一种大环内酯类抗生素高选择性固相微萃取探针及其制备方法和应用与流程

本发明属于化学领域，具体涉及一种大环内酯类抗生素高选择性固相微萃取探针及其制备方法和应用。

背景技术

大环内酯类抗生素(macrolideantibiotics，mals)包括红霉素、螺旋霉素、克拉霉素、罗红霉素、交沙霉素、阿奇霉素等，其共同特点是分子内具有大环结构，同时兼具内酯结构。该类抗生素抗菌谱广、吸收后在体内分布广、组织浓度高、且半衰期长，较容易在动物性食品中以原形或其代谢产物的形式蓄积、贮存下来。目前，大环内酯类抗生素是应用范围较为广泛，不仅在人类临床医学和畜禽养殖业中作为治疗药物被人们广泛使用，而且还被越来越多地作为饲料添加剂。但是，使用不合理或过量的使用会在环境、动物性食品中造成残留，最后通过食物链进入人体，危害人体的健康。

近年来，动物源食品中大环内酯类抗生素残留的分析检测是公认的热点问题之一。高效液相色谱-串联质谱是常用的方法，然而，该方法前处理步骤繁琐，耗时耗力，制约了分析检测速度，另外一个分析难点是大环内酯类抗生素的紫外响应极低，食品中的残留量常常处于痕量水平，故常规的液相方法或分光光度法很难满足检测需求。因此，需合成选择性好、富集倍数高的材料对痕量的大环内酯类抗生素进行富集浓缩，降低基质效应来满足检测要求。

固相微萃取(spme)技术将采样、萃取、富集和进样4个步骤合于一体，将其与质谱联用，可简单高效地为痕量组分进行定性定量分析。该技术通过物理或化学合成方法，在固体基质表面制备具有吸附萃取性能的涂层，从而实现目标分析物高效分离、富集和浓缩。spme具有样品用量小、选择性高等优点，其涂层材料的性质决定了萃取的容量、选择性和灵敏度。常压敞开式质谱(ambientms)是近年来新兴的一种无需或仅需很少样品前处理，能够在常压敞开条件下直接对样品中的目标物进行离子化的质谱分析技术。对于复杂食品基体中的痕量目标分析物而言，spme与ambientms联用是一种直接有效的分析技术手段，可大幅度提高分析灵敏度、并减少基体效应，从而实现复杂食品体系中痕量有害物质残留的直接、快速、准确分析。基于以上技术优点，发展一种可直接用于复杂食品介质中大环内酯类抗生素高选择性和高富集能力萃取、并可以实现常压敞开电喷雾质谱分析的新型固相微萃取探针将具有很大的潜力，也具有十分重要的意义。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供一种新型的对大环内酯类抗生素具有高选择性和高富集能力的固相微萃取探针及其制备方法和应用。

本发明的第一个目的是提供一种大环内酯类抗生素高选择性固相微萃取探针的制备方法。

本发明的大环内酯类抗生素高选择性固相微萃取探针的制备方法，包括以下步骤：

将γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷溶于有机溶剂中，将固体基质置于该溶液中，无水条件下100-120℃反应12-24h，反应后用乙醇洗涤，除去未反应的γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，晾干制得表面改性的固体基质；

其中，所述的γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷在有机溶剂中体积分数为2％-5％，所述的有机溶剂为n,n-二甲基甲酰胺、甲苯或二氯甲烷；

将罗红霉素溶于乙腈，再加入甲基丙烯酸聚合，在其中放入表面改性的固体基质，再向混合溶液中加入二甲基丙烯酸乙二醇酯、偶氮二异丁腈，氮气保护条件下50-100℃加热聚合反应6-24h，然后以体积分数10％-20％乙酸的甲醇溶液为洗脱液采用索氏提取去除罗红霉素，再用甲醇洗去残留乙酸，得到大环内酯类抗生素高选择性固相微萃取探针；

其中，所述的加热聚合反应的混合溶液中各组分比例如下，罗红霉素：乙腈：甲基丙烯酸：二甲基丙烯酸乙二醇酯：偶氮二异丁腈为0.001-0.005mmol：10-20ml：1-2mmol：1-3mmol：15-30mg。

