一种双通道实时荧光定量PCR仪光路系统及检测方法与流程

本发明涉及生物医学检测技术领域，具体涉及一种双通道实时荧光定量pcr仪光路系统及检测方法。

背景技术：

生命科学仪器的不断发展为生物医学提供有力保障和有效研究工具。pcr仪作为一种广泛应用于生化分析、临床诊断、疾控筛查等多个领域的生命科学仪器，主要依据聚合酶链反应技术实现短时间内体外大量扩增特定dna片段后结果定性分析。早期的pcr仪只能先扩增再采用“终点法”进行半定量、定性分析，这样既不具有实时性也存在检测重现性差有一定误差等弊端。因此，实时荧光定量pcr仪应运而生。其是指在pcr体系中结合荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程，通过标准曲线进行定量分析。该技术不仅实现pcr从定性到定量的跨越，也具有特异性强、高效自动化等优势。随着基因科学和分子生物学等领域的发展，人们对实时荧光定量pcr仪提出更多的要求，大多趋向多色荧光通道发展，这样可以同时进行多重pcr及snp等分析。但主要以多个独立检测光路通道并行，共用一套检测器的方式满足多通道实时荧光定量pcr仪的需求。这种方式需要对通道进行选择并逐一检测，这样一来将面临整体检测所需时间较长，探测器的口径大，光学系统结构所需空间较大，材料成本高等问题。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种双通道实时荧光定量pcr仪光路系统及检测方法，该光路系统结合微流控芯片技术的微型化、集成化、反应迅速、灵敏度高等特性，能够进一步地拓宽应用领域，更好地推动多学科优势互补型发展。本发明的双通道实时荧光定量pcr仪光路系统结构紧凑，减少传输距离光强损耗，本发明的检测方法实现了不同波长荧光实时同步成像，运转高效，避免激发光和荧光之间的干扰。

本发明采用如下的技术方案实现：

本发明的第一方面公开了一种双通道实时荧光定量pcr仪光路系统，包括双色光激发模块100、微流控芯片模块200、双通道荧光探测模块300和图像处理模块400；

所述微流控芯片模块200用于对待测样品扩增；

所述双色光激发模块100用于使待测样品出射荧光，并将激发光源出射的激发光与待测样品出射的荧光分离；

所述双通道荧光探测模块300用于实现不同波长荧光分通道传输,调整出射的不同波长荧光的光程，使得所述待测样品出射的不同波长荧光在所述图像处理模块400的图像捕获装置的感光面处于同一像面上并分布在感光面不同空间位置上；

所述图像处理模块400用于感光所述荧光，并对图像数据进行分析。

进一步的，所述双色激发模块100包括两个激发光源111，112、短带通二向色镜120、双带通滤光片130、双带通二向色镜140，所述两个激发光源的激发光波长不同；

所述微流控芯片模块200包括微流控芯片210和升降温模块220，待测样品夹持在所述升降温模块220上；

所述双通道荧光探测模块300包括第一聚焦透镜310，长带通二向色镜320，单带通滤光片331,332，反射镜341,342,343和第二聚焦透镜350；

所述图像处理模块400包括图像捕获装置410；

所述短带通二向色镜120和微流控芯片210之间依次设有双带通滤波片130和双带通二向色镜140；

紧邻所述双带通二向色镜140设有第一聚焦透镜310；

所述聚焦透镜310和第一滤波片331之间设有长带通二向色镜（320）；

在长带通二向色镜320与反射镜341，342之间分别设置有相应波长的单带通滤光片331，332；

在第二反射镜342与图像捕获装置410之间、第三反射镜343与图像捕获装置410之间放置第二聚焦透镜350。

进一步的，两个所述激发光源111，112各自出射的激发光分别直射到短带通二向色镜120，所述短带通二向色镜120将两束激发光合束，合束后的光再经双带通滤光片130直射到双带通二向色镜140，所述直射到双带通二向色镜140的光束是双带通二向色镜140的入射光束，所述双带通二向色镜140将所述入射光束反射后垂直入射到待测样品，之后从待测样品激发产生的荧光依次经所述双带通二向色镜140、第一聚焦透镜310、长带通二向色镜320、单带通滤光片331，332、反射镜341、342、343、第二聚焦透镜350后，汇聚于图像捕获装置410的感光面。

