一种降低尿酸浓度的血液灌流器填料的制备方法与流程

1.本发明属于技术领域，特别涉及一种降低尿酸浓度的血液灌流器填料的制备方法。


背景技术：

2.目前，血液灌流是将血液引入装有固态吸附剂的灌流器中，通过吸附作用，清除血液中透析不能清除的外源性或内源性毒素、药物或代谢废物的一种血液净化技术。
3.由于内部填充的固态吸附剂吸附剂材质均为聚苯乙烯树脂或活性炭，目前大多依赖于供应商的直接供应，使用者的自主研发较少，吸附剂所能吸附的物质类型有限，被吸附的物质分子量不能较为准确的控制，使得血液灌流器大多为非特异性吸附。血液灌流器在使用过程中，经常会发生将某些致病物质有效吸附的同时，把分子量大小近似的其余体液成分也一并吸附的情况。这样会导致有益体液成分的丢失，引起一些潜在的风险。
4.目前有部分使用者对固态吸附剂作出了不同程度的修饰和再加工，但填料基材还是局限于树脂供应商的本身产品属性，在实际临床应用时难以灵活选择。现有的大多吸附剂供应商所提供的吸附剂填料基材批次间差异较大，生物相容性不稳定，填料与血液中有害物质的接触不完全，吸附效率不高。现有的修饰或改性方法对树脂本身的基础结构并没有进行根本的改变，非特异性吸附的问题没有得到很好的解决，无法按照特定的需求来选择相应填料的灌流器，限制了灌流器的适用范围。


技术实现要素：

5.本发明提出一种降低尿酸浓度的血液灌流器填料的制备方法，解决了上述问题。
6.本发明的技术方案是这样实现的：一种降低尿酸浓度的血液灌流器填料的制备方法，包括如下步骤：
7.步骤1、充分混合二氧化硅颗粒和hcl，活化二氧化硅颗粒；
8.步骤2、将活化二氧化硅颗粒和无水乙醇、3-(三羟基硅基)丙甲基磷酸酯进行反应后，得到氨基化的二氧化硅颗粒；
9.步骤3、将氨基化的二氧化硅颗粒和n,n-二甲基甲酰胺、三乙胺充分混合，得到混合溶液a，将引发剂加入n,n-二甲基甲酰胺中得到混合溶液b，充分混匀混合溶液a和混合溶液b，得到溴化二氧化硅颗粒；
10.步骤4、将溴化二氧化硅颗粒、tris缓冲液和尿酸氧化酶的水溶液充分混合，得到表面固定有尿酸氧化酶的改性二氧化硅颗粒填料。
11.作为一种优选的实施方式，步骤1中二氧化硅颗粒和hcl的加入比例为，二氧化硅颗粒(g)：hcl(ml)＝1:4；
12.步骤1中充分混合二氧化硅颗粒和hcl的方式为，超声处理后，于室温下进行磁力搅拌。
13.作为一种优选的实施方式，步骤1中充分混合二氧化硅颗粒和hcl后还经过了过滤
和洗涤，洗涤的方式为采用去离子水，洗涤后于恒温4℃的20％乙醇溶液中保存放置。
14.作为一种优选的实施方式，步骤2中活化二氧化硅颗粒、无水乙醇、3-(三羟基硅基)丙甲基磷酸酯的加入比例为，活化二氧化硅颗粒(g)：无水乙醇(ml)：3-(三羟基硅基)丙甲基磷酸酯(ml)＝1:2:(0.6-0.8)；
15.步骤2中将活化二氧化硅颗粒和无水乙醇、3-(三羟基硅基)丙甲基磷酸酯进行反应的条件为，于4℃的恒温条件下冷凝回流后，进行磁力搅拌。
16.作为一种优选的实施方式，步骤2中活化二氧化硅颗粒和无水乙醇、3-(三羟基硅基)丙甲基磷酸酯进行反应后，还经过了过滤和洗涤，洗涤的方式为分别采用无水乙醇和去离子水进行洗涤，洗涤后于恒温4℃的20％乙醇溶液中保存放置。
17.作为一种优选的实施方式，步骤3中氨基化的二氧化硅颗粒和n,n-二甲基甲酰胺、三乙胺的加入比例为，氨基化的二氧化硅颗粒(g)：n,n-二甲基甲酰胺(ml)三乙胺(ml)＝1:3:(0.4-0.6)。
