用可移动的纸带测量苦味酸，同时这两种pfmi纳米颗粒（pfmi-nps）制备的终端传感器装置，为pa在蒸汽状态下的检测提供了一种手段。pfmi-nps探头探测pa的超敏性机理可能是基于“分子线效应”、静电相互作用、光致电子转移和共振能量转移原理。中国科学院新疆理化技术研究所窦新存等人公开发明专利（cn201610344253.x）“一种基于光电响应的爆炸物蒸气识别检测方法”。该发明涉及一种基于光电响应的爆炸物蒸气识别检测方法，该方法中涉及的装置是由传感器、光源、电源、电流表、信号处理器和报警器组成，使用可周期性开关和改变光强变化的光源，照射具有快速光电响应的单个传感器上，测量爆炸物蒸气在传感器敏感材料表面吸附引起的光电流变化，通过主成分分析、线性判别分析、人工神经网络等模式识别方法进行数据处理，实现传感器阵列对不同种类爆炸物蒸气响应的标准数据库，通过将疑似爆炸物的数据处理结果与数据库比对，最终达到识别检测爆炸物蒸气的目的。华南师范大学汪朝阳等人公开了发明专利（cn106008358a）“一种用于硝基芳烃爆炸物荧光猝灭检测的苯并咪唑基化学传感器及其制备方法”，以二（苯并咪唑）萘和卤代烃为原料，主要通过简单易行的n-烷基化取代反应，制得以检测苦味酸为主的，高选择性、高灵敏性检测爆炸性硝基芳香化合物。制得的苯并咪唑基荧光化学传感器在紫外灯下利用荧光猝灭溶液中和固态下可视检测苦味酸，并且可以实现气态苦味酸的检测。上述方法取得了很大的进展，也实现了现场检测苦味酸的难题，但是制作过程复杂，成本高，重复利用率低。
近年来，对于爆炸物的检测技术要求越来越高，痕量物质的检测手段也出现在大众视野里。高大明等人在二氧化硅纳米粒子表面进行共振能量转移-放大荧光猝灭（anal.chem.2008，80，8545–8553），荧光染料和氨丙基共价修饰到二氧化硅纳米粒子的表面，形成染料荧光团和氨配体的杂化单层。荧光二氧化硅颗粒可以通过富电子氨配体和缺电子芳香环之间的电荷转移络合相互作用特异性结合tnt物质。硅片上的纳米粒子组装阵列可以灵敏地检测低至约1nmol·l-1的tnt，仅仅使用了10μl的tnt溶液（~2pgtnt）和几个ppb的tnt蒸气。这种基于fret的纳米颗粒传感器表现出稳定的荧光亮度，对目标分析物亲和力强和良好的组装灵活性，因此，可以应用在超对痕量目标分析物检测领域。江南大学魏玮等人公开发明专利（cn2014000560284.x）“一种检测2，4，6-三硝基苯酚的荧光化学传感器及其制备方法”，以六氯环三膦腈与姜黄素通过一步缩聚的方法，制备一种具有高度交联结构的有机-无机杂化聚合物荧光传感器，实现液相中2，4，6-三硝基苯酚的特异性识别和检测，适用于痕量爆炸物检测及环境监测领域，具有广阔的应用前景。苏州大学何耀等人公开发明专利（cn201710253748.6）“一种硅基sers芯片及其制备方法以及tnt的检测方法”，公开了一种用于检测tnt的硅基表面增强拉曼散射（surface-enhancedramanspectroscopy，sers）芯片及其制备方法，该硅基芯片通过氢氟酸辅助的硝酸银还原法，原位地在硅片上修饰上银纳米颗粒，然后在芯片的表面修饰上与tnt相互作用的化合物，该发明构建了临场检测tnt的便携式平台，适用于定性分析实际环境样品中痕量的tnt。兰州大学陈兴国等人公开了发明专利（cn201610964476.6）“高选择性测定痕量tnp的水溶性荧光硅纳米颗粒合成及应用”，其特征在于利用n-（2-氨乙基）-3-氨丙基三甲氧基硅烷作为硅源，邻苯二酚为还原剂合成该水溶性荧光硅纳米颗粒，两者摩尔比为9.3:100，且该方法可用于制作试纸或试剂，方便携带，易于检测。wayneh.griest在论文（anal.chem.1998，70，3015-3020）中提及不能直接通过分析复杂的矩阵以获得大多数痕量分析应用所需的选择性和灵敏度，为解决这个问题，在气相色谱/离子阱质谱分析之前，使用固相微萃取技术选择性地预浓缩分析物。这种方法适用于对海水中爆炸物及其代谢物的痕量分析，但该法平衡时间长，不能实现快速检测，测量结果的准确性也有待商榷。
分子印迹技术是一种人工合成的具有特定选择性识别分子的手段，作为近年比较流行的检测技术，分子印迹材料稳定性好，容易制备且成本低，具有特定的选择性，广泛应用于生物、医学、化学等各种领域（eerselsk.acsappl.mater.interfaces2013，5，7258−7267；leej-d.org.lett.，2005,7，963-966；lih.acsappl.mater.interfaces2013，5，10502−10509；schirhaglr.anal.chem.2014，86，250−261）。
