一种用于血液灌流的表面多重修饰纳米纤维复合膜及其制备方法

1.本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种用于血液灌流的表面多重修饰纳米纤维复合膜及其制备方法。


背景技术：

2.脓毒症是一种由革兰氏阴性菌细胞壁成分——内毒素诱导的全身性免疫应答失调。目前尚无针对脓毒症的特效治疗药物，临床主要依靠抗生素、体液复苏等方法控制病症发展。在危重症医学上，内毒素被公认与脓毒症的发生密切相关。近年来随着血液净化技术水平的不断提升，以去除血液中内毒素为目的的血液灌流技术逐渐成为我国数以百万计脓毒症患者的新选择。
3.血液灌流技术通过吸附剂对病原物质的特异性/非特异性吸附来达到净化血液、治愈疾病的目的。目前脓毒症血液灌流吸附剂主要为颗粒填充柱，在临床应用中存在以下问题：1)需前置血浆分离，治疗过程繁琐：血液组分复杂，尺寸较大的血细胞容易堵塞孔道引起凝血，因此只能让血浆进入填充柱，需要前置血浆分离过程，增加了治疗步骤和成本；2)颗粒填充柱流道均匀性差，材料利用率低：填充柱内的颗粒吸附材料具有一定流动性、迁移性，导致颗粒堆积产生的流道不均匀，流动阻力小的区域优先吸附饱和而失效，流场死区部分难以发挥作用；3)依靠非亲和作用力，内毒素选择性去除效果差：目前商品化脓毒症血液灌流器主要依靠疏水相互作用实现对内毒素的吸附，但疏水相互作用同时会导致血浆中大量蛋白质的吸附，降低内毒素吸附效率的同时也会造成血液系统紊乱。
4.为了解决以上问题，日本toray公司于1994年设计出了以多粘菌素b作为亲和配基的聚苯乙烯编织纤维柱，但一方面由于多粘菌素b具有一定神经毒性和肾毒性导致了临床使用的安全隐患；另一方面未经血液相容化改性的聚苯乙烯编织纤维柱对血细胞、血蛋白具有较强的非特异性吸附，仍需前置血浆分离，因此没有得到临床的广泛认可。
5.baxter公司研发的oxiris中空纤维膜虽然无需前置血浆分离过程，克服了颗粒填充柱带来的易凝血等问题，但是经相转化法制备的中空纤维膜孔道结构较为狭窄，孔道贯通性差，对于高粘度血浆传递阻力较大，且难以在孔道内彻底做到修饰，因而有效吸附面积仍然不够理想。
6.公开号为cn113262762a的中国专利文献公开了一种血液灌流用吸附材料，该发明采用悬浮聚合的方式，将纯水、分散剂和水相阻聚剂混合，溶解配成水相；将单体、引发剂和致孔剂混合后搅拌至完全溶解，配成油相；将配置的油相投入配置的水相中静置后制备白色不透明球状大孔吸附树脂并对其进行净化处理，得到血液灌流用吸附材料。但该血液灌流用吸附材料的比表面积较市售吸附材料相对较低。
7.公开号为cn113600148a的中国专利文献公开了一种基于肝素改性壳聚糖/纤维素微球的血液灌流吸附剂；该血液灌流吸附剂平均粒径为0.5-2mm，包括交联壳聚糖/纤维素微球，交联壳聚糖/纤维素微球外接枝有肝素涂层，虽然壳聚糖基材带有丰富的正电荷，但
其位于吸附剂内层，其对内毒素的吸附效率有待进一步提高。
8.因此，开发适用于全血灌流的具有内毒素特异性去除能力的吸附剂对提高脓毒症治疗效果和治疗安全性具有重要意义。


技术实现要素：

9.本发明提供了一种表面多重修饰纳米纤维复合膜的制备方法，设备要求低、反应条件温和，制得的表面多重修饰纳米纤维复合膜同时具有血浆分离功能和内毒素特异性去除能力，内毒素吸附容量高，且对血液中总蛋白、纤维蛋白原和白蛋白的吸附少，不引起溶血，血液相容性好。