18.作为一种优选的实施方式，步骤3中引发剂和n,n-二甲基甲酰胺的加入比例为，引发剂(ml)：n,n-二甲基甲酰胺(ml)＝1:12.5；
19.引发剂为α-溴异丁酰溴。
20.作为一种优选的实施方式，步骤3中充分混匀混合溶液a和混合溶液b的方式为，在冰浴的条件下将混合溶液b逐滴加入混合溶液a中，进行磁力搅拌反应后，移至30℃恒温继续反应，反应结束后，分别用n,n-二甲基甲酰胺、无水乙醇和去离子水进行洗涤。
21.作为一种优选的实施方式，步骤4中溴化二氧化硅颗粒、tris缓冲液和尿酸氧化酶的水溶液的加入比例为，溴化二氧化硅颗粒(g)：tris缓冲液(ml)：尿酸氧化酶的水溶液(ml)＝2:10:1；
22.步骤4中将溴化二氧化硅颗粒、tris缓冲液和尿酸氧化酶的水溶液充分混合的方法为，于4℃的恒温下进行磁力搅拌反应。
23.作为一种优选的实施方式，溴化二氧化硅颗粒、tris缓冲液和尿酸氧化酶的水溶液充分混合后，还经过了过滤、洗涤和干燥，其中洗涤的方式为采用去离子水，干燥的方式为真空干燥。
24.采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：
25.1、本发明所制得的表面固定有尿酸氧化酶的改性二氧化硅填料颗粒可快速高效分解血液中的尿酸，扩大了以往血液灌流器的适应症范围。
26.2、本发明所采用的二氧化硅颗粒表面无大孔结构，血流动力学更稳定，减少了血栓形成。
27.3、本发明中的血液灌流器填料基质利用了二氧化硅颗粒的表面基团活化，将尿酸氧化酶牢固的固定在颗粒表面，避免脱落。反应条件温和，使尿酸氧化酶得以保留最大的酶的活性。
28.4、填料与血液中单一物质的反应更为高效，缩短整体血液灌流的处理时间，减少过程中风险发生的可能性，提高医疗资源利用率。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现
有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1为本发明的流程示意图。
具体实施方式
31.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.实施例1
33.如图1所示，本发明方法的步骤包括：1、二氧化硅颗粒活化；2、将二氧化硅颗粒氨基化；3、将二氧化硅颗粒溴化；4、尿酸氧化酶固定化，其具体的制作方式如下：
34.取50g粒径0.8mm的二氧化硅颗粒于500ml的烧杯中，加入200ml浓度为1mol/l的hcl溶液，充分搅拌均匀后置于超声池中超声处理20min。
35.在室温下以1200rpm的转速磁力搅拌36h，除去二氧化硅颗粒表面吸附的杂质，使其表面的羟基充分暴露活化。活化处理完成后滤出，用去离子水洗涤5次，将产物活化二氧化硅颗粒置于恒温4℃的20％乙醇溶液中保存备用。
36.将活化二氧化硅颗粒全部置于250ml烧杯中，加入100ml无水乙醇，充分搅拌均匀后置于超声池中超声处理5-10min。然后加入36ml3-(三羧基硅基)丙甲基磷酸酯，在恒温4℃的水浴条件下冷凝回流，以240rpm的转速磁力搅拌反应12h。
37.反应完成后产物滤出，分别使用无水乙醇和去离子水各洗涤3次，除去未反应的试剂，得到表面氨基化的二氧化硅颗粒，置于恒温4℃的20％乙醇溶液中保存备用。
38.将氨基化二氧化硅颗粒全部置于250ml烧杯中，加入150ml n,n-二甲基甲酰胺，充分搅拌均匀后向溶液中加入24ml三乙胺，继续搅拌10-15min，使其充分混匀，得到混合溶液a。