分子印迹早期提出是基于生物传感器材料的使用寿命短，重复性差，为克服这些困难，人工合成的仿生物材料应运而生（zhangz.p.anal.chem.2014，86，1123−1130）。2016年孟凡利等人在（acsappl.mater.interfaces2016，8，14133−14141）通过将催化的ser/his/asp三联体与n-芴基甲氧羰基二苯丙氨酸（fmoc-ff）组合，然后将肽组装成纳米纤维（coahsd），开发了人工水解酶。肽基纳米纤维提供了理想的超分子骨架来支持官能团，与只含有催化组氨酸残基的自组装催化纳米纤维（sa-h）相比，当组氨酸，丝氨酸和天冬氨酸残基的比例为40:1:1时，coa-hsd的活性最高，这表明有序的纳米纤维结构和丝氨酸和天冬氨酸残基的协同作用有助于提高活性。此外，首次应用分子印迹技术进一步提高肽基人工酶（coa-hsd）的活性，使用p-npa作为分子模板，以适当的方向排列催化的ser/his/asp三联体残基。因此，印迹coahsd纳米纤维的活性是非印迹coa-hsd的7.86倍，是sa-h的13.48倍。davidecarboni等人在（acsappl.mater.interfaces2016，8，34098−34107）通过分子印迹技术，提高了石墨烯介导增强拉曼散射的选择性效率。新疆农垦科学院卢春霞等人公开发明专利（cn2017000535808.3）“一种邻苯二甲酸酯类表面分子印迹聚合物的制备方法及应用”，该发明制备了邻苯二甲酸二（10-甲氧基-10-氧代癸）酯化合物，并以此为虚拟模板，结合表面分子印迹技术，通过两步沉淀聚合制备的paes分子印迹聚合物，解决目前技术中模板包埋过深、模板泄露、结合速率低的缺点，得到的聚合物形貌规则、粒径均一、单分散性好、吸附量大，同时满足食品中10种paes多残留分析需求。南京医科大学陈立娜等人公开发明专利（cn201710474093.5）“一种磁性人工受体及其制备方法和应用”，主要包括：（1）fe3o4@sio2复合颗粒的制备；（2）（1）fe3o4@sio2@mps复合颗粒的制备；（3）磁性人工受体的制备。以zl006为模板，在磁性纳米硅胶材料的表面设计合成有序、致密分子印迹壳层，减少了印迹位点被“包埋”的现象，其结合速率和分离效率较高。同时将磁性材料、纳米硅胶以及表面分子印迹技术相结合，可在外磁场作用下实现对靶标物质的快速直接分离，为中药活性物质的选择性快速分离富集与检测提供了一种新的强有力手段。合肥学院漆天瑶等人公开发明专利（cn201710185685.5）“一种检测噻吩磺隆的fe3o4@peg@sio2人工抗体的制备方法”，包括在fe3o4磁性纳米粒子的表面修饰聚乙二醇2000，表面包覆sio2壳层，形成芯-壳-壳结构，通过洗脱位于sio2壳层中的印迹分子，形成具有与印迹分子结构、大小和功能基互补的特异性识别位点空穴，实现对目标分析物分子选择性识别和检测。得到具有选择性识别印迹分子的feo4@peg@sio2人工抗体，其对噻吩磺隆的最大饱和结合量为41.28mg/g，前30min内，其吸附速率为0.45mg/g·min，分别是非印迹方法的5.34倍和3.46倍。南京医科大学陈立娜等人公开发明专利（cn201310408025.0）“黄芩素分子印迹聚合物及其制备方法和应用”。该发明所制备的沉淀分子印迹聚合物微球，与传统的本体分子印迹聚合物相比较，具有单分散性好、粒径均一、大小可控，制备简单、无复杂的后处理过程和周期较短等优点。四川大学蓝芳等人公开发明专利（cn201410432424.5）“一种具有蛋白质分子印迹的超顺磁性复合纳米球及其制备方法与应用”，利用一种改进的微乳液聚合方法，使超顺磁性纳米颗粒紧密排列在聚合物纳米球中，保留了高的饱和磁化强度。通过所述复合纳米球的内核的外围的羟基化改性层与聚合物外壳、印迹的蛋白分子间形成丰富的氢键，利用两次冰浴超声处理，促进了印迹的蛋白质分子在聚合物外壳中均匀、牢固的分布，有效地降低非特异性结合位点，提高了超顺磁性复合纳米球与目标蛋白质分子的选择性结合能力，实现高选择性的分离目的。北京农学院贾明宏等人公开发明专利（cn201410688522.5）“吡唑醚菌酯分子印迹聚合物的制备方法”，将模板分子吡唑醚菌酯、功能单体甲基丙烯酸和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯，按模板分子:功能单体:交联剂摩尔比1:4:20，混合溶解在制孔剂乙腈中，加入引发剂偶氮二丁乙腈，经氮气保护，60-65℃下水浴反应，获得的模板分子聚合物，在进一步真空干燥磨碎后，通过索氏萃取，除去模板分子，并在60℃下真空干燥至恒重，最终获得吡唑醚菌酯分子印迹聚合物。本发明制备的分子印迹聚合物能有效分离和富集复杂基质中的吡唑醚菌酯。这种方法能够对目标分析物进行高选择性识别，无法实现对进入识别位点的目标分析物以敏感的光学信号或者电磁信号的输出。
而将荧光分析法和分子印迹技术结合得到的带有荧光性能的检测材料具有良好的识别性能（lih.；wangl.y.acsappl.mater.interfaces2013，5，10502−10509），敏感的检测。江苏大学李洪吉等人公开发明专利（cn201710568072.x）“一种基于表面增强拉曼技术的2，6-二氯苯酚印迹传感器及其制备方法和用途”，该发明将拉曼检测技术与分子印迹技术结合，使得产物具有灵敏的检测性与高度的选择性，在该发明中，将ag/cdte基底与分子印迹技术相结合，其中cdte是优秀的半导体，拥有独特的光学特性，能够应用于对2，6-二氯苯酚的检测。高灵敏度金属-半导体异质结构的sers材料具有更强的、更灵敏的表面增强拉曼信号。江苏大学杨文明等人公开发明专利（cn201610720836.8）“一种荧光分子印迹吸附分离材料的制备方法及其用途”，提供了一种荧光分子印迹吸附分离材料的制备方法及其用途，包括如下步骤：步骤1是sio2纳米粒子的制备；步骤2是掺杂锰的硫化锌量子点的合成；步骤3是双键修饰的sio2纳米粒子的制备；步骤4是双键修饰掺杂锰的硫化锌量子点的制备；步骤5是荧光分子印迹吸附分离材料的制备。此荧光分子印迹聚合物将分子印迹聚合物的选择性和量子点的荧光性质结合起来。可以通过荧光强度的改变对目标分子进行快速的检测。