进一步的，第一激发光源111发出的激发光经所述短带通二向色镜120透射、以及所述第二激发光源112发出的激发光经所述短带通二向色镜120反射后，均入射到所述双带通滤光片130，经过所述双带通滤光片130后入射到所述双带通二向色镜140。

进一步的，经第二反射镜342反射的荧光光束入射到透镜350；

经第一反射镜341反射的荧光光束入射到第三反射镜343、再经第三反射镜343反射后的荧光光束入射到第二聚焦透镜350；

入射到第二聚焦透镜350的光束，经第二聚焦透镜350汇聚于图像捕获装置410的感光面。

进一步的，通过第一单带通滤光片331、第一反射镜341与第三反射镜343的短波长荧光，以及通过第二单带通滤光片332、第二反射镜342的长波长荧光以一定夹角α进入透镜350。

进一步的，所述α>0,所述α的值取决于第一透镜310与第二透镜350的焦距的比值。

进一步的，所述微流控芯片210在第一聚焦透镜310的前焦面上，所述第一聚焦透镜310的后焦面与第二聚焦透镜350的前焦面重合，所述图像捕获装置感光面410在所述第一聚焦透镜310的后焦面上，调整出射双波长荧光光程，使得不同波长荧光到达所述图像捕获装置感光面410时处于同一像面上，调节所述第二反射镜342和所述第三反射镜343的倾角使不同波长荧光成像在所述图像捕获装置感光面410的不同位置上并且没有重合区域。

本发明的第二方面公开了一种微流控芯片实时荧光定量pcr检测的方法，采用所述的双通道实时荧光定量pcr仪光路系统进行检测，包括如下步骤：

步骤s100，配制pcr反应试剂，将待测样本加入到所述pcr反应试剂中，并将所述带有待测样本的pcr反应试剂添加到微流控芯片中；

步骤s200,将所述微流控芯片置于升降温模块上，设置所述升降温模块的温度程序进行升降温循环，并进行荧光采集；

步骤s300,使双色激发光的入射方向朝向微流控芯片的透光面，pcr反应试剂中的两种荧光探针上的荧光基团发射荧光，所述出射荧光通过双带通二向色镜，经由透镜汇聚，再通过长带通二向色镜实现不同波长荧光分通道传输,与反射镜配合使用，调整出射双波长荧光光程，成像在图像捕获装置感光面；

步骤s400,采集荧光信号，绘制荧光信号强度曲线，根据所述曲线判断目标模板的初始浓度，实现定量检测。

进一步的，所述设置所述升降温模块的温度程序进行升降温循环的步骤包括：

第一温度加热第一时间，进行预变性；

升降温循环：第一温度加热第二时间进行变性，第二温度加热第三时间进行退火延伸，共进行多个上述循环，实现核酸扩增；

在每一次第二温度加热少于第三时间2秒的时候进行荧光采集。

综上所述，一种双通道实时荧光定量pcr仪光路系统和检测方法，该光路系统包括双色激发模块、微流控芯片模块、双通道荧光探测模块和图像处理模块；所述双通道荧光探测模块用于对待测样品扩增，并采集荧光；所述双色激发模块用于使待测样品出射荧光，并将激发光源出射的激发光与待测样品出射的荧光分离；所述微流控芯片模块用于实现不同波长荧光分通道传输,调整出射的不同波长荧光的光程使得所述待测样品出射的不同波长荧光在所述图像处理模块的图像捕获装置的感光面的不同空间位置处；所述图像处理模块用于感光所述荧光。