优选，所述的固体基质为木质纤维(木签)、竹质纤维(竹签)或经过表面处理的金属针，固体基质尖端直径为0.1-0.2mm。其中，以木质纤维、竹质纤维更优。

本发明以罗红霉素为模板分子，通过表面分子印迹聚合法，在表面富含羟基的固体基质上进行热聚合反应，获得表面修饰分子印迹的大环内酯类抗生素高选择性固相微萃取探针。

本发明的第二个目的是提供利用所述的制备方法制备得到的大环内酯类抗生素高选择性固相微萃取探针。

本发明的第三个目的是提供所述的大环内酯类抗生素高选择性固相微萃取探针的应用。

优选，所述的应用是在检测大环内酯类抗生素中的应用。

优选，所述的应用是在检测红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素、北里霉素、螺旋霉素等具有十四元到十六元大环内酯的抗生素中的一种或两种以上的混合物中的应用。

本发明的大环内酯类抗生素高选择性固相微萃取探针在对样品中目标物进行萃取后，可以作为固体基质，在常压敞开的条件下直接引导电喷雾离子化，进行质谱分析。

优选，所述的应用，包括以下步骤：

利用大环内酯类抗生素高选择性固相微萃取探针对待测基质中的目标物进行萃取后，将探针固定在一个距离质谱入口5-15mm的位置，尖端对准质谱入口，并在探针上施加3.5-5kv的高压电场，然后将0.5-10μl的甲醇喷雾溶剂滴加在探针尖端位置上解吸出探针上富集的目标物，在常压敞开的条件下进行电喷雾质谱分析。

优选，大环内酯类抗生素高选择性固相微萃取探针对待测基质中的目标物进行萃取后，将探针固定在一个距离质谱入口10mm的位置，尖端对准质谱入口，并在探针上施加3.5kv的高压电场，然后将10μl的甲醇喷雾溶剂滴加在探针尖端位置上解吸出探针上富集的目标物，在常压敞开的条件下进行电喷雾质谱分析。

该方法整合了固相微萃取探针和电喷雾质谱技术，将固相微萃取探针作为固体基质来诱导电喷雾离子化，实现了痕量大环内酯类抗生素残留的直接、快速、准确分析。方法学考察结果表明该方法具有良好的线性、重复性和准确度，可有效用于目标化合物的定量分析。

本发明的固相微萃取探针表面分子印迹聚合膜以骨架较大的罗红霉素为模板分子制成，模板分子洗脱后，印迹位点带有负电荷的酯基，可与罗红霉素或其结构类似化合物的带有正电荷的季铵基团进行离子键结合，从而达到与目标化合物的特异性识别吸附，因此本发明的固相微萃取探针对大环内酯或其结构类似化合物具有很好的吸附能力和选择性，使得萃取过程的选择性和富集能力极强。

本发明的固相微萃取探针可以用于直接检测痕量的大环内酯类抗生素。利用本发明的固相微萃取探针，可以针对多种复杂基质中的大环内酯类抗生素进行有效地萃取富集，富集能力可达数十至数千倍，且方法的线性良好，回收率高，重现性好。

本发明的固相微萃取探针表面有大量空穴，是由于功能单体与交联剂通过共价与非共价键结合形成的三维空间立体结构，最后通过模板分子的去除所形成特定的空间结构以及功能基团来选择性萃取目标物，因此本发明的固相微萃取探针对大环内酯类抗生素具有很好的吸附能力和选择性。

本发明的固相微萃取探针制作步骤简单，价格低廉，可作一次性使用，以有效防止交叉污染和记忆效应。该固相微萃取探针尤其适合用于复杂食品介质、环境及生物样品等的分析检测。

附图说明

图1是固相微萃取探针的制备过程示意图。

图2是固相微萃取探针表面的电镜表征结果。

图3是目标萃取物6种大环内酯类抗生素的结构示意图。

图4是固相微萃取探针萃取纯水中六种大环内酯类抗生素后，分析所获得的质谱图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