南京医科大学胡琴等人公开发明专利（cn201210382810.9）“cdte@sio2量子点表面单胺类神经递质分子印迹聚合物的制备方法”，是在水相中合成cdte@sio2量子点，旋转蒸发至水挥发完毕，用无水乙醇洗去未反应的底物，将所得cdte@sio2量子点加入到致孔剂中，超声分散均匀后，依次加入模板分子、功能单体和交联剂，在n2气氛下，搅拌反应20h，将反应液离心，弃去上清液，所得固体洗涤除去模板分子后，得到cdte@sio2量子点表面单胺类神经递质分子印迹材料。所合成的量子点荧光探针印迹聚合物材料具有高灵敏性、高选择性、高亲和力和检测简便的优点，可以直接应用于生物体液中单胺类神经递质的测定。西南大学谭克俊等人公开发明专利（cn201410520007.6）“一种基于核壳量子点分子印迹聚合物及其用途”，涉及一种cdte/cds量子点-分子印迹聚合物（qds-mip），并以此作为荧光探针应用于全氟辛酸的检测分析，该发明提供一种快速、简便、灵敏、高选择性检测全氟辛酸的方法。该聚合物将分子识别位点嵌入teos包被的cdte/cds量子点表面，以全氟辛酸为模板分子制备得到的荧光分子印迹聚合物。本发明所制备的分子印迹聚合物具有灵敏度高、检测简便，高选择性、高亲和力等优点，可直接用于检测环境中的全氟辛酸，既可以降低检测的成本，又能够提高检测的效率。
信阳师范学院甘甜等人公开了发明专利（cn201611031452.1）“一种痕量快速检测灭蝇胺的分子印迹电化学传感器及其制备方法与应用”，其特征在于：工作电极为玻碳电极，首先采用单分散的sio2@tio2核壳型纳米球进行修饰，然后利用原位电化学聚合法和溶胶-凝胶法进一步制备表面分子印迹膜用于灭蝇胺的专一性识别。合肥学院高大明等人公开了发明专利（cn201510538714.2）“一种对农残检测的eu3+标记分子印迹传感器制备方法”，eu3+与apts中氨基和农残分子预组装，与teos水解交联缩合后得到eu3+标记的农残分子印迹二氧化硅纳米粒子传感器，洗脱农残分子后，拥有对农残分子选择性的识别位点空穴，农残分子再次进入传感器的识别位点后，将与识别位点上的eu3+发生螯合，农残分子与eu3+螯合后的荧光强度增加，利用荧光强度的改变，实现了对痕量农药分子高选择性，高结合量和高敏感性检测。南京医科大学周学敏等人公开发明专利（cn201310023869.3）“一种用于检测多巴胺的金纳米粒参杂的分子印迹电化学传感器的制备方法”，该法经金电极预处理、金纳米粒自组装修饰电极制备、分子印迹自组装溶液配制、电聚合反应和模板分子洗脱等步骤制备出分子印迹膜电化学传感器，提高了传统的电化学传感器的选择性，而且响应迅速、稳定性和耐受性好，可实现对生物样品中多巴胺的高效、灵敏和实时检测。对临床诊断、病理学研究等具有重要意义。湖南农业大学刘霞等人公开发明专利（cn201410471090.2）“基于纳米材料复合物的溶胶凝胶分子印迹电化学传感器检测丙烯酰胺的方法”，该方法是将碳纳米管、金纳米粒子和壳聚糖的复合物覆于玻碳电极表面后，将其置于含模板分子、功能单体、交联剂的溶胶凝胶溶液中进行电化学沉积，反应完成后除去模板分子，得到的分子印迹电化学传感器直接对样品中的丙烯酰胺进行检测。本发明方法简单，且样品前处理操作简单，检测速度快，成本低廉。此外，本方法具有好的选择性和重现性，回收率符合要求，可直接对薯片等油炸食品中的丙烯酰胺进行检测，具有重要的实际应用价值。南京医科大学陈立娜等人公开发明专利（cn201710592816.1）“一种荧光纳米分子印迹仿生传感器及其制备方法和应用”。将模板分子、两种不同功能单体加入到致孔剂中，超声溶解后，室温下搅拌预聚合，得到预组装溶液a；将表面双键功能化的碳点超声分散于致孔剂中得到溶液b；将溶液a与溶液b混匀后，加入交联剂和引发剂，通氮气搅拌，离心收集沉淀，用蒸馏水洗涤；最后用hac-sds洗脱模板蛋白，将所得产物冻干，即得荧光纳米分子印迹仿生传感器。
虽然上述方法分别有各自的特点，但是未见文献报道制备出目标分子自身具有荧光特性，具有黄色荧光目标分子进入识别位点通过自身光学信号敏感输出。同时未见文献报道将2，4，6-三硝基苯酚与n，n’-二异丙基碳二酰亚胺反应生成的具有亮黄色荧光多硝基酚衍生物印迹制备成聚合物微球，进入识别位点的印迹衍生物，通过自身荧光的开闭实现对识别和检测的报道。因此，合成拥有高选择性和高灵敏性的发射光谱带为黄色自荧光探针的印迹聚合物微球的制备方法，实现对超痕量苦味酸分子识别和检测有其必要性。
在本发明中，我们报道了一种用于检测2，4，6-三硝基苯酚的分子印迹聚合物微球的制备方法，实现对痕量2，4，6-三硝基苯酚衍生物的识别和检测。印迹聚合物微球尤其适合识别材料，对印迹分子容易在印迹层的内形成具有与印迹分子结构、大小和功能基互补的空穴结构，洗脱印迹分子的聚合物微球具有对目标分析物分子的特异性识别位点，实现对目标分析物分子选择性识别。印迹聚合物中功能单体可以根据目标分析物的结构特点，选择不同的功能单体。考虑到2，4，6-三硝基苯酚衍生物分子结构缺电子特性，选择富电子的丙烯酰胺为功能单体，通过非共价健作用使得目标分子进入识别位点被功能单体中的供电子的氨基绑定，实现对2，4，6-三硝基苯酚衍生物分子识别。考虑到一般目标分子进入印迹识别位点后是没有信号输出问题，我们在设计了2，4，6-三硝基苯酚与n，n’-二异丙基碳二酰亚胺反应生成的多硝基酚衍生物具有亮黄色荧光，并且其荧光在酸碱条件下具有开闭特性，因此，利用2，4，6-三硝基苯酚衍生物自荧光特性，其进入印迹识别位点后具有自荧光光学信号输出，实现对2，4，6-三硝基苯酚衍生物高选择性识别和高敏感痕量检测。