10.具体采用的技术方案如下：
11.一种表面多重修饰纳米纤维复合膜的制备方法，包括以下步骤：
12.(1)通过静电纺丝法制备得到聚合物基纳米纤维膜，再将聚合物基纳米纤维膜浸泡在多巴胺缓冲液中，取出干燥后再置于信号肽缓冲溶液中反应制备得到信号肽-聚多巴胺@聚合物基纳米纤维膜；
13.(2)向多巴胺缓冲液中通氧使溶解氧达到饱和，并加入聚乙烯亚胺制备得到氨基化聚多巴胺微球；将氨基化聚多巴胺微球、含碳碳双键的阴离子化合物、含碳碳双键的阳离子化合物和激活因子亲和配基在水溶液体系中发生反应，制备得到抗凝血聚多巴胺微球；
14.(3)将步骤(2)的抗凝血聚多巴胺微球沉积到步骤(1)中信号肽-聚多巴胺@聚合物基纳米纤维膜表面形成血浆分离表层，得到所述的表面多重修饰纳米纤维复合膜；
15.所述的聚合物基纳米纤维膜包括聚砜纳米纤维膜、聚醚砜纳米纤维膜、聚氨酯纳米纤维膜或聚乳酸纳米纤维膜。
16.本发明利用多巴胺的氧化、自聚和沉积性，在聚合物基纳米纤维膜表面构建聚多巴胺改性层，随后聚多巴胺改性层与带有氨基官能团的信号肽通过迈克尔加成反应，实现信号肽分子在聚多巴胺改性层表面的共价结合，构建出信号肽功能层，得到信号肽-聚多巴胺@聚合物基纳米纤维膜；随后，在功能化的信号肽-聚多巴胺@聚合物基纳米纤维膜表面利用抗凝血聚多巴胺微球构筑血浆分离表层，制备得到耦合血浆分离功能和内毒素特异性去除能力的表面多重修饰纳米纤维复合膜，该表面多重修饰纳米纤维复合膜是一种性能优异的血液灌流剂。
17.通过优化聚合物分子量和混合溶剂组成可调控聚合物溶液在电场力作用下的拉伸成丝、扰动固化和堆叠成膜行为，以获得具有均匀开发孔道结构的聚合物基纳米纤维膜。
18.优选的，所述的聚合物基纳米纤维膜为聚砜纳米纤维膜，由重均分子量为5万-25万的聚砜溶解于有机溶剂中配制质量浓度为10-20wt％的聚砜纺丝液通过静电纺丝得到。
19.进一步优选的，所述的有机溶剂包括n,n-二甲基甲酰胺、n-甲基吡咯烷酮、二氧六环、n,n-二甲基乙酰胺和丙酮中的至少两种。
20.优选的，步骤(1)中，将聚合物基纳米纤维膜进行预处理后再转移至多巴胺缓冲液中，预处理的方法为：将聚合物基纳米纤维膜浸润到乙醇或异丙醇中，以进一步提高多巴胺在聚合物基纳米纤维膜表面的粘附。
21.多巴胺具有较强粘结性，被广泛应用于材料的表面改性。为了在聚合物基纳米纤维膜表面构筑具有活性且均匀的表层，需要控制好多巴胺溶液反应条件。
22.步骤(1)中，多巴胺缓冲液的配制方法为：配制tris-hcl缓冲液，调节溶液ph为6-10，将多巴胺加入至tris-hcl缓冲液中得到多巴胺缓冲液。
23.优选的，步骤(1)中，所述的多巴胺缓冲液中，多巴胺的质量分数为0.05-1wt％，聚合物基纳米纤维膜在多巴胺缓冲液中的浸泡时间为12-100h。
24.内毒素特异性配基分子信号肽的结构是决定内毒素亲和吸附性能优劣的关键。优选的，步骤(1)中，信号肽为由氨基酸序列为qalik、kiykw、isgkw、kaqakpqk、yviikp、rflkyvkip中的2-5个短链多肽组成的长链肽；所述的信号肽缓冲溶液的浓度为1-20mmol/l，ph为7-8.5；反应时间为12-48h。
25.血浆分离表层构筑基元应具有较高的血液相容性和适宜的尺寸大小，因此，需要对聚多巴胺微球进行尺寸控制和表面修饰。