39.取12ml引发剂α-溴异丁酰溴于恒压滴定漏斗中，加入15ml n,n-二甲基甲酰胺稀释，摇匀后的到混合溶液b。
40.在冰浴条件下将溶液b逐滴加入到溶液a中，以240rpm的转速磁力搅拌反应2h，然后后转移至30℃恒温水浴中继续反应12h，反应结束后分别用n,n-二甲基甲酰胺、无水乙醇和去离子水各离心洗涤3次，得到溴化二氧化硅颗粒。
41.将50g溴化二氧化硅颗粒加入250ml ph 8.0的tris缓冲液中，再加入25ml含有40mg尿酸氧化酶的水溶液，恒温4℃下以120rpm的转速磁力搅拌反应6h，反应完成后将产物滤出，水洗3次后真空干燥，得到表面固定有尿酸氧化酶的改性二氧化硅颗粒填料。
42.实施例2
43.如图1所示，本发明方法的步骤包括：1、二氧化硅颗粒活化；2、将二氧化硅颗粒氨基化；3、将二氧化硅颗粒溴化；4、尿酸氧化酶固定化，其具体的制作方式如下：
44.取100g粒径1.2mm的二氧化硅颗粒于1000ml的烧杯中，加入400ml浓度为1mol/l的hcl溶液，充分搅拌均匀后置于超声池中超声处理20min。
45.在室温下以1200rpm的转速磁力搅拌36h，除去二氧化硅颗粒表面吸附的杂质，使其表面的羟基充分暴露活化。活化处理完成后滤出，用去离子水洗涤5次，将产物活化二氧化硅颗粒置于恒温4℃的20％乙醇溶液中保存备用。
46.将活化二氧化硅颗粒全部置于500ml烧杯中，加入160ml无水乙醇，充分搅拌均匀后置于超声池中超声处理5-10min。然后加入48ml3-(三羧基硅基)丙甲基磷酸酯，在恒温4℃的水浴条件下冷凝回流，以240rpm的转速磁力搅拌反应12h。
47.反应完成后产物滤出，分别使用无水乙醇和去离子水各洗涤3次，除去未反应的试剂，得到表面氨基化的二氧化硅颗粒，置于恒温4℃的20％乙醇溶液中保存备用。
48.将氨基化二氧化硅颗粒全部置于250ml烧杯中，加入195ml n,n-二甲基甲酰胺，充分搅拌均匀后向溶液中加入26ml三乙胺，继续搅拌10-15min，使其充分混匀，得到混合溶液a。
49.取15.6ml引发剂α-溴异丁酰溴于恒压滴定漏斗中，加入195ml n,n-二甲基甲酰胺稀释，摇匀后的到混合溶液b。
50.在冰浴条件下将溶液b逐滴加入到溶液a中，以240rpm的转速磁力搅拌反应2h，然后后转移至30℃恒温水浴中继续反应12h，反应结束后分别用n,n-二甲基甲酰胺、无水乙醇和去离子水各离心洗涤3次，得到溴化二氧化硅颗粒。
51.将60g溴化二氧化硅颗粒加入300ml ph 8.0的tris缓冲液中，再加入30ml含有40mg尿酸氧化酶的水溶液，恒温4℃下以120rpm的转速磁力搅拌反应6h，反应完成后将产物滤出，水洗3次后真空干燥，得到表面固定有尿酸氧化酶的改性二氧化硅颗粒填料。
52.实施例3
53.如图1所示，本发明方法的步骤包括：1、二氧化硅颗粒活化；2、将二氧化硅颗粒氨基化；3、将二氧化硅颗粒溴化；4、尿酸氧化酶固定化，其具体的制作方式如下：
54.取150g粒径1.2mm的二氧化硅颗粒于1000ml的烧杯中，加入600ml浓度为1mol/l的hcl溶液，充分搅拌均匀后置于超声池中超声处理20min。
55.在室温下以1200rpm的转速磁力搅拌36h，除去二氧化硅颗粒表面吸附的杂质，使其表面的羟基充分暴露活化。活化处理完成后滤出，用去离子水洗涤5次，将产物活化二氧化硅颗粒置于恒温4℃的20％乙醇溶液中保存备用。