技术实现要素：
发明目的：针对目前现有技术存在的不足之处，本发明利用合成的苦味酸衍生物具有酸碱荧光开关特性，制备了识别苦味酸衍生物的分子印迹聚合物的化学制备方法，并实现痕量苦味酸衍生物分子识别和痕量检测。首先是将亲核试剂n，n’-二异丙基碳二酰亚胺加入到苦味酸中反应形成苦味酸衍生物，而后进行分离提纯，得到具有酸碱荧光开关的衍生物，将其作为目标分子，再加入功能单体、交联剂和引发剂等制备苦味酸衍生物分子印迹聚合物微球，用洗脱剂洗脱印迹分子后，得到对苦味酸衍生物具有选择性识别的和敏感性检测的分子印迹聚合物微球。
本发明的技术方案是：一种用于2，4，6-三硝基苯酚检测的分子印迹聚合物微球的制备方法，其特征在于：2，4，6-三硝基苯酚与n，n’-二异丙基碳二酰亚胺反应生成的多硝基酚衍生物具有亮黄色荧光，并且其荧光在酸碱条件下具有开闭特性，所述的分子印迹聚合物微球中洗脱位于印迹层中的印迹分子，印迹层的内形成具有与印迹分子结构、大小和功能基互补的空穴结构，洗脱印迹分子的聚合物微球具有对目标分析物分子的特异性识别位点，实现对目标分析物分子选择性识别和检测，上述的2，4，6-三硝基苯酚检测的分子印迹聚合物微球的制备过程包括如下四个步骤：
第一步是2，4，6-三硝基苯酚衍生物合成：称取0.4～0.6g处理后的2，4，6-三硝基苯酚置于100ml三口烧瓶中，随后加入7～8ml二氯甲烷超声分散，再加入0.2~0.4g的n，n’-二异丙基碳二酰亚胺，溶液立即变成红棕色，氮气气氛下搅拌1~3h，由于溶剂二氯甲烷的挥发，溶液变成粘稠状，在30~50℃真空干燥箱中干燥0.5~1.5h得到红棕色固体粉末，具有亮黄色荧光特性，将20ml的沸腾的甲醇溶液倒入上述制备的红棕色固体粉末中，再加入10~20ml蒸馏水，置于0℃冰水混合液中进行水浴1~3h，发现有红棕色晶体析出，将其过滤，即得到所要制备的2，4，6-三硝基苯酚衍生物；
第二步是2，4，6-三硝基苯酚衍生物提纯：把硅胶柱竖直安装在铁架台上，用丙酮和石油醚润洗3遍后，在250ml烧杯中加入150~250g硅胶，用石油醚搅拌均匀，然后将其填充至硅胶柱里，开启气泵，向下对溶液加压，并用洗耳球敲打柱子，使硅胶震荡充实，待硅胶柱子的高度达到分离的要求时，将硅胶柱最上层保持水平，柱子敲实后，再加入石油醚，然后在利用气泵向下加压，如此操作3次，等到石油醚液面和硅胶柱面快齐平时，加入少量配制好的淋洗剂，自然下流，用胶头滴管吸取上述制备的2，4，6-三硝基苯酚衍生物样品，沿着柱壁缓慢均匀上样，若样品量过多，用气泵向下加压，再接着上样，待分离样品全部上完后，用气泵将其压至与硅胶柱面齐平，上样结束后，再沿着柱壁慢慢加入事先配好的淋洗剂，最后得到2，4，6-三硝基苯酚衍生物首先被分离出来的是橘红色液体（pad1），其次是黄色液体（pad2），用微量进样器分别取上述所得的液体5~15ul滴加在硅胶板，确定分离提纯后，将所得到的pad1和pad2减压蒸馏，最后在50~70℃下真空烘箱中干燥7~9h，最后分别得到橙黄色和棕黄色固体粉末；
第三步是目标分析物的分子印迹聚合物微球合成：用万分之一的电子天平分别称取20~40mg橙黄色固体粉末pad1，17~19mg的丙烯酰胺，15~25mg的偶氮二异丁腈，置于250ml的锥形瓶中，然后用100ml的量筒量取50ml甲醇与乙腈体积比为9:1的混合液加入到上述锥形瓶中，超声分散5分钟左右，最后再用微量进样器量取190~210μl的乙二醇二甲基丙烯酸酯滴加到上述溶液中，通20～30min氮气后，在磨口塞均匀涂上真空脂，盖上锥形瓶，再用保鲜膜包裹，然后将锥形瓶放置于恒温振荡器中，在50~60℃下，振荡反应2~4h，再将温度调至60~70℃下振荡反应8~10h，最后70~85℃下，振荡反应1~3h，取出冷却至室温，把反应混合溶液转移至15ml离心管中，以5000~7000rpm转速离心5~10min，移去上清液，加入洗涤剂继续离心，超声分散、再离心，如此反复操作3次，得到印迹目标分子的分子印迹聚合物微球；
第四步是选择性识别和检测目标分析物的聚合物微球的制备：用乙酸与甲醇体积比为2：8的200ml混合液在索氏提取器中洗脱上述的所得到的分子印迹聚合物微球中的模板分子，直至洗脱液中没有荧光信号为止，得到了对目标分析物分子选择性识别和光学信号检测的聚合物微球。
作为对现有技术的进一步改进，所述的制备的分子印迹微球中目标分析物分子和印迹分子是2，4，6-三硝基苯酚衍生物中的具有荧光特性的pad1；所述的制备的分子印迹微球中所用的酸碱分别是指高氯酸和叔丁醇钾；所述的制备的分子印迹微球中所用的过柱子的淋洗剂的比例和爬硅胶板的淋洗剂的比例分别是按照乙酸乙酯与石油醚以1:3和1:5的体积比混合而成；所述的制备的分子印迹微球中所用的洗涤剂是按照去离子水与乙腈以1:1的体积比混合而成；所述的制备的分子印迹微球中功能单体丙烯酰胺；所述的制备的分子印迹微球中交联剂是乙二醇二甲基丙烯酸酯；所述的制备的分子印迹微球中引发剂偶氮二异丁腈；所述的制备的分子印迹微球中目标分子2，4，6-三硝基苯酚衍生物中pad1在酸碱条件下具有开闭特性。