26.优选的，步骤(2)中，多巴胺缓冲液的配制方法与步骤(1)相同，多巴胺缓冲液中多巴胺的浓度为2-4g/l；向多巴胺缓冲液中持续通氧3-10min，使多巴胺缓冲液中溶解氧达到饱和。
27.优选的，每升多巴胺缓冲液中，加入500-4000mg的聚乙烯亚胺，其中，聚乙烯亚胺的平均分子量为600-10000。
28.优选的，步骤(2)中，制备得到氨基化聚多巴胺微球为0.1-2μm。
29.步骤(2)中，含碳碳双键的阴离子化合物为2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸、甲基丙烯磺酸钠和10-(2-甲基丙烯酰氧基)磷酸单癸酯中的至少一种；含碳碳双键的阳离子化合物为甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵；激活因子亲和配基为合成肽pmx-53。
30.优选的，所述的水溶液体系中，含碳碳双键的阴离子化合物的浓度为0.1-1mol/l；含碳碳双键的阳离子化合物的浓度为0.1-1mol/l；激活因子亲和配基的浓度为0.2-10mmol/l；氨基化聚多巴胺微球的浓度为1～5g/l。
31.优选的，步骤(2)中，反应条件为30-300℃，4-60h。
32.步骤(2)制得的抗凝血聚多巴胺微球具有抗血浆蛋白粘附以及亲和吸附血液中补体激活因子的作用。
33.优选的，步骤(3)中，将抗凝血聚多巴胺微球分散于水、乙醇或异丙醇中得到分散液，通过抽滤法、静电喷涂法、旋涂法或气喷法将抗凝血聚多巴胺微球沉积到信号肽-聚多巴胺@聚合物基纳米纤维膜表面，形成血浆分离表层。
34.血浆分离表层应具有较佳的血细胞与血浆分离功能，且血浆流动阻力小，因此需要控制血浆分离表层孔径和表层厚度。优选的，血浆分离表层的孔径为0.1～5μm，厚度为5～50μm。
35.本发明还提供了所述的表面多重修饰纳米纤维复合膜的制备方法制得的表面多重修饰纳米纤维复合膜；该表面多重修饰纳米纤维复合膜具有血浆分离表层和信号肽-聚多巴胺@聚合物基纳米纤维支撑层，信号肽-聚多巴胺@聚合物基纳米纤维支撑层包括聚合物基纳米纤维膜和其表面沉积的聚多巴胺-信号肽改性层。
36.本发明还提供了所述的表面多重修饰纳米纤维复合膜在血液灌流领域中的应用。
37.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
38.(1)本发明通过调控多巴胺自聚沉积的条件来保证pda改性层的均匀性和连续性的同时，再将内毒素特异性配基分子信号肽共价结合到pda改性层上，构建得到具有良好血
液相容性和内毒素选择性吸附能力的信号肽-聚多巴胺@聚合物基纳米纤维膜；另一方面，本发明合成了具有良好抗凝血特性的聚多巴胺微球，并控制该微球的沉积、聚集行为，在信号肽-聚多巴胺@聚合物基纳米纤维膜构筑得到具有血浆分离特性的表层，制备得到耦合血浆分离功能和内毒素特异性去除能力的表面多重修饰纳米纤维复合膜。解决了现有技术中血液灌流吸附剂应用时需要前置血浆分离的问题。
39.(2)本发明方法对聚合物基纳米纤维膜设备要求低、反应条件温和。
40.(3)本发明方法制得的用于血液灌流的表面多重修饰纳米纤维复合膜具有血浆分离表层和信号肽-聚多巴胺@聚合物基纳米纤维支撑层，信号肽-聚多巴胺@聚合物基纳米纤维支撑层包括聚合物基纳米纤维膜和表面沉积的聚多巴胺-信号肽改性层，其中，血浆分离表层具有优异的抗凝血和血浆分离性能。