本发明采用双通道激发待测样品荧光，单台图像捕获装置实现不同波长荧光实时同步成像，降低了光路系统及整体仪器的成本；光路系统设计简单、结构紧凑，减少了光路系统中的光信号传输衰减，也有利于整体仪器小型化、模块化；此光路系统也避免了激发光和荧光之间的干扰，提高了图像捕获装置接收信噪比和仪器检测灵敏度。

与现有技术相比，本发明有如下有益的技术效果：

（1）、本发明采用双通道激发待测样品荧光，单台图像捕获装置实现不同波长荧光实时同步成像，降低了光路系统及整体仪器的成本；

（2）、本发明的双通道实时荧光定量pcr仪光路系统结构紧凑，减少传输距离光强损耗，此光路系统也避免了激发光和荧光之间的干扰，提高了图像捕获装置接收信噪比和仪器检测灵敏度；

（3）、本发明的检测方法实现了不同波长荧光实时同步成像，运转高效，避免激发光和荧光之间的干扰；

（4）、本发明的光路系统设计简单、结构紧凑，减少了光路系统中的光信号传输衰减，也有利于整体仪器小型化、模块化；

（5）、本发明光路系统结合微流控芯片技术的微型化、集成化、反应迅速、灵敏度高等特性，能够进一步地拓宽应用领域，更好地推动多学科优势互补型发展。

附图说明

图1是本发明的双通道实时荧光定量pcr仪光路系统示意图；

图2是本发明的双通道实时荧光定量pcr仪光路系统结构图；

图3是本发明的微流控芯片实时荧光定量pcr检测的扩增曲线图；

图4是本发明的微流控芯片实时荧光定量pcr检测的方法流程图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。

技术术语解释：

本发明的第一方面提供了一种双通道实时荧光定量pcr仪光路系统，该光路系统可应用于微流控芯片实时荧光定量pcr检测，该光路系统至少可以支持两种波长出射荧光的检测。如图1所示，该光路系统包括双色激发模块100、微流控芯片模块200、双通道荧光探测模块300和图像处理模块400。具体的，所述双色激发模块100包括两个激发光源111和112、短带通二向色镜120、双带通滤光片130、双带通二向色镜140。

所述微流控芯片模块200包括微流控芯片210和升降温模块220，待测样品夹持在所述升降温模块220上。

所述双通道荧光探测模块300包括第一聚焦透镜310，长带通二向色镜320，第一单带通滤光片331和第二单带通滤光片332，第一反射镜341、第二反射镜342和第三反射镜343，第二聚焦透镜350。

所述图像处理模块400包括图像捕获装置410，该图像捕获装置可以为cmos图像捕获装置。

所述短带通二向色镜120和微流控芯片210之间依次设有双带通滤波片130和双带通二向色镜140，所述第一激发光源111发出的激发光经该短带通二向色镜120透射、以及所述第二激发光源112发出的激发光经该短带通二向色镜120反射后，均入射到该双带通滤光片130，经过该双带通滤光片130后入射到双带通二向色镜140。

所述双带通二向色镜140之后的光路中，紧邻该双带通二向色镜140设有第一聚焦透镜310。

第一聚焦透镜310和第一单带通滤光片331之间设有长带通二向色镜320。第一聚焦透镜310和第二单带通滤光片332之间设有长带通二向色镜320。

在长带通二向色镜320与第一反射镜341之间设置有相应波长的第一单带通滤光片331，在长带通二向色镜320与第二反射镜342之间设置有相应波长的第二单带通滤光片332。