相对于现有技术的有益效果：近年来爆炸等恐怖暴力事件频繁发生，严重危害了世界各国人民群众的生命财产安全和社会稳定，并对国家、地区的安全与稳定构成了威胁。因此，爆炸物的检测分析引起了各国研究机构的高度重视。2016年江南大学张金方等人公开发明专利（cn201610120560.x）“具有探测苦味酸性能的发光晶体材料{[cu(dmso)5][cu4i6(dmso)]}n的制备方法”，该发明公开了一种探测苦味酸的发光晶体材料。将碘化亚铜加入到二甲亚砜中溶液中，搅拌反应数分钟，然后逐滴滴加盐酸至溶液ph＝2～4，搅拌两小时，制得含有发光晶体材料的溶液并过滤，最后向制得的发光晶体材料溶液中加入沉淀剂，经过结晶、过滤、洗涤、干燥即得到发光晶体材料，只是制备过程耗时较长。huangwei等人在（acsappl.mater.interfaces2017，9，3068−3074）中报道了制备了四种聚合物，进行硝基芳香族分析物的测试并显示不同的荧光猝灭响应。淬灭效率取决于目标分析物吸光度与荧光聚合物发射之间的光谱重叠，基于分析物对聚合物的独特响应模式获得光学指纹，使用这种小型传感器阵列，可以100％准确地区分九种硝基芳香族分析物，但是该法制备的成本高，对于苦味酸的检测仍然需要寻找更好的方法。kentaroshiraishi学术论文（acsappl.mater.interfaces2009，1，1379-1382）中提到通过荧光猝灭原理用磷氧化物检测爆炸物，特别是硝基芳香族炸药（如tnt）。在用磷光氧化物喷射的爆炸物的图像传感中，允许目视荧光淬火确定硝基芳香族炸药在纳克级下限的检测限。nilanjandey在（acsappl.mater.interfaces2013，5，8394−8400）中使用一种测试条检测苦味酸，且硝酸芳香族化合物（nacs）纳摩尔浓度的选择性检测是首次在包括水，胶束或有机凝胶的多种介质中以及使用测试条中实现。描述了nacs与高荧光的对苯乙烯基分子相互作用的机制作为从富电子发色探针到缺电子nacs的电子转移现象。传感的选择性由探针的pka以及所考虑的nacs引导。在介质四氢呋喃中tnp诱导的选择性凝胶-溶胶转变也通过分子自组装的重组而被观察到。只是该法在使用过程中并未提到测试条是否是不溶性材料，若在水中是否会稀释荧光材料而导致荧光强度的改变从而影响结果。齐鲁工业大学盖利刚等人公开发明专利（cn201510902169.0）“一种用于检测苦味酸的含氮聚合物量子点的制备方法”，该发明中含氮聚合物量子点的制备过程以多溴代吡咯为原料，在微波辅助、碱热条件下，通过多溴代吡咯脱溴环化、氢氧根亲核取代反应，在较低温度下即可反应。minoobagheri在（acsappl.mater.interfaces2016，8，21472−21479）中报道了在将激光染料罗丹明b引入到多孔框架tmu-5的基础上合成了染料敏化金属有机骨架tmu-5s。tmu-5s被研究用作检测爆炸性硝基芳香化合物的比率荧光传感器，并且显示出比现有任何基于发光的传感器高四倍的苦味酸选择性，且在其他硝基芳香族化合物和挥发性有机化合物的存在下，它可以选择性地区分苦味酸浓度。但是这种方法使用了荧光染料，对环境并不友好。北京化工大学闫冬鹏等人公开发明专利（cn201710219563.3）“一种超灵敏电致化学发光传感器的构筑及其在三硝基甲苯检测方面的应用”，披露了一种超灵敏电致化学发光传感器的构筑及其在三硝基甲苯检测方面的应用。先将负电小分子鲁米诺单钠盐插入水滑石层间，然后利用鲁米诺插层后的水滑石与负电量子点通过静电引力层层自组装技术形成超分子复合薄膜的电致化学发光（electrogeneratedchemiluminescence，ecl）传感器，从而构成ecl共振能量转移（electrogeneratedresonanceenergytransfer，eret）体系，用于检测tnt。但是这种传感器比较脆弱，容易损坏，实用性不高。
基于上述的发明对苦味酸检测的诸多缺点，如合成复杂、耗时，反应条件苛刻，无识别位点，选择性较差，有些有识别位点，但是进入识别位点无信号输出，从而无法检测的缺点；同时未见文献报道制备出目标分析物自荧光发射光谱为黄色发光带的，通过制备印迹聚合物微球，实现对目标分析物高选择性识别和高敏感光学信号检测。因此，合成拥有高选择性和高灵敏性的发射光谱带为黄色荧光光学信号的苦味酸衍生物分子印迹聚合物微球，实现对痕量苦味酸衍生物分子识别和检测有其必要性。
本发明的首先是2，4，6-三硝基苯酚衍生物合成：称取0.4～0.6g处理后的2，4，6-三硝基苯酚置于100ml三口烧瓶中，随后加入7～8ml二氯甲烷超声分散，再加入0.2~0.4g的n，n’-二异丙基碳二酰亚胺，溶液立即变成红棕色，氮气气氛下搅拌1~3h，由于溶剂二氯甲烷的挥发，溶液变成粘稠状，在30~50℃真空干燥箱中干燥0.5~1.5h得到红棕色固体粉末，具有亮黄色荧光特性，将20ml的沸腾的甲醇溶液倒入上述制备的红棕色固体粉末中，再加入10~20ml蒸馏水，置于0℃冰水混合液中进行水浴1~3h，发现有红棕色晶体析出，将其过滤，即得到所要制备的2，4，6-三硝基苯酚衍生物pad1；
其次是2，4，6-三硝基苯酚衍生物提纯：把硅胶柱竖直安装在铁架台上，用丙酮和石油醚润洗3遍后，在250ml烧杯中加入150~250g硅胶，用石油醚搅拌均匀，然后将其填充至硅胶柱里，开启气泵，向下对溶液加压，并用洗耳球敲打柱子，使硅胶震荡充实，待硅胶柱子的高度达到分离的要求时，将硅胶柱最上层保持水平，柱子敲实后，再加入石油醚，然后在利用气泵向下加压，如此操作3次，等到石油醚液面和硅胶柱面快齐平时，加入少量配制好的淋洗剂，自然下流，用胶头滴管吸取上述制备的2，4，6-三硝基苯酚衍生物样品，沿着柱壁缓慢均匀上样，若样品量过多，用气泵向下加压，再接着上样，待分离样品全部上完后，用气泵将其压至与硅胶柱面齐平，上样结束后，再沿着柱壁慢慢加入事先配好的淋洗剂，最后得到2，4，6-三硝基苯酚衍生物首先被分离出来的是橘红色液体（pad1），其次是黄色液体（pad2），用微量进样器分别取上述所得的液体5~15ul滴加在硅胶板，确定分离提纯后，将所得到的pad1和pad2减压蒸馏，最后在50~70℃下真空烘箱中干燥7~9h，最后分别得到橙黄色和棕黄色固体粉末；