41.(4)与文献中报道的商品化脓毒症血液灌流吸附剂相比，本发明提供的用于血液灌流的表面多重修饰纳米纤维复合膜具有更高的内毒素吸附容量，且对血液中总蛋白、纤维蛋白原和白蛋白的吸附少，不引起溶血，血液相容性好。
附图说明
42.图1为实施例1-5中信号肽-聚多巴胺@聚砜纳米纤维膜的扫描电镜图片，其中，a为实施例1表面形貌，b为实施例2表面形貌，c为实施例3表面形貌、d为实施例4表面形貌，e为实施例5表面形貌，f为实施例5截面形貌。
43.图2为实施例5中信号肽-聚多巴胺@聚砜纳米纤维的透射电镜图片及n元素和s元素分布图，其中，a为tem图片，b为n元素分布图，c为s元素分布图。
44.图3为实施例1-5中制得的表面多重修饰纳米纤维复合膜的扫描电镜图片，其中，a为实施例1，b为实施例2，c为实施例3、d为实施例4，e为实施例5，f为e的截面放大图。
45.图4为实施例5中表面多重修饰纳米纤维复合膜的xps图片。
46.图5为实施例5中聚砜纳米纤维膜和表面多重修饰纳米纤维复合膜对磷酸缓冲液中内毒素的吸附性能图。
47.图6为实施例5中聚砜纳米纤维膜和表面多重修饰纳米纤维复合膜对兔全血中内毒素的吸附性能图。
48.图7为实施例5中聚砜纳米纤维膜和表面多重修饰纳米纤维复合膜及对比例1中pda改性聚砜纳米纤维膜对兔血浆中总蛋白、白蛋白和纤维蛋白原的吸附性能图。
具体实施方式
49.下面结合附图与实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
50.实施例1-5中采用的合成肽pmx-53采购于阿拉丁，货号为p287298-1。
51.实施例1
52.(1)将聚砜(重均分子量为8万)溶解于n-甲基吡咯烷酮(nmp)和丙酮的混合溶剂中配制质量浓度为15wt％的聚砜纺丝液(nmp与丙酮的质量比为20：80)，通过静电纺丝法制备得到聚砜纳米纤维膜烘干备用，静电纺丝的参数为：纺丝喷头内径为0.41mm，电压15kv，纺丝液流速1.5ml/h，转筒收集器，接收距离30cm；
53.(2)将步骤(1)的聚砜纳米纤维膜用异丙醇浸润预处理后，转移至多巴胺质量分数为0.2wt％的多巴胺缓冲液中，室温下浸泡反应60h。反应完毕后取出清洗、干燥，得到pda改性聚砜纳米纤维膜；再将pda改性聚砜纳米纤维膜置于浓度为10mmol/l，ph为7，氨基酸序列为kiykw kaqakpqk isgkw的信号肽缓冲溶液中，在30℃下反应12h，反应制备得到信号肽-聚多巴胺@聚砜纳米纤维膜；
54.(3)将多巴胺加入ph为8.5的tris-hcl缓冲液中配制1l多巴胺浓度为4g/l的多巴胺缓冲液中，持续通氧5min使其中的溶解氧达到饱和，然后持续搅拌24h，随后加入2g平均分子量为1800的聚乙烯亚胺，利用聚乙烯亚胺的氨基与聚多巴胺上邻苯二酚基团的席夫碱/迈克尔加成反应制备氨基化聚多巴胺微球，并通过离心分离方法收集氨基化聚多巴胺微球；
55.(4)将氨基化聚多巴胺微球以2g/l的浓度分散于含有0.1mol/l 2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸、0.1mol/l甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、0.5mmol/l合成肽pmx-53的水溶液中反生反应，反应温度为35℃，时间为24小时，制备得到荷电平衡且可吸附补体激活因子的抗凝血聚多巴胺微球；
