一种异植醇修饰聚丙烯酸酯微球及其制备与应用的制作方法

1.本发明涉及一种光引发制备色谱柱填料单分散聚丙烯酸酯微球的制备及其应用，具体是将单体3-(烯丙基硅烷基)丙烯酸丙酯、功能单体三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、光引发剂2,2-二甲氧基-1,2-二苯乙酮、致孔剂甲苯、十二烷基硫酸钠和聚乙烯醇混合溶液中超声溶解，利用紫外灯引发自由基聚合反应形成粒径均匀的单分散聚丙烯酸酯微球。通过调整单体和功能单体的比例、致孔剂的种类和用量，最终制备出一种具有优异色谱性能的色谱填料单分散聚丙烯酸酯微球。


背景技术：

2.近年来，微型化已经成为液相色谱的发展趋势之一，与此同时也追求着快速分离和高柱效。因此，毛细管微柱液相技术迅速成为研究热点。毛细管液相色谱(capillary-hplc,clc)又称微柱液相色谱(micro-hplc, μlc)是常规高效液相色谱(hplc)微型化的基础上发展起来的一种色谱分离技术。与高效液相色谱相比，毛细管微柱液相对于流动相、固定相、样品的使用消耗很小，有益于节约资源，环境保护，而且易于与质谱(ms) 等检测器联用诸多优点。(文献1.huang x.zhang s.schultz g a,et al. surfance-alkylated polystyrene monolithic columns for peptide analysis incapillary liquid chromatography.anal chem,2002,74(10):2336-2344)。因此，在手性分离、生化分析、蛋白质和多肽的研究及医药、食品和环境分析等领域具有广阔的应用前景。已经成为色谱分离分析的研究热点(文献2.lin h, ou j,zhang z,et al.facile preparation of zwitterionic organic-silica hybridmonolithic capillary column with an improved"one-pot"approach forhydrophilic-interaction liquid chromatography.anal chem,2012,84(6): 2721-2728)。
3.色谱柱是色谱分离的核心，按照色谱柱的制备方法及固定相的存在形式，毛细管柱可分为毛细管填充柱(packed capillary column)、毛细管开管柱(open-tube capillary column)、毛细管整体柱(monolithic capillarycolumn)。毛细管色谱柱被誉为clc的“心脏”，但毛细管色谱柱的制备技术以及对操作人员均有较高的要求，其制备技术是clc技术发展和应用的关键(文献3.qiao x,zhang l,zhang n,et al.imidazolium embedded csbased stationary phase for simultaneous us reversed-phase/hydrophilicinteraction mixed-mode chromatography.j chromatogr a,2018,1553:81-89)。 clc中的固定相大多数以二氧化硅微球(直径为3-5um)为基质。最近，粒径小于2um的多孔硅胶也被应用。虽然粒径的降低会提高柱效，但是也会产生较高的柱压，需要超高性能的仪器。毛细管填充柱是将色谱填料装填入毛细管中制得。色谱填料的种类丰富，而hplc填料也可以用于毛细管色谱柱。毛细管填充柱已经广泛应用于色谱分离领域，对于毛细管填充柱来说，色谱填料直接影响色谱柱对分析对象的选择性和分离效率。色谱填料大多以多孔二氧化硅(直径为3-5um)为基质进行表面化学修饰制备而成，根据所接枝官能团的性质不同而形成不同的色谱分离机制，进而为复杂样品得分离提供了多种选择(文献4.li y,
