专利名称：利用基因双导与杂交相结合的水稻新品种选育方法
(一)技术领域植物育种及生物技术领域。
背景技术：
水稻(Oryzae sativa L.)是我国最大的粮食作物，常年播种面积约为3100公顷，总收获量在2亿吨左右，约占我国粮食总产量的40％。水稻生产在我国农业生产中占有举足轻重的地位。但在水稻的生产中，由于稻瘟病、纹枯病、白叶枯病和各种线虫、病毒病以及螟虫、飞虱、叶蝉等病虫草的为害和不良气候与环境、杂草的影响，严重制约了水稻的高产、优质和稳产。常规育种手段由于抗性亲本缺乏，难以获得理想的优良品种。
以转基因技术为代表的分子育种技术已成为当前水稻品种改良的重要手段。但转基因技术本身以及转基因材料在生产上的应用尚存在许多问题(1)基因枪法、农杆菌介导法等主要的转化方法以及转基因过程中的组织培养过程，都有很强的基因型依赖性，在1个品种(基因型)上建立的转化体系，对于另一个品种不一定完全适用；(2)转基因过程往往涉及到甲基化、重排、基因沉默、位置效应等复杂的遗传机理，获得高水平、稳定表达外源目的基因的转基因个体，其选择效率一般较低，约3％左右，这就要求转基因育种必须规模化，这对于一般的科研单位来说难度较大；(3)目前用以转化的受体亲本往往为组培的模式品种或生产上应用的成型品种，等到转导成功，往往滞后于生产应用；(4)转基因过程涉及丰富的组培变异，很多情况下难以保持受体亲本原有的优良特性，而难以直接应用。因此，对耗费巨大财力、人力获得的高效、稳定表达的转基因材料，通过杂交、回交等工作，作为种质利用，就显得更为迫切和更有价值。
将不同的抗性基因聚合，可以培育获得具有多种抗性的转基因植物。聚合外源基因的方法多种多样，共转化是其中一种常用的方法。将含多个外源基因的多个质粒共同转入一个材料，筛选共转化的植株。这种方法的成功与否决定于这些质粒的共转化频率与整合位置，目前还没有统一的定论。双价或多价外源基因表达载体的构建也是一种行之有效的方法。根据外源基因的作用特点，将功能互补的基因构建在一个载体上，共同转入植物。但是，载体包含的基因越多，载体就越大。就目前的转化技术而言，载体越大，转化越困难。有性杂交是一种行之有效的方法。将不同功能的外源基因先转入不同的个体，再将这些植株采用常规手段进行杂交，借助分子标记辅助选择，可获得多性状改良的转基因品种。特别是在基因转化中，采用不同的基因转化方法，还可避免或减少同源序列的存在，降低多基因聚合时因同源序列引起的基因沉默。该方法有着广阔的应用前景。
发明内容本发明的目的是提供一套利用生物技术(转基因技术、分子标记辅助选择技术等)与常规育种技术相结合(杂交等)，选育水稻新品种的技术——利用基因双导与杂交相结合的水稻新品种选育方法。
本发明通过以下相关配套技术措施实现(1)利用基因枪法和农杆菌侵染法进行水稻基因转化，获得具有目标性状的水稻种质材料。
利用PIG基因枪转化水稻幼胚操作为①取开花后12-15天的水稻种子，先用70％的乙醇消毒3min，再用2％的次氯酸钠消毒45min，无菌水冲洗干净后，取水稻幼胚，置于N6B5培养基上，25～26℃，培养2天，用做基因转化的受体；②水稻幼胚在轰击前置于含0.5mol/L蔗糖的N6B5培养基上高渗处理4小时③PIG基因枪轰击幼胚进行转化，轰击时基因枪的操作参数为样品室真空度29-30in.Hg，氦气压力60PSI，轰击高