56.(5)将抗凝血聚多巴胺微球分散于去离子水中配制得到浓度为10wt％的分散液，以1ml/h的速度静电喷涂到信号肽-聚多巴胺@聚砜纳米纤维膜表面，制得的所述表面多重修饰纳米纤维复合膜。
57.实施例2
58.(1)将聚砜(重均分子量为10万)溶解于nmp和n,n-二甲基乙酰胺(dmac)的混合溶剂中配制质量浓度为10wt％的聚砜纺丝液(nmp与dmac的质量比为20：80)，通过静电纺丝法制备得到聚砜纳米纤维膜烘干备用，静电纺丝的参数为：纺丝喷头内径为0.41mm，电压15kv，纺丝液流速1.5ml/h，转筒收集器，接收距离30cm；
59.(2)将步骤(1)的聚砜纳米纤维膜用异丙醇浸润预处理后，转移至多巴胺质量分数为0.1wt％的多巴胺缓冲液中，室温下浸泡反应48h。反应完毕后取出清洗、干燥，得到pda改性聚砜纳米纤维膜；再将pda改性聚砜纳米纤维膜置于浓度为16mmol/l，ph为7.5，氨基酸序列为qalik kiykwrflkyvkip的信号肽缓冲溶液中，在30℃下反应24h，反应制备得到信号肽-聚多巴胺@聚砜纳米纤维膜；
60.(3)将多巴胺加入ph为8.5的tris-hcl缓冲液中配制1l多巴胺浓度为2g/l的多巴胺缓冲液中，持续通氧5min使其中的溶解氧达到饱和，然后持续搅拌24h，随后加入2g平均分子量为1600的聚乙烯亚胺，利用聚乙烯亚胺的氨基与聚多巴胺上邻苯二酚基团的席夫碱/迈克尔加成反应制备氨基化聚多巴胺微球，并通过离心分离方法收集氨基化聚多巴胺微球；
61.(4)将氨基化聚多巴胺微球以2g/l的浓度分散于含有0.5mol/l甲基丙烯磺酸钠、0.5mol/l甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、0.5mmol/l合成肽pmx-53的水溶液中反生反应，反应温度为200℃，时间为48小时，制备得到荷电平衡且可吸附补体激活因子的抗凝血聚多巴胺微球；
62.(5)将抗凝血聚多巴胺微球分散于无水乙醇中配制得到浓度为10wt％的分散液，真空抽滤至信号肽-聚多巴胺@聚砜纳米纤维膜表面，制得的所述表面多重修饰纳米纤维复合膜。
63.实施例3
64.(1)将聚砜(重均分子量为15万)溶解于二氧六环(dox)和n,n-二甲基甲酰胺(dmf)的混合溶剂中配制质量浓度为20wt％的聚砜纺丝液(dox与dmf的质量比为10：90)，通过静电纺丝法制备得到聚砜纳米纤维膜烘干备用，静电纺丝的参数为：纺丝喷头内径为0.41mm，电压15kv，纺丝液流速1.5ml/h，转筒收集器，接收距离30cm。
65.(2)将步骤(1)的聚砜纳米纤维膜用乙醇浸润预处理后，转移至多巴胺质量分数为0.5wt％的多巴胺缓冲液中，室温下浸泡反应72h。反应完毕后取出清洗、干燥，得到pda改性聚砜纳米纤维膜；再将pda改性聚砜纳米纤维膜置于浓度为8mmol/l，ph为8.5，氨基酸序列为rflkyvkipkaqakpqk的信号肽缓冲溶液中，在30℃下反应36h，反应制备得到信号肽-聚多巴胺@聚砜纳米纤维膜；