xu z,feng y,liu x,et al. preparation and evaluation of poly-lysine stationary phase for hydrophilicinteraction/reversed-phase mixed-mode chromatography.chromatographic, 2011,74(7-8):523-530)。毛细管柱的填充方式主要有两种：压力驱动下的装填和电压力驱动下装填。通过高压泵进行匀浆填充法是最常见的，将固定相均匀分散于一定的溶剂中，匀浆管的一端连接高压泵，另一端连接毛细管，在高压的作用下，色谱填料进入毛细管中，同时通过一端柱塞的截留得到所需要的填充长度。毛细管内径比较小，填装过程缓慢，匀浆罐中的固定相悬浮液会沉淀，在整个填充过程中，填料需要不断的用磁子搅拌，同时也可以使色谱柱中装填的填料更均匀致密。由于不同操作者手法不同可能引起毛细管不同批次稳定性和重复性比较差。此外填充柱柱塞引起的色谱峰展宽和气泡问题也是不容易忽视的。
4.通过添加含有多功能乙烯基的试剂，使单分散聚丙烯酸酯微球表面含有乙烯基，便于后期的反应修饰，在实际应用中，具有更广泛的应用空间。它可以作为固定相材料，因其表面含有乙烯基，所以可以利用自由基反应、巯基-烯点击化学等反应进行修饰，实现快速制备与快速分离。制备的单分散聚丙烯酸酯微球可以作为色谱分离的介质，可广泛应用在手性分离、生化分析、蛋白质和多肽等领域。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种基于丙烯酸酯单体之间通过光引发的自由基聚合反应，制备表面具有乙烯基的单分散聚丙烯酸酯微球。
6.在光引发剂为条件下利用巯基-烯点击化学，使聚丙烯酸酯微球表面含有的乙烯基与二硫苏糖醇和三羟甲基丙烷三(3-巯基丙酸酯)的巯基发生反应，从而使聚丙烯酸酯微球表面的基团变成巯基，再利用异植醇的烯键与微球表面的巯基再次利用巯基-烯点击化学进行键合，完成异植醇修饰。
7.具体是将含有丙烯基的3-(烯丙基硅烷基)丙烯酸丙酯和三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、致孔剂和光引发剂的溶液，用细胞破碎仪进行搅拌，紫外曝光反应，用水和乙醇分别洗涤得到单分散聚丙烯酸酯微球。
8.分别以二硫苏糖醇、三羟甲基丙烷三(3-巯基丙酸酯)为键隔臂，利用光引发巯基-丙烯酸酯点击化学进行异植醇修饰。得到具有更好分析分离能力的单分散聚丙烯酸酯微球色谱填料。根据不同的需求，通过调整单体3-(烯丙基硅烷基)丙烯酸丙酯和三羟甲基丙烷三丙烯酸酯的比例，以及通过调整不同致孔剂的种类和用量，制备出具有不同理化性质的单分散聚丙烯酸酯微球。
9.所用单体是3-(烯丙基硅烷基)丙烯酸丙酯(3-(triallylsilyl)propyl acrylate,tapa,cas:1990509-29-9)；
10.所用功能单体是三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(trimethylolpropane triacrylate,trim,cas:15625-89-5)；
11.所用引发剂为光引发剂2,2-二甲氧基-1,2-二苯乙酮 (2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone,dmpa)；
12.所用的制备方法为“二步溶胀法”；
13.聚合反应类型为自由基聚合反应；
14.本发明是以光引发自由基反应制备单分散聚丙烯酸酯微球及其应用。具体是首先将一定量的3-(烯丙基硅烷基)丙烯酸丙酯与三羟甲基丙烷三丙烯酸酯进行混合，加入致孔剂超声溶解，在摇床内采用紫外光引发反应，使单体间聚合成表面含有烯键的单分散聚丙烯酸酯微球，所制备的单分散聚丙烯酸酯微球具有良好的单分散性；然后通过巯基-烯点击反应，分别以二硫苏糖醇和三羟甲基丙烷三(3-巯基丙酸酯)为间隔臂键合异植醇，可以作为毛细管微柱液相色谱的填料。该填料制备过程简单快速、反应条件温，且表面含有乙烯基，易于进行多种功能化修饰。
15.本发明所制备的单分散聚丙烯酸酯微球材料可以应用于色谱分析，尤其适用于毛细管色谱液相，分离对象为五种苯系物(苯、甲苯、乙苯、丙苯、丁苯)。结果显示在反相色谱模式下，五种苯系物能够基线分离，并且具有较好的峰形。
16.本发明的优点
17.(1)光引发制备单分散聚丙烯酸酯微球使得整个制备过程更加的简单，缩短制备时间；