在第二反射镜342与图像捕获装置410之间、第三反射镜343与图像捕获装置410之间放置透镜350。

经第二反射镜342反射的荧光光束入射到透镜350。

经第一反射镜341反射的荧光光束入射到第三反射镜343、再经第三反射镜343反射后的荧光光束入射到透镜350。

入射到透镜350的光束，经透镜350汇聚于图像捕获装置410的感光面。

第一激发光源111和第二激发光源112为不同波长的led光源，可依据实际样品需求灵活选择。两个led光源各自出射的激发光分别直射到短带通二向色镜120，该短带通二向色镜120将两束激发光合束，该合束后的光再经双带通滤光片130直射到双带通二向色镜140，所述直射到双带通二向色镜140的光束是双带通二向色镜140的入射光束，双带通二向色镜140将该入射光束转向后垂直入射到待测样品，之后从待测样品激发产生的荧光依次经双带通二向色镜140、第一聚焦透镜310、长带通二向色镜320、第一单带通滤光片331和第二单带通滤光片332、第一反射镜341、第二反射镜342和第三反射镜343、透镜350后，汇聚于图像捕获装置410的感光面。

具体的，本实施例的两个led激发光源111和112的中心波长分别为470nm和625nm，两束出射的激发光直射到短带通二向色镜120。该截止波长500nm的短带通二向色镜120将两led激发光源的出射光合束，实现双通道激发光实时同步传输，实现不同激发波长光束共用通道实时传输。

具体的，本实施例的双带通滤光片130的带通范围为461-496nm、621-653nm，该双带通滤光片130有效滤除led光源111和112中心波长周围杂散光。

具体的，本实施例的双带通二向色镜140的带通范围为500-540nm、655-745nm，该双带通二向色镜140将激发光反射进入待测样品，样品出射的荧光透射穿过该双带通二向色镜140，以满足激发光与荧光分离，避免二者传输干扰。

该第一聚焦透镜310将透射穿过该双带通二向色镜140的出射荧光汇聚，以满足荧光光束宽度不超过长带通二向色镜320，避免丢失荧光信号，提高收集效率。

截止波长635nm的长带通二向色镜320实现不同波长荧光分通道传输,与第一反射镜341、第二反射镜342、第三反射镜343配合使用，调整出射双波长荧光光程，使得不同波长荧光到达图像捕获装置感光面时处于同一傅里叶后焦面。在本实施例中，所述样品出射的双波长荧光在图像捕获装置感光面时处于同一傅里叶后焦面。

具体的，本实施例的第一单带通滤光片331的中心波长为520nm，带宽为40nm；第二单带通滤光片332的中心波长为690nm，带宽为50nm。二者能够有效避免出射荧光波长附近的杂散光，提高信噪比和检测灵敏度。

通过第一单带通滤光片331、第一反射镜341与第三反射镜343的短波长荧光、通过第二单带通滤光片332和第二反射镜342的长波长荧光以一定夹角α进入透镜350，其中α>0,α的值取决于第一透镜310与第二透镜350的焦距的比值。

微流控芯片210在第一聚焦透镜310前焦面上，第一聚焦透镜310后焦面与第二聚焦透镜350的前焦面重合；图像捕获装置感光面410在第一聚焦透镜310后焦面上，调整出射双波长荧光光程，使得不同波长荧光到达图像捕获装置感光面410时处于同一像面上，调节第二反射镜342和第三反射镜343倾角使不同波长荧光成像在图像捕获装置感光面410的不同位置上并且没有重合区域。

本发明的第二方面提供了一种微流控芯片实时荧光定量pcr检测的方法，采用如前所述的双通道实时荧光定量pcr仪光路系统进行检测，包括如下步骤，如图4所示：

步骤s100，配制pcr反应试剂，将待测样本加入到所述pcr反应试剂中，并将所述带有待测样本的pcr反应试剂添加到微流控芯片中。

具体的，该待测样本可以是合成的病毒质粒，按照商品化病毒核酸检测试剂盒的要求，将合成的病毒质粒，加入pcr反应试剂中，然后将带有病毒核酸质粒的pcr反应试剂，添加到微流控芯片中。

步骤s200,将所述微流控芯片置于升降温模块上，设置所述升降温模块的温度程序进行升降温循环，并进行荧光采集。

将微流控芯片置于升降温模块上，设置升降温模块的温度程序为：例如：首先95℃加热3min，进行预变性；随后进入升降温循环：95℃加热10s进行变性，55℃加热35s进行退火延伸，共进行45个循环，实现核酸扩增。在每一次55℃加热33s的时候进行荧光采集。