标准物质：(红霉素，erythromycin，ery)，(克拉霉素，clarithromycin，cla)，(阿奇霉素，azithromycin，azi)，(罗红霉素，roxithromycin，rox)，(北里霉素，leucomycin，leu)，(螺旋霉素，spiramycin，spi)，其结构式分别如图3中所示。内标：d7-roxithromycin。所有标准物质纯度均＞99％。

作为本发明的以下示例性实施例中，采用罗红霉素为模板分子，研制了一种新型表面分子印迹涂层，以木质纤维或竹质纤维作为固体基质材料，通过热聚合反应制备获得的分子印迹微萃取探针用于萃取样品中的大环内酯类抗生素。

实施例1

1.固相微萃取探针的制备

图1显示了固相微萃取探针的制作基本流程。首先把木签(桦木材质牙签)剪成约2cm长度，然后用小刀进一步把木签的尖端部分削成更为尖细的尖端(外径为0.1～0.2mm)，制作成固相微萃取探针的固体基质。然后，将木签置于双颈烧瓶中，加入100mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)，再加入5ml偶联试剂γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(mps)试剂，通氮气保护，加热至110℃搅拌回流反应24h。反应结束后用无水乙醇洗涤，以除去未反应的mps，经自然晾干制得表面修饰乙烯基的木签。

称取0.005mmol模板分子罗红霉素于10ml乙腈，超声溶解后，加入1mmol甲基丙烯酸(methacrylicacid,maa)为功能单体，室温预聚过夜。放入木签，再向混合溶液中加入1mmol交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯(ethyleneglycoldimethacrylate，egdma)、20mg引发剂偶氮二异丁腈(azodiisobutyronitrile,aibn)，充氮气10min后，60℃加热聚合反应24h。反应结束后，木签以体积分数10％乙酸的甲醇溶液为洗脱液，索氏提取处理24h，去除模板分子罗红霉素，再用甲醇洗去残留乙酸，得到分子印迹修饰木签，即制备得到大环内酯类抗生素高选择性固相微萃取探针。

2.固相微萃取探针电镜表征

图2显示了固相微萃取探针表面的电镜表征结果图，从图片中可观察到采用表面印迹法制得的分子印迹修饰木签具有规整的形貌和大量的多孔结构，这有利于对目标分析物大环内酯类抗生素的识别与结合。

3.固相微萃取探针常压敞开电喷雾质谱分析

样品萃取的操作方式与常规的固相微萃取方式一致，采用直接萃取的模式。萃取前，固相微萃取探针先用甲醇润洗30s。萃取完后，将固相微萃取探针快速从样品中取出，放入纯水中清洗10s后取出，待自然晾干后，进行固相微萃取探针常压敞开电喷雾质谱分析。

将萃取完成后的固相微萃取探针固定在三维移动台上，使探针尖端对准质谱入口并距离质谱入口10mm。将3.5kv的高压电场加载于固相微萃取探针上，然后将10μl甲醇喷雾溶剂滴加在固相微萃取探针上，溶剂解吸出探针上富集的化合物，在高压电场的作用下向探针的尖端移动，在尖端形成泰勒锥，然后生成带电的喷雾液滴，进一步脱溶剂形成气态离子，进入质谱进行分析。

固相微萃取探针常压敞开电喷雾质谱分析：正离子检测模式，离子传输管温度300℃；采用傅里叶变换离子回旋共振质谱全扫描模式，外加高压3500v，雾化器压力为1psi，干燥气流量为1l/min，分辨率20000以上，扫描质量范围m/z100～1000。

4.固相微萃取探针的萃取性能研究

固相微萃取探针的萃取性能通过计算其富集倍数来表征。富集倍数定义为采用分子印迹修饰木签分析样品所获目标化合物质谱信号强度与直接采用未经表面修饰的木签且无样品萃取、富集过程时分析样品所获目标化合物质谱信号强度的比值。在水样基体中，500ml(5倍最优量)的样品溶液进行120min(3倍最优时间)的萃取，以模拟原位分析条件。对于牛奶样品，采用优化的实验条件，即100ml溶液下萃取60min。按以下公式计算所获得的富集倍数如表1所示。