18.(2)单分散聚丙烯酸酯微球中采用的3-(烯丙基硅烷基)丙烯酸丙酯和三羟甲基丙烷三丙烯酸酯为单体制备表面含有乙烯基聚合物微球不曾有过报道；
19.(3)通过改变单体和功能单体的比例以及致孔剂的组成或含量对单分散聚丙烯酸酯微球进行调控，制备出具有不同理化性质的微球；
20.(4)本发明所制备的单分散聚丙烯酸酯微球具有粒径均匀球形形貌，适用于色谱分离分析。
附图说明
21.图1为异植醇修饰聚丙烯酸酯微球的合成修饰示意图。
22.图2为实施例1制备的聚丙烯酸酯微球的扫描氦离子电镜图。
23.图3为实施例2制备的聚丙烯酸酯微球的扫描氦离子电镜图。
24.图4为实施例3制备的聚丙烯酸酯微球的扫描氦离子电镜图。
25.图5为实施例4制备的聚丙烯酸酯微球的扫描氦离子电镜图。
26.图6为实施例5制备的聚丙烯酸酯微球的扫描氦离子电镜图。
27.图7为实施例4制备的聚丙烯酸酯微球的红外谱图：
28.图8为实施例4制备的聚丙烯酸酯微球的氮气吸附/脱附曲线a，孔径分布b。
29.图9为实施例4制备的聚丙烯酸酯微球的水接触角。
30.图10为以实施例6和7异植醇修饰聚丙烯酸酯微球为色谱填料分离苯系物的色谱图(实施例6修饰的微球记为a，实施例7修饰的微球记为b)。
31.图11是在图10的色谱条件测得，不同之处是，将流动相调整为乙腈/ 水(65/35，v/v)、(60/40，v/v)、(55/45，v/v)、(50/50，v/v)、(45/55，v/v) 分别进行测试，绘制而成图11；图11中各个曲线所对应的物质为苯(
■
)、甲苯(
□
)、乙苯(
▲
)、丙苯(σ)和丁苯(
●
)；纵坐标k为保留因子。
32.图12是在图11(a)和(b)的数据上，对苯系物中苯、甲苯、乙苯、丙苯、丁苯的亚甲基数目和保留因子的对数值(log k)进行拟合曲线得到图12(a)和(b)；图12中乙腈含量为45％(
■
)、50％(
□
)、55％(
▲
)、 60％(σ)、65％(
●
)。
具体实施方式
33.实施例1
34.单分散聚丙烯酸酯微球的制备：首先，取15mg单分散粒径为2μm的苯乙烯种子(粒径：2
±
0.2μm)和1ml含0.2％十二烷基硫酸钠(w/v，g/ml) 和5％聚乙烯醇溶液(w/v，g/ml)水溶液，加入用锡纸包裹的石英锥形瓶中，置于紫外摇床中(不开紫外灯，转速为200转，25℃)反应6h，得种子液；
35.向50ml离心管(用锡纸包裹)，并加入210μl 3-(烯丙基硅烷基)丙烯酸丙酯(3-(triallylsilyl)propyl acrylate,tapa,cas:1990509-29-9)、40μl 三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(trimethylolpropane triacrylate,trim, cas:15625-89-5)、250μl甲苯、6ml含0.2％十二烷基硫酸钠(w/v，g/ml) 和5％的聚乙烯醇溶液(w/v，g/ml)水溶液、15mg 2,2-二甲氧基-1,2-二苯乙酮配制而成溶液，用细胞破碎仪进行搅拌处理；
36.将上述溶液倒入种子液中，反应24h；打开紫外灯(波长214nm，转速为200转，25℃)曝光3h，曝光结束后继续在摇床中反应3h后，用水和乙醇分别洗涤两次，用60℃的真空烘箱干燥24h。
37.本方法制备的聚丙烯酸酯微球粒径约为4.9μm(粒径分布范围4.7-5.2 μm)，粒径均匀的球形形貌，但微球表面粘有约为产物总质量10-30％，粒径约为0.6μm的小球(粒径分布范围0.2-0.8μm)；本实施例制备的微球不可用于色谱填料；
38.实施例2
39.操作过程和条件同实施例1，与实施例1不同之处在于，将单体用量调整为170μl 3-(烯丙基硅烷基)丙烯酸丙酯、功能单体为80μl三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、致孔剂为250μl甲苯，其他操作过程和条件同实施例1。
40.本方法制备的聚丙烯酸酯微球粒径约为4.8μm(粒径分布范围 4.5-5.1)，约体积含量25-40％的微球表面带有塌陷，且表面粘有产物总质量 3-10％，粒径约为0.6μm的小球(粒径分布范围0.1-0.4)。本实施例制备的微球不可用于色谱填料；