56.将活化二氧化硅颗粒全部置于500ml烧杯中，加入180ml无水乙醇，充分搅拌均匀后置于超声池中超声处理5-10min。然后加入72ml3-(三羧基硅基)丙甲基磷酸酯，在恒温4℃的水浴条件下冷凝回流，以240rpm的转速磁力搅拌反应12h。
57.反应完成后产物滤出，分别使用无水乙醇和去离子水各洗涤3次，除去未反应的试剂，得到表面氨基化的二氧化硅颗粒，置于恒温4℃的20％乙醇溶液中保存备用。
58.将氨基化二氧化硅颗粒全部置于250ml烧杯中，加入225ml n,n-二甲基甲酰胺，充分搅拌均匀后向溶液中加入45ml三乙胺，继续搅拌10-15min，使其充分混匀，得到混合溶液a。
59.取18ml引发剂α-溴异丁酰溴于恒压滴定漏斗中，加入225ml n,n-二甲基甲酰胺稀释，摇匀后的到混合溶液b。
60.在冰浴条件下将溶液b逐滴加入到溶液a中，以240rpm的转速磁力搅拌反应2h，然后后转移至30℃恒温水浴中继续反应12h，反应结束后分别用n,n-二甲基甲酰胺、无水乙醇
和去离子水各离心洗涤3次，得到溴化二氧化硅颗粒。
61.将70g溴化二氧化硅颗粒加入350ml ph 8.0的tris缓冲液中，再加入35ml含有40mg尿酸氧化酶的水溶液，恒温4℃下以120rpm的转速磁力搅拌反应6h，反应完成后将产物滤出，水洗3次后真空干燥，得到表面固定有尿酸氧化酶的改性二氧化硅颗粒填料。
62.对比例
63.血液灌流器包括柱体，柱体内填充有填料，柱体的顶部通过上盖体螺纹连接设置，上盖体的顶部设置有入口，柱体的底部通过下盖体螺纹连接设置，下盖体的底部设置有出口。
64.本对比例中将血浆经由蠕动泵输入血液灌流器中，对血浆进行过滤吸附后输出，并通过尿酸检测实验对输出的血浆进行检测，血液灌流器的柱体内分别放置有改性二氧化硅颗粒填料和普通填料。
65.尿酸检测的方法如下：
66.尿酸在293nm处有特定的紫外吸收,当经尿酸酶水解作用后,生成的产物尿囊素则无此特异性。因此尿酸酶催化前后吸光度的差值与尿酸浓度成正比。
67.试剂器材包括：
68.1. 0.2mol/l硼酸-naoh缓冲液(ph 9.5)
69.2. 1.9mg/ml尿酸酶
70.3. 5 948.4μmol/l尿酸标准贮存液
71.4. 594.84μmol/l尿酸标准应用液
72.5.uv-3000岛津双波长/双光速自动记录分光光度计
73.检测方法包括：
74.1.于石英比色皿中加血清60μl，缓冲液3.0ml混合，以空气为空白，测定尿酸在293nm处吸光度(a1)。
75.2.于上述比色皿中再加入尿酸酶液10μl混合，然后测定反应后尿酸在293nm处对空气的吸光度(a2)。
76.3.测定尿酸酶的吸光值(ae)，于两个石英比色皿中各加入3.06ml缓冲液，一个加10μl尿酸酶液混匀，另一个做参比皿，测定尿酸酶在293nm处的吸光值。
77.计算公式为：
78.样品的δa＝(a1+ae)-a2
[0079][0080]
式中0.075为当5.9484μmol/l尿酸被氧化时，通过1cm光径，在293nm处吸光度。
[0081]
血浆经过填充有改性后填料(实施例1所得)的检测效果如下表所示：
[0082][0083]
血浆经过普通填料的检测效果如下表所示：
[0084][0085]
由上述结果可知，通过改性二氧化硅颗粒填料的血浆中尿酸含量明显下降，对血浆中的尿酸有快速高效的分解效果。
[0086]
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。