然后是目标分析物的分子印迹聚合物微球合成：用万分之一的电子天平分别称取20~40mg橙黄色固体粉末pad1，17~19mg的丙烯酰胺，15~25mg的偶氮二异丁腈，置于250ml的锥形瓶中，然后用100ml的量筒量取50ml甲醇与乙腈体积比为9:1的混合液加入到上述锥形瓶中，超声分散5分钟左右，最后再用微量进样器量取190~210μl的乙二醇二甲基丙烯酸酯滴加到上述溶液中，通20～30min氮气后，在磨口塞均匀涂上真空脂，盖上锥形瓶，再用保鲜膜包裹，然后将锥形瓶放置于恒温振荡器中，在50~60℃下，振荡反应2~4h，再将温度调至60~70℃下振荡反应8~10h，最后70~85℃下，振荡反应1~3h，取出冷却至室温，把反应混合溶液转移至15ml离心管中，以5000~7000rpm转速离心5~10min，移去上清液，加入洗涤剂继续离心，超声分散、再离心，如此反复操作3次，得到印迹目标分子的分子印迹聚合物微球；
最后是选择性识别和检测目标分析物的聚合物微球的制备：用乙酸与甲醇体积比为2：8的200ml混合液在索氏提取器中洗脱上述的所得到的分子印迹聚合物微球中的模板分子，直至洗脱液中没有荧光信号为止，得到了对目标分析物分子选择性识别和光学信号检测的聚合物微球pad1。
综上所述，所得的分子印迹聚合物微球可用来检测2，4，6-三硝基苯酚衍生物。
其一：2，4，6-三硝基苯酚自身没有荧光特性，进入识别位点无法以光学信号输出，也就无法检测，然而2，4，6-三硝基苯酚与n，n’-二异丙基碳二酰亚胺反应后得到的2，4，6-三硝基苯酚衍生物pad1具有黄色光谱带的荧光，具有在酸碱环境下荧光打开和闭合特性，因此，进入印迹识别位点的2，4，6-三硝基苯酚衍生物pad1，通过自身荧光光学信号的输出，实现对其痕量检测。
其二：与传统的荧光染料或者量子点修饰到识别位点相比较，印迹分子进入识别位点不需要与修饰在识别位点的荧光染料和量子点相互作用，再利用荧光能量共振能量转移机理或者光电子诱导转移机理对目标分析物进行检测。
其三：与传统的印迹材料相比较，聚合物微球具有较大的比表面积，拥有有效识别位点多，微球中识别位点位于表面阻力小，有快速结合动力学，较大的饱和结合量。
其四：本发明所提供的方法中，印迹聚合物微球粒径可控，可以通过调节功能单体、交联剂和溶剂的量来加以控制。
其五：选择2，4，6-三硝基苯酚与n，n’-二异丙基碳二酰亚胺反应后得到的2，4，6-三硝基苯酚衍生物pad1作为模板分子的目的，因为其具有以下优点：（1）识别位点不需要进行荧光标记;（2）识别位点有目标分子基本上就有光学信号输出；（3）不需要构建荧光共振能量转移机理；（4）通过荧光的有无来判别是否有存在目标分析物，通过荧光强度的强弱，实现对目标分析物定量的检测。
附图说明
图1是本发明所制备的合成的自荧光功能的苦味酸衍生物印迹聚合物微球示意图。
图2是本发明所制备的n，n-二异丙基碳二亚酰胺与苦味酸反应生成苦味酸衍生物pad1和pad2示意说明。
图3是本发明所制备的苦味酸衍生物pad1核磁共振氢谱。
图4是本发明所制备的苦味酸（a）和苦味酸衍生物pad1（b）的红外图谱。
图5是本发明所制备的苦味酸（a）和pad1（b）溶液归一化紫外可见光谱以及pad1（c）溶液归一化荧光发射光谱。
图6是本发明所制备的苦味酸衍生物pad1分别在叔丁基醇钾和高氯酸溶液分子结构的转变。
图7是本发明所制备的苦味酸衍生物pad1印迹的直径大约为2um聚合物微球的sem。
图8是本发明所制备聚合物的分子识别性能的比较。
图9是本发明所制备的苦味酸衍生物pad1分子动力学曲线。
图10是本发明所制备的在高氯酸溶液中随着目标分析物pad1浓度增加荧光强度增加演变过程。
根据附图进一步解释具体实施方式
图1是本发明所制备的合成的自荧光功能的苦味酸衍生物印迹聚合物微球示意图。在图1中：1-2：首先苦味酸与n，n-二异丙基碳二亚酰胺反应生成的苦味酸衍生物pad1和pad2，分离提纯后以pad1作为模板分子；2-3：苦味酸衍生物模板分子pad1与功能单体丙烯酰胺、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯和引发剂偶氮二异丁氰共聚合反应制备印迹苦味酸衍生物pad1的聚合物微球；3-4：从印迹聚合物微球的识别位点去除和再结合模板分子苦味酸衍生物pad1，实现了对苦味酸衍生物pad1选择性识别和敏感性检测。
图2是本发明所制备的n，n-二异丙基碳二亚酰胺与苦味酸反应生成苦味酸衍生物pad1和pad2示意说明。以n，n’-二异丙基碳二酰亚胺作为亲核试剂，2，4，6-三硝基苯酚作为底物在室温氮气气氛下芳环上发生取代及加成反应制得酚类衍生物pad1和pad2。
图3是本发明所制备的苦味酸衍生物pad1核磁共振氢谱。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.01(s,2h),4.23–4.16(m,1h),4.08–4.00(m,1h),3.89–3.84(m,1h),3.18–3.10(m,1h),1.73(d,j=6.6hz,6h),1.46(d,j=6.4hz,6h),1.34(d,j=7.3hz,6h),1.23(d,j=6.7hz,6h)，进一步确定为pad1。