水样(纯水或河水)：采用纯水或河水各配制含ery、cla、azi、rox、leu和spi浓度为10μg/l的混合加标样品，将上述以罗红霉素为模板分子制备的分子印迹固相微萃取探针置于纯水或河水中搅拌萃取，直至萃取平衡。牛奶样品：将上述以罗红霉素为模板分子制备的分子印迹固相微萃取探针放置于加有ery、cla、azi、rox、leu和spi浓度为500μg/l的混合加标牛奶样品中搅拌萃取，到萃取平衡为止。萃取完后，将固相微萃取探针快速从样品中取出，然后放入纯水中润洗数秒后取出，待自然晾干后进行固相微萃取探针电喷雾质谱分析，研究固相微萃取探针的抗干扰萃取能力。

表1固相微萃取探针萃取不同基质中大环内酯类抗生素的富集倍数

结果表明，本实施例制备的的微萃取探针对于水基体具有非常理想的富集能力。对于纯水样本，富集倍数值达到约2000倍。

在牛奶样品中，最佳萃取条件下的富集倍数值可达30倍。尽管在牛奶样本中，由于基体杂质的干扰，其富集能力远低于水样，然而，如此的富集能力已比现有的方法大大提高了灵敏度，能较好的满足检测要求。

5.方法学验证

实验方法：在纯水中添加浓度范围0.01-1000μg/l的6种大环内酯抗生素(ery、cla、azi、rox、leu和spi)混合标样，研究固相微萃取探针电喷雾质谱分析的定量准确性。将10ug/l的d7-rox添加到喷雾溶剂中作为内标化合物，用于分析过程的误差校准，从而提高方法的重现性。结果表明，本方法具有良好的线性关系，相关系数(r²)不低于0.9946(表2)。这些结果显示了固相微萃取探针电喷雾质谱法可以适用于痕量大环内酯类抗生素的直接定量分析。

表2固相微萃取探针电喷雾质谱分析大环内酯类抗生素的线性方程、范围

6.样品分析

采用空白纯水配制六种大环内酯抗生素(ery、cla、azi、rox、leu和spi)浓度为50μg/l的混合加标样品，使用本实施例制备的大环内酯类抗生素高选择性固相微萃取探针搅拌萃取40min，待其自然晾干后用电喷雾质谱法分析，所得质谱图如图4所示。

实施例2

1.(以竹签为固体基质的)固相微萃取探针的制备

首先把竹签(竹质牙签)剪成，然后用小刀进一步把竹签的尖端部分削成更为尖细的)，制作成固相微萃取探针的固体基质。然后，将竹签置于双颈烧瓶中，加入100ml甲苯，再加入2ml偶联试剂γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(mps)试剂，通氮气保护，加热至100℃搅拌回流反应20h。反应结束后用无水乙醇洗涤，以除去未反应的mps，经自然晾干制得表面修饰乙烯基的竹签。

称取0.001mmol模板分子罗红霉素于10ml乙腈，超声溶解后，加入2mmol甲基丙烯酸(methacrylicacid,maa)为功能单体，室温预聚过夜；放入竹签，再向该混合溶液中加入3mmol交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯(ethyleneglycoldimethacrylate，egdma)、15mg引发剂偶氮二异丁腈(azodiisobutyronitrile,aibn)，充氮气10min后，50℃加热聚合反应20h。反应结束后，竹签以体积分数20％乙酸的甲醇溶液为洗脱液，索氏提取处理24h，去除模板分子罗红霉素，再用甲醇洗去残留乙酸，得到分子印迹修饰竹签，即制备得到大环内酯类抗生素高选择性固相微萃取探针。

2.固相微萃取探针常压敞开电喷雾质谱分析

样品萃取的操作方式与常规的固相微萃取方式一致，采用直接萃取的模式。萃取前，固相微萃取探针先用甲醇润洗30s。萃取完后，将固相微萃取探针快速从样品中取出，放入纯水中清洗10s后取出，待自然晾干后，进行固相微萃取探针常压敞开电喷雾质谱分析。