步骤s300,使双色激发光的入射方向朝向微流控芯片的透光面，pcr反应试剂中的两种荧光探针上的荧光基团发出出射荧光，所述出射荧光通过双带通二向色镜，经由透镜汇聚，再通过长带通二向色镜实现不同波长荧光分通道传输,与反射镜配合使用，调整出射双波长荧光光程，成像在图像捕获装置感光面。

步骤s400,采集荧光信号，绘制荧光信号强度曲线，根据所述曲线判断目标模板的初始浓度，实现定量检测。

随着升降温循环的进行，采集到的图形的荧光信号会逐渐增强，达到一定值后保持不变，荧光强度可以绘制得到一条横坐标为时间（ct数，循环数），纵坐标为荧光强度的“s”型曲线，根据该曲线即可判断目标模板的初始浓度，实现新型冠状病毒核酸的定量检测。

下面以一个具体的实施例，来进一步说明选取新型冠状病毒核酸质粒作为检测的目标模板，配合商品化检测试剂盒进行检测的方法。

参照图1所示为上述光路系统配合升、降温加热模块应用于微流控芯片技术领域，实现双通道实时荧光定量pcr检测。该实施方案可以针对各种病原微生物的核酸实现特异性检测，本实施例中将具体选取新型冠状病毒核酸质粒作为检测的目标模板，配合商品化检测试剂盒进行检测。

在本实施例中，按照商品化新型冠状病毒核酸检测试剂盒的要求，配制pcr反应试剂，将合成的新型冠状病毒质粒，按照商品化试剂盒的要求，加入pcr反应试剂中。将带有新型冠状病毒核酸质粒的pcr反应试剂，添加到微流控芯片中。

将微流控芯片置于升降温模块上，设置升降温模块的温度程序为：首先95℃加热3min，进行预变性；随后进入升降温循环：95℃加热10s进行变性，55℃加热35s进行退火延伸，共进行45个循环，实现核酸扩增。在每一次55℃加热33s的时候进行荧光采集。

微流控芯片的透光面朝向双色led激发光入射方向，试剂中的两种荧光探针上的荧光基团发出荧光，出射荧光通过双带通二向色镜，经由透镜汇聚，再通过长带通二向色镜实现不同波长荧光分通道传输,与反射镜配合使用，调整出射双波长荧光光程，成像在图像捕获装置感光面。

随着升降温循环的进行，采集到的图形的荧光信号会逐渐增强，达到一定值后保持不变，荧光强度可以绘制得到一条横坐标为时间（ct数，循环数），纵坐标为荧光强度的“s”型曲线，如图3所示，根据该曲线即可判断目标模板的初始浓度，实现新型冠状病毒核酸的定量检测。

综上所述，本发明提供了一种双通道实时荧光定量pcr仪光路系统，包括双色激发模块、微流控芯片模块、双通道荧光探测模块和图像处理模块；所述双通道荧光探测模块用于对待测样品扩增，并采集荧光；所述双色激发模块用于使待测样品出射荧光，并将激发光源出射的激发光与待测样品出射的荧光分离；所述微流控芯片模块用于实现不同波长荧光分通道传输,调整出射的不同波长荧光的光程使得所述待测样品出射的不同波长荧光在所述图像处理模块的图像捕获装置的感光面处于同一傅里叶后焦面；所述图像处理模块用于感光所述荧光。本发明采用双通道激发待测样品荧光，单台图像捕获装置实现不同波长荧光实时同步成像，降低了光路系统及整体仪器的成本；光路系统设计简单、结构紧凑，减少了光路系统中的光信号传输衰减，也有利于整体仪器小型化、模块化；此光路系统也避免了激发光和荧光之间的干扰，提高了图像捕获装置接收信噪比和仪器检测灵敏度。

应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。