图4是本发明所制备的苦味酸（a）和苦味酸衍生物pad1（b）的红外图谱。由图中a可知在3500～3400cm-1和3000～2900cm-1存在吸收峰对应于苯环中的c-h键的伸缩振动以及在2000～1500cm-1处的吸收峰，正是应证了苦味酸中的苯环基团。在1630～1480cm-1处存在着no2的伸缩振动峰，而在1630～1480cm-1存在着oh的弯曲振动。图中b可知，在3200～3000cm-1之间和1000～600cm-1存在的吸收峰，对应于—nh2伸缩振动，在1700～1500cm-1之间存在有c=o的伸缩振动峰，在1700～1500cm-1之间存在着c=n键的伸缩振动。
图5是本发明所制备的苦味酸（a）和pad1（b）溶液归一化紫外可见光谱以及pad1（c）溶液归一化荧光发射光谱。彩色插图（a）和（b）分别是苦味酸和苦味酸衍生物pad1在自然光下所拍溶液的照片，而（c）则是365nm波长紫外灯下的pad1的溶液照片。在自然光下苦味酸和苦味酸衍生物pad1溶液分别是淡绿色和橙红色，而在365nm波长紫外灯下的pad1溶液是发出黄色的荧光光谱带，最大发射波长在567nm处。
图6是本发明所制备的pad1分别在叔丁基醇钾和高氯酸溶液分子结构的转变。彩色插图是向溶液中逐滴加入配好的叔丁基醇钾，发现溶液中荧光逐渐变暗，加至溶液中荧光消失；然后再向溶液加入高氯酸溶液，发现溶液颜色逐渐恢复原来的黄色荧光。
图7是本发明所制备的pad1印迹的直径大约为2um聚合物微球的sem。由图可知，该聚合物成球状，颗粒大小一致且分布均匀，表面光滑，微球直径大约2um。
图8是本发明所制备的分子识别性能的比较图。20mg的pad1印迹的粒径大约2um的聚合物微球分别对pad1(□)和pad2(○)再结合量；20mg的pad1印迹的粒径大约4um的聚合物颗粒对pad1(δ)再结合量；20mg的pad1非印迹的粒径大约2um的聚合物微球对pad1(▽)再结合量；可以看出此印迹微球具有对pad1的高效选择性识别，相比pad2高了4倍。4um印迹颗粒对pad1结合量大约为50nmol，而2um印迹微球对pad1结合量大约为230nmol，是4um印迹颗粒的4.6倍。相同粒径下，此分子印迹聚合物微球与非印迹微球相比具有更高识别性能，是非印迹微球的6倍。
图9是本发明所制备的苦味酸衍生物pad1分子动力学曲线。(a)pad1印迹的聚合物微球随时间而演变的结合量(□)；(b)常规印迹聚合物颗粒随时间而演变的结合量(○)；由图可知pad1印迹的聚合物微球达到平衡前的动力学速率为1.39nmol·min-1，pad1常规印迹聚合物颗粒达到平衡前的动力学速率为0.18nmol·min-1，聚合物微球动力学速率是常规印迹聚合物颗粒的动力学速率的7.72倍。印迹的聚合物微球材料具有更快的动力学，效果更好。上述结合动力学数据是20mg印迹聚合物在5.0×10-5mol•l-1pad1溶液的获取的。
图10是本发明所制备的在高氯酸溶液中随着目标分析物pad1浓度增加荧光强度增加演变过程。不同浓度苦味酸衍生物pad1进入印迹聚合物选择性识别位点中，所测定的荧光强度的演变过程，浓度从下往上依次是1×10-9mol•l-1，1×10-8mol•l-1，1×10-7mol•l-1，1×10-6mol•l-1和1×10-5mol•l-5，随着pad1浓度的增加，荧光的强度也就越强，通过荧光强度的改变实现对pad1痕量检测。
具体实施方式
一种用于2，4，6-三硝基苯酚检测的分子印迹聚合物微球的制备方法，其特征在于：2，4，6-三硝基苯酚与n，n’-二异丙基碳二酰亚胺反应生成的多硝基酚衍生物具有亮黄色荧光，并且其荧光在酸碱条件下具有开闭特性，所述的分子印迹聚合物微球中洗脱位于印迹层中的印迹分子，印迹层的内形成具有与印迹分子结构、大小和功能基互补的空穴结构，洗脱印迹分子的聚合物微球具有对目标分析物分子的特异性识别位点，实现对目标分析物分子选择性识别和检测，上述的制备过程包括如下四个步骤：
第一步是2，4，6-三硝基苯酚衍生物合成：称取0.4～0.6g处理后的2，4，6-三硝基苯酚置于100ml三口烧瓶中，随后加入7～8ml二氯甲烷超声分散，再加入0.2~0.4g的n，n’-二异丙基碳二酰亚胺，溶液立即变成红棕色，氮气气氛下搅拌1~3h，由于溶剂二氯甲烷的挥发，溶液变成粘稠状，在30~50℃真空干燥箱中干燥0.5~1.5h得到红棕色固体粉末，具有亮黄色荧光特性，将20ml的沸腾的甲醇溶液倒入上述制备的红棕色固体粉末中，再加入10~20ml蒸馏水，置于0℃冰水混合液中进行水浴1~3h，发现有红棕色晶体析出，将其过滤，即得到所要制备的2，4，6-三硝基苯酚衍生物；
第二步是2，4，6-三硝基苯酚衍生物提纯：把硅胶柱竖直安装在铁架台上，用丙酮和石油醚润洗3遍后，在250ml烧杯中加入150~250g硅胶，用石油醚搅拌均匀，然后将其填充至硅胶柱里，开启气泵，向下对溶液加压，并用洗耳球敲打柱子，使硅胶震荡充实，待硅胶柱子的高度达到分离的要求时，将硅胶柱最上层保持水平，柱子敲实后，再加入石油醚，然后在利用气泵向下加压，如此操作3次，等到石油醚液面和硅胶柱面快齐平时，加入少量配制好的淋洗剂，自然下流，用胶头滴管吸取上述制备的2，4，6-三硝基苯酚衍生物样品，沿着柱壁缓慢均匀上样，若样品量过多，用气泵向下加压，再接着上样，待分离样品全部上完后，用气泵将其压至与硅胶柱面齐平，上样结束后，再沿着柱壁慢慢加入事先配好的淋洗剂，最后得到2，4，6-三硝基苯酚衍生物首先被分离出来的是橘红色液体（pad1），其次是黄色液体（pad2），用微量进样器分别取上述所得的液体5~15ul滴加在硅胶板，确定分离提纯后，将所得到的pad1和pad2减压蒸馏，最后在50~70℃下真空烘箱中干燥7~9h，最后分别得到橙黄色和棕黄色固体粉末；