将萃取完成后的固相微萃取探针固定在三维移动台上，使探针尖端对准质谱入口并距离质谱入口5mm。将3.5kv的高压电场加载于固相微萃取探针上，然后将0.5μl甲醇喷雾溶剂滴加在固相微萃取探针上，溶剂解吸出探针上富集的化合物，在高压电场的作用下向探针的尖端移动，在尖端形成泰勒锥，然后生成带电的喷雾液滴，进一步脱溶剂形成气态离子，进入质谱进行分析。

固相微萃取探针常压敞开电喷雾质谱分析：正离子检测模式，离子传输管温度300℃；采用傅里叶变换离子回旋共振质谱全扫描模式，外加高压3500v，雾化器压力为1psi，干燥气流量为1l/min，分辨率20000以上，扫描质量范围m/z100～1000。

本实施例制备的以竹签为固体基质的固相微萃取探针对水样基体、牛奶样品均具有非常理想的富集能力，富集效果基本与实施例1的固相微萃取探针的相当。本实施例的固相微萃取探针常压敞开电喷雾质谱分析方法在大环内酯抗生素(ery、cla、azi、rox、leu和spi)浓度范围0.01-100μg/l内均具有良好的线性、重复性和准确度，可用于痕量大环内酯类抗生素残留的直接、快速、准确分析。

实施例3

1.(以木签为固体基质的)固相微萃取探针的制备

首先把木签(桦木材质牙签)剪成约2cm长度，然后用小刀进一步把木签的尖端部分削成更为尖细的尖端(外径为0.1～0.2mm)，制作成固相微萃取探针的固体基质。然后，将木签置于双颈烧瓶中，加入100ml二氯甲烷，再加入4ml偶联试剂γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(mps)试剂，通氮气保护，加热至120℃搅拌回流反应12h。反应结束后用无水乙醇洗涤，以除去未反应的mps，经自然晾干制得表面修饰乙烯基的木签。

称取0.003mmol模板分子罗红霉素于15ml乙腈，超声溶解后，加入2mmol甲基丙烯酸(methacrylicacid,maa)为功能单体，室温预聚过夜；放入木签，再向该混合溶液中加入2mmol交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯(ethyleneglycoldimethacrylate，egdma)、30mg引发剂偶氮二异丁腈(azodiisobutyronitrile,aibn)，充氮气10min后，100℃加热聚合反应6h。反应结束后，木签以体积分数20％乙酸的甲醇溶液为洗脱液，索氏提取处理24h，去除模板分子罗红霉素，再用甲醇洗去残留乙酸，得到分子印迹修饰木签，即制备得到大环内酯类抗生素高选择性固相微萃取探针。

2.固相微萃取探针常压敞开电喷雾质谱分析

样品萃取的操作方式与常规的固相微萃取方式一致，采用直接萃取的模式。萃取前，固相微萃取探针先用甲醇润洗30s。萃取完后，将固相微萃取探针快速从样品中取出，放入纯水中清洗10s后取出，待自然晾干后，进行固相微萃取探针常压敞开电喷雾质谱分析。

将萃取完成后的固相微萃取探针固定在三维移动台上，使探针尖端对准质谱入口并距离质谱入口15mm。将5kv的高压电场加载于固相微萃取探针上，然后将5μl甲醇喷雾溶剂滴加在固相微萃取探针上，溶剂解吸出探针上富集的化合物，在高压电场的作用下向探针的尖端移动，在尖端形成泰勒锥，然后生成带电的喷雾液滴，进一步脱溶剂形成气态离子，进入质谱进行分析。

固相微萃取探针常压敞开电喷雾质谱分析：正离子检测模式，离子传输管温度300℃；采用傅里叶变换离子回旋共振质谱全扫描模式，外加高压3500v，雾化器压力为1psi，干燥气流量为1l/min，分辨率20000以上，扫描质量范围m/z100～1000。

本实施例制备的以木签为固体基质的固相微萃取探针对水样基体、牛奶样品均具有非常理想的富集能力，富集效果基本与实施例1的固相微萃取探针的相当。本实施例的固相微萃取探针常压敞开电喷雾质谱分析方法在大环内酯抗生素(ery、cla、azi、rox、leu和spi)浓度范围0.01-100μg/l内均具有良好的线性、重复性和准确度，可用于痕量大环内酯类抗生素残留的直接、快速、准确分析。