66.(3)将多巴胺加入ph为8.5的tris-hcl缓冲液中配制1l多巴胺浓度为4g/l的多巴胺缓冲液中，持续通氧5min使其中的溶解氧达到饱和，然后持续搅拌24h，随后加入1g平均分子量为10000的聚乙烯亚胺，利用聚乙烯亚胺的氨基与聚多巴胺上邻苯二酚基团的席夫碱/迈克尔加成反应制备氨基化聚多巴胺微球，并通过离心分离方法收集氨基化聚多巴胺微球。
67.(4)将氨基化聚多巴胺微球以2g/l的浓度分散于含有0.3mol/l10-(2-甲基丙烯酰氧基)磷酸单癸酯、0.3mol/l甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、0.5mmol/l合成肽pmx-53的水溶液中发生反应，反应温度为120℃，时间为60小时，制备得到荷电平衡且可吸附补体激活因子的抗凝血聚多巴胺微球；
68.(5)将抗凝血聚多巴胺微球分散于去离子水中配制得到浓度为10wt％的分散液，旋涂至信号肽-聚多巴胺@聚砜纳米纤维膜表面，制得的所述表面多重修饰纳米纤维复合膜。
69.实施例4
70.(1)将聚砜(重均分子量为25万)溶解于dox和dmac的混合溶剂中配制质量浓度为15wt％的聚砜纺丝液(dox与dmac的质量比为10：90)，通过静电纺丝法制备得到聚砜纳米纤维膜烘干备用，静电纺丝的参数为：纺丝喷头内径为0.41mm，电压15kv，纺丝液流速1.5ml/h，转筒收集器，接收距离30cm。
71.(2)将步骤(1)的聚砜纳米纤维膜用乙醇浸润预处理后，转移至多巴胺质量分数为0.4wt％的多巴胺缓冲液中，室温下浸泡反应96h。反应完毕后取出清洗、干燥，得到pda改性聚砜纳米纤维膜；再将pda改性聚砜纳米纤维膜置于浓度为20mmol/l，ph为8，氨基酸序列为kiykwisgkw的信号肽缓冲溶液中，在30℃下反应48h，反应制备得到信号肽-聚多巴胺@聚砜纳米纤维膜；
72.(3)将多巴胺加入ph为8.5的tris-hcl缓冲液中配制1l多巴胺浓度为4g/l的多巴胺缓冲液中，持续通氧5min使其中的溶解氧达到饱和，然后持续搅拌24h，随后加入2g平均分子量为1800的聚乙烯亚胺，利用聚乙烯亚胺的氨基与聚多巴胺上邻苯二酚基团的席夫碱/迈克尔加成反应制备氨基化聚多巴胺微球，并通过离心分离方法收集氨基化聚多巴胺微球。
73.(4)将氨基化聚多巴胺微球以2g/l的浓度分散于含有0.1mol/l甲基丙烯磺酸钠、0.1mol/l甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、0.5mmol/l合成肽pmx-53的水溶液中，反应温度
为60℃，时间为36小时，制备得到荷电平衡且可吸附补体激活因子的抗凝血聚多巴胺微球；
74.(5)将抗凝血聚多巴胺微球分散于无水乙醇中配制得到浓度为10wt％的分散液，通过空气喷涂至信号肽-聚多巴胺@聚砜纳米纤维膜表面，制得的所述表面多重修饰纳米纤维复合膜。
75.实施例5
76.(1)将聚砜(重均分子量为8万)溶解于nmp和dmf的混合溶剂中配制质量浓度为20wt％的聚砜纺丝液(nmp与dmf的质量比为15：85)，通过静电纺丝法制备得到聚砜纳米纤维膜烘干备用，静电纺丝的参数为：纺丝喷头内径为0.41mm，电压15kv，纺丝液流速1.5ml/h，转筒收集器，接收距离30cm。