第三步是目标分析物的分子印迹聚合物微球制备：用万分之一的电子天平分别称取20~40mg橙黄色固体粉末pad2，17~19mg的丙烯酰胺，15~25mg的偶氮二异丁腈，置于250ml的锥形瓶中，然后用100ml的量筒量取50ml甲醇与乙腈体积比为9:1的混合液加入到上述锥形瓶中，超声分散5分钟左右，最后再用微量进样器量取190~210μl的乙二醇二甲基丙烯酸酯滴加到上述溶液中，通20～30min氮气后，在磨口塞均匀涂上真空脂，盖上锥形瓶，再用保鲜膜包裹，然后将锥形瓶放置于恒温振荡器中，在50~60℃下，振荡反应2~4h，再将温度调至60~70℃下振荡反应8~10h，最后70~85℃下，振荡反应1~3h，取出冷却至室温，把反应混合溶液转移至15ml离心管中，以5000~7000rpm转速离心5~10min，移去上清液，加入洗涤剂继续离心，超声分散、再离心，如此反复操作3次，得到印迹目标分子的分子印迹聚合物微球；
第四步是选择性识别和检测目标分析物的聚合物微球的制备：用乙酸与甲醇体积比为2：8的200ml混合液在索氏提取器中洗脱上述的所得到的分子印迹聚合物微球中的模板分子，直至洗脱液中没有荧光信号为止，得到了对目标分析物分子选择性识别和光学信号检测的聚合物微球。
当目标分析物分子遇到这种聚合物微球，通过浓度差推动力，再次进入识别位点，这种识别位点对目标分析物具有高选择性识别，同时在酸性环境中进入识别位点的目标分析物具有高敏感荧光信号输出，实现对目标分析物痕量检测。
具体实施例
2，4，6-三硝基苯酚与n，n’-二异丙基碳二酰亚胺通过亲核加成反应生成的多硝基酚衍生物，分离提纯后得到2，4，6-三硝基苯酚衍生物pad1与功能单体、交联剂和引发剂共聚制备得到分子印迹聚合物微球，洗脱模板分子pad1后得到对pad1具有选择性识别和荧光信号输出的聚合物微球。
第一步是2，4，6-三硝基苯酚衍生物合成：称取0.5g处理后的2，4，6-三硝基苯酚置于100ml三口烧瓶中，随后加入7.5ml二氯甲烷超声分散，再加入0.3g的n，n’-二异丙基碳二酰亚胺，溶液立即变成红棕色，氮气气氛下搅拌2h，由于溶剂二氯甲烷的挥发，溶液变成粘稠状，在40℃真空干燥箱中干燥1h得到红棕色固体粉末，具有亮黄色荧光特性，将20ml的沸腾的甲醇溶液倒入上述制备的红棕色固体粉末中，再加入15ml蒸馏水，置于0℃冰水混合液中进行水浴2h，发现有红棕色晶体析出，将其过滤，即得到所要制备的2，4，6-三硝基苯酚衍生物；
第二步是2，4，6-三硝基苯酚衍生物提纯：把硅胶柱竖直安装在铁架台上，用丙酮和石油醚润洗3遍后，在250ml烧杯中加入200g硅胶，用石油醚搅拌均匀，然后将其填充至硅胶柱里，开启气泵，向下对溶液加压，并用洗耳球敲打柱子，使硅胶震荡充实，待硅胶柱子的高度达到分离的要求时，将硅胶柱最上层保持水平，柱子敲实后，再加入石油醚，然后在利用气泵向下加压，如此操作3次，等到石油醚液面和硅胶柱面快齐平时，加入少量配制好的淋洗剂，自然下流，用胶头滴管吸取上述制备的2，4，6-三硝基苯酚衍生物样品，沿着柱壁缓慢均匀上样，若样品量过多，用气泵向下加压，再接着上样，待分离样品全部上完后，用气泵将其压至与硅胶柱面齐平，上样结束后，再沿着柱壁慢慢加入事先配好的淋洗剂，最后得到2，4，6-三硝基苯酚衍生物首先被分离出来的是橘红色液体（pad1），其次是黄色液体（pad2），用微量进样器分别取上述所得的液体10ul滴加在硅胶板，确定分离提纯后，将所得到的pad1和pad2减压蒸馏，最后在60℃下真空烘箱中干燥8h，最后分别得到橙黄色和棕黄色固体粉末；
第三步是目标分析物的分子印迹聚合物微球合成：用万分之一的电子天平分别称取30mg橙黄色固体粉末pad1，18mg的丙烯酰胺，20mg的偶氮二异丁腈，置于250ml的锥形瓶中，然后用100ml的量筒量取50ml甲醇与乙腈体积比为9:1的混合液加入到上述锥形瓶中，超声分散5分钟左右，最后再用微量进样器量取200μl的乙二醇二甲基丙烯酸酯滴加到上述溶液中，通25min氮气后，在磨口塞均匀涂上真空脂，盖上锥形瓶，再用保鲜膜包裹，然后将锥形瓶放置于恒温振荡器中，在55℃下，振荡反应3h，再将温度调至65℃下振荡反应9h，最后80℃下，振荡反应2h，取出冷却至室温，把反应混合溶液转移至15ml离心管中，以6000rpm转速离心10min，移去上清液，加入洗涤剂继续离心，超声分散、再离心，如此反复操作3次，得到印迹目标分子的分子印迹聚合物微球；
第四步是选择性识别和检测目标分析物的聚合物微球的制备：用乙酸与甲醇体积比为2:8的200ml混合液在索氏提取器中洗脱上述的所得到的分子印迹聚合物微球中的模板分子，直至洗脱液中没有荧光信号为止，得到了对目标分析物分子选择性识别和光学信号检测的聚合物微球。
当目标分析物分子再次遇到这种具有识别位点的聚合物微球，通过浓度差推动力，再次进入选择性识别位点，这种识别位点对目标分析物具有高选择性识别，同时在酸性环境中进入识别位点的目标分析物具有高敏感荧光信号输出，实现对目标分析物苦味酸衍生物pad1痕量检测。