41.实施例3
42.操作过程和条件同实施例1，与实施例1不同之处在于，将单体用量调整为170μl 3-(烯丙基硅烷基)丙烯酸丙酯、功能单体为80μl三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、致孔剂为250μl环己醇，其他操作过程和条件同实施例1。
43.本方法制备的聚丙烯酸酯微球粒径约为4.7μm(粒径分布范围2.4-5.1 μm)，有体积含量为90％粒径均匀的球形形貌，表面的大孔面积约占比表面积的5-20％；有体积含量为10％的粒径大小不均匀球形形貌；本实施例制备的微球不可用于色谱填料；
44.实施例4
45.操作过程和条件同实施例1，与实施例1不同之处在于，将苯乙烯种子用量调整为75mg，单体用量调整为188μl 3-(烯丙基硅烷基)丙烯酸丙酯、功能单体为62μl三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、致孔剂为250μl环己醇，其他操作同实施例1。
46.本方法制备的聚丙烯酸酯微球粒径约为3μm(粒径分布范围2.8-3.1 μm)，单分散性较好，粒径均匀的球形形貌，所以本实施例制备的微球可以作为色谱填料。
47.实施例5
48.操作过程和条件同实施例1，与实施例1不同之处在于，将苯乙烯种子用量调整为
65mg，单体用量调整为170μl 3-(烯丙基硅烷基)丙烯酸丙酯、功能单体为80μl三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、致孔剂为250μl甲苯，其他操作同实施例1。
49.本方法制备的聚丙烯酸酯微球粒径约为3μm(粒径分布范围2.8-3.2 μm)，单分散性较好，粒径均匀的球形形貌，约体积含量0.5-2％的微球表面带有小孔。所以本实施例制备的微球可以作为色谱填料。
50.实施例6
51.异植醇修饰聚丙烯酸酯微球制备过程如下：称取100mg实施例4制备获得的单分散聚丙烯酸酯微球于玻璃培养皿中，加入4ml乙醇浸泡20min，除去上清液，得微球；向5ml离心管中(用锡纸包裹)加入32mg二硫苏糖醇、20mg 2,2-二甲氧基-1,2-二苯乙酮、2ml乙醇和水(9/1,v/v)，进行超声溶解；将配制的溶液加入微球中，超声使其充分分散，置于紫外交联仪中打开紫外灯光(波长214nm)下反应20min，取出培养皿超声分散 2min，再次进行紫外灯光曝光8min；曝光结束后，用乙醇和水(1/1,v/v) 洗涤微球三次，完成聚丙烯酸酯微球与二硫苏糖醇的接枝；取5ml离心管(用锡纸包裹)加入63mg异植醇、20mg 2,2-二甲氧基-1,2-二苯乙酮、2 ml乙醇和水(9/1,v/v)，进行超声溶解；将配置的溶液加入接枝二硫苏糖醇的微球中，超声分散2min，置于紫外交联仪中，打开紫外灯光(波长214 nm)反应20min，取出培养皿超声2min，再次进行紫外灯光曝光8min；用乙醇和水(1/1,v/v)洗涤微球三次，最后用甲醇洗涤两遍，保存于甲醇中备用。
52.实施例7
53.操作过程和条件同实施例6，与实施例6不同之处在于，将32mg的二硫苏糖醇换为84μl的三羟甲基丙烷三(3-巯基丙酸酯)，其他操作步骤如实施6所述。
54.应用例
55.毛细管柱预处理：首先，取2m内径150μm的紫外透明熔融石英毛细管，对其内壁进行处理；依次用0.1mol/l氢氧化钠、水、0.1mol/l盐酸、水、甲醇冲洗毛细管；随后将γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲基硅烷/甲醇(1/1， v/v)的溶液灌入毛细管中，两端用硅胶密封，置于40℃反应14h；最后用甲醇冲洗毛细管除去未反应物，并在氮气下吹干备用。
56.柱塞制备：称取偶氮二异丁腈2mg，量取甲基丙烯酸十二烷基酯100 ul、乙二醇二甲基丙烯酸酯100ul、正丙醇170ul、1，4-丁二醇130ul 于1.5ml的离心管中，超声溶解。将处理好的柱子裁成35cm，柱塞3cm。用记号笔在毛细管柱做标记，将毛细管两端用硅胶封口60℃水浴3-4h；完成柱塞的制备。