77.(2)将步骤(1)的聚砜纳米纤维膜用乙醇浸润预处理后，转移至多巴胺质量分数为0.2wt％的多巴胺缓冲液中，室温下浸泡反应96h。反应完毕后取出清洗、干燥，得到pda改性聚砜纳米纤维膜；再将pda改性聚砜纳米纤维膜置于浓度为16mmol/l，ph为8.5，氨基酸序列为qalik isgkwkaqakpqkrflkyvkip的信号肽缓冲溶液中，在30℃下反应24h，反应制备得到信号肽-聚多巴胺@聚砜纳米纤维膜；
78.(3)将多巴胺加入ph为8.5的tris-hcl缓冲液中配制1l多巴胺浓度为2g/l的多巴胺缓冲液中，持续通氧5min使其中的溶解氧达到饱和，然后持续搅拌24h，随后加入2g平均分子量为600的聚乙烯亚胺，利用聚乙烯亚胺的氨基与聚多巴胺上邻苯二酚基团的席夫碱/迈克尔加成反应制备氨基化聚多巴胺微球，并通过离心分离方法收集氨基化聚多巴胺微球。
79.(4)将氨基化聚多巴胺微球以2g/l的浓度分散于含有0.3mol/l 2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸、0.3mol/l甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、0.3mmol/l合成肽pmx-53的水溶液中发生反应，反应温度为35℃，时间为48小时，制备得到荷电平衡且可吸附补体激活因子的抗凝血聚多巴胺微球；
80.(5)将抗凝血聚多巴胺微球分散于去离子水中配制得到浓度为10wt％的分散液，通过静电喷涂至信号肽-聚多巴胺@聚砜纳米纤维膜表面，制得的所述表面多重修饰纳米纤维复合膜。
81.对比例1
82.(1)将聚砜(重均分子量为8万)溶解于nmp和dmf的混合溶剂中配制质量浓度为20wt％的聚砜纺丝液(nmp与dmf的质量比为15：85)，通过静电纺丝法制备得到聚砜纳米纤维膜烘干备用，静电纺丝的参数为：纺丝喷头内径为0.41mm，电压15kv，纺丝液流速1.5ml/h，转筒收集器，接收距离30cm。
83.(2)将步骤(1)的聚砜纳米纤维膜用乙醇浸润预处理后，转移至多巴胺质量分数为0.2wt％的多巴胺缓冲液中，室温下浸泡反应96h。反应完毕后取出清洗、干燥，得到pda改性聚砜纳米纤维膜。
84.样品分析
85.(1)形貌及元素分析
86.实施例1-5中信号肽-聚多巴胺@聚砜纳米纤维膜的表面sem图片如图1中的a-e所示，实施例5中信号肽-聚多巴胺@聚砜纳米纤维膜的截面sem图片如图1中的f所示，tem图片如图2中的a所示，对该信号肽-聚多巴胺@聚砜纳米纤维膜进行元素mapping分析，由图2中b
的n元素分布和和图2中c的硫元素分布可得，经聚多巴胺-信号肽改性层中显示出明显的氮元素富集现象，而不显示硫元素的富集，说明此tem样品为单纯的改性层而不包含聚砜纳米纤维内芯，从而证明了本发明制备的改性层为连续无缺陷的信号肽-聚多巴胺改性层。
87.实施例1-5制得的氨基化聚多巴胺微球粒径为0.1～2μm。
88.实施例1-5制得的表面多重修饰纳米纤维复合膜的sem图片如图3中的a-e所示，图3中的f为e的放大图，实验结果表明，本发明在实施例1-5中分别构筑了具备抗凝血功能和血浆分离功能的血浆分离层；特别是实施例5中的表面多重修饰纳米纤维复合膜中，血浆分离表层为连续的表层，孔径分布均匀。
89.此外，经过测试可得，血浆分离表层的孔径为0.1～5μm，厚度为5～50μm。