57.毛细管柱的填充：分别称取15mg实施例6和实施例7中异植醇修饰的聚丙烯酸酯微球均匀的分散在750μl甲醇中，将毛细管没有柱塞的一段连接填充装置，在5mpa的压力下将色谱填料填充到毛细管中，由于在填充过程中，色谱填料会沉淀，所需在整个填充过程中需要用磁子搅拌。同时也可以使毛细管柱的装填更加均匀致密。(用实施例6的微球装填的柱子记为(a)柱，实施例7的微球装填的柱子记为(b)柱)，如图10所示。
58.图1为异植醇修饰聚丙烯酸酯微球的合成修饰示意图；用实施例6和7 的方法修饰实施例4制备的聚丙烯酸酯微球。
59.图2、3、4、5、6是在不同的制备的条件下制备的聚丙烯酸酯微球；图5和图6的微球都是单分散性，有较好的形貌，对比图5和图6，最终实验选择使用图5的制备的微球。取干燥的实施例1、2、3、4和5制备的聚丙烯酸酯微球0.5mg左右，置于样品台上，通过扫描氦离子显
微镜(jeoljsm-5600，tokyo，japan)进行微球形貌观察。
60.图7中的是实施例4制备的聚丙烯酸酯微球的红外谱图，图中1726 cm-1
处吸收峰值明显增加，3076cm-1
处吸收峰有所降低，说明聚丙烯酸酯微球中含有单体3-(烯丙基硅烷基)丙烯酸丙酯和功能单体三羟甲基丙烷三丙烯酸酯。称取1mg样品与100mg kbr粉末，研磨混合均匀，使得样品充分的分散在kbr中，将kbr样品放置到烘箱进行烘干。使用红外压片膜具，在3kpa压力下，压成薄片在thermo nicolet 380光谱仪上进行采集。
61.图8为实施例4制备的聚丙烯酸酯微球的氮气吸附/脱附曲线a，孔径分布b；图中看到，微球的比表面积小于10m2/g，孔径小于10nm。称取 100mg实施例4的微球，测试前,装有100mg实施例4微球的测试管需要在120℃下抽真空12h,然后将其放入液氮用micromeritics asap 2460 (micromeritics,shanghai,china)上测量比表面积和孔径分布。
62.图9为实施例4制备的聚丙烯酸酯微球的水接触角为125
°
，说明具有较强的疏水性。称取100mg样品，研磨均匀，使用红外压片膜具，在3kpa 压力下，压成薄片，采用jc2000c仪器(powe reach，shanghai,china) 对微球进行水接触角测量。
63.图10色谱图的色谱条件为：将(a)柱和(b)柱截为柱长25cm，柱塞：0.5cm，流动相为：乙腈/水(50/50,v/v)，流速：100μl/min(分流前)，样品：苯系物，进样量：3μl；色谱图中苯系物的出峰顺序从左到右依次为硫脲、苯、甲苯、乙苯、丙苯、丁苯；所有色谱峰在80min之内出完； (a)柱和(b)柱与图10(a)和(b)对应。从色谱图中看出，每个峰都能达到基线分离，峰形对称。毛细管液相色谱实验是在紫外检测器(k-2051, knauer,berlin,germany)、色谱工作站(hw-2000)、进样阀(model7125i, rheodyne)、数据采集器和液相泵(agilent 1100)组成的高效液相色谱系统进行评价。
64.图11是在图10的色谱条件测得，不同之处是，将流动相调整为乙腈/ 水(65/35，v/v)、(60/40，v/v)、(55/45，v/v)、(50/50，v/v)、(45/55，v/v) 分别进行测试；图11中各个曲线所对应的物质为苯(
■
)、甲苯(
□
)、乙苯 (
▲
)、丙苯(
▽
)和丁苯(
●
)；纵坐标k为保留因子。从图11中看处，随着乙腈含量的增加，各个物质的保留因子均不同程度的降低，符合反相色谱保留机理，说明我们制备的微球具有疏水性。
65.图12是在图11(a)和(b)的数据上，对苯系物中苯、甲苯、乙苯、丙苯、丁苯的亚甲基数目和保留因子的对数值(log k)进行拟合曲线得到图12(a)和(b)；图12中乙腈含量为45％(
■
)、50％(
□
)、55％(
▲
)、 60％(
▽
)、65％(
●
)；从图中看处，我们制备的微球具有疏水能力。
66.由实施例4的制备方法，制备的单分散聚丙烯酸酯微球，操作简单、耗时短、具有粒径均匀的球形形貌，可以通过调整单体与功能单体的比例、苯乙烯种子用量以及致孔剂种类对微球进行调控，从而制备出适用于微柱液相的色谱填料。实施例6和实施例7是将分别实施例4制备的微球进行异植醇的修饰，用于毛细管微柱液相的色谱评价。