90.实施例5制得的所述表面多重修饰纳米纤维复合膜的xps图片如图4所示，通过在聚砜纳米纤维膜表面构筑信号肽-聚多巴胺改性层，再在膜表面构筑血浆分离表层，使得聚砜纳米纤维膜含有的特征元素——硫元素不再被xps检测到，而来自信号肽、抗凝血聚多巴胺微球的氮元素信号较为明显，证明了本发明中具有血浆分离表层的纳米纤维复合膜的成功构建。
91.(2)所述表面多重修饰纳米纤维复合膜的血浆分离性能
92.将实施例1-5制得的所述表面多重修饰纳米纤维复合膜置于超滤杯底部，注入兔全血后在该复合膜底部(透过液侧)连接真空泵。在测试过程中，该复合膜完全浸没在兔全血中。兔全血中血细胞留在该复合膜表层的血浆分离表层上，血浆则通过该复合膜被分离出来，实现了血细胞/血浆分离。
93.表1实施例1-5制得的表面多重修饰纳米纤维复合膜的血浆分离性能
[0094][0095]
通过表1可以看出，通过在信号肽-聚多巴胺@聚合物基纳米纤维膜表面构建血浆分离层，可以实现对血浆的有效分离，其中实施例5由于孔道较小，血浆分离通量最小，但仍可满足临床需求。
[0096]
(3)所述表面多重修饰纳米纤维复合膜对不同体系中内毒素的动态吸附效果
[0097]
分别将一定量内毒素工作标准品溶解于磷酸盐缓冲液、肝素钠抗凝兔全血中，分别配制成内毒素浓度为1eu/ml的内毒素缓冲溶液、含内毒素兔全血。
[0098]
取实施例5中的表面多重修饰纳米纤维复合膜为实验组，以实施例5步骤(3)中制得的聚砜纳米纤维膜为对照组，将实验组和对照组的膜样品置于可更换膜滤头中，通过连续吸附实验测试实验组和对照组的膜样品对不同体系中内毒素的吸附率；
[0099]
实验结果分别如图5和图6所示，图5表明在磷酸缓冲液中实施例5的表面多重修饰纳米纤维复合膜可以在3小时内保持95％以上的内毒素吸附率，而聚砜纳米纤维膜则基本不吸附内毒素。图6表明在兔全血中，实施例5的表面多重修饰纳米纤维复合膜在3小时内对内毒素的吸附率超过60％，而聚砜纳米纤维膜则对内毒素没有吸附效果。
[0100]
(4)所述表面多重修饰纳米纤维复合膜对兔血浆中总蛋白、白蛋白和纤维蛋白原的吸附效果
[0101]
分别取面积为4cm
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5cm的实施例5中的聚砜纳米纤维膜和所述表面多重修饰纳米纤维复合膜及对比例1中pda改性聚砜纳米纤维膜将其置于离心管中，加入抗凝兔血浆50ml，放入恒温振荡培养箱中振荡吸附，吸附完毕后取样，采用全自动生化分析仪和凝血仪检测吸附前后血浆总蛋白、白蛋白、纤维蛋白原浓度，计算膜样品对血浆总蛋白、白蛋白、纤维蛋白原的吸附率。
[0102]
实验结果如图7所示，实施例5的表面多重修饰纳米纤维复合膜相较于对比例1和聚砜膜，对血液中蛋白质的非特异性吸附少，血液相容性更高。
[0103]
且本发明制得的用于全血灌流的表面多重修饰纳米纤维复合膜分离出的血浆中没有血细胞，对血细胞的截留率达到100％；综上所述，该表面多重修饰纳米纤维复合膜对内毒素具有较好的特异性吸附作用，可以从血浆中有效地清除内毒素，且该复合膜具有良好的血液相容性，对血液成分没有显著的负面影响，该复合膜非常适用于脓毒症患者的血液净化治疗。
[0104]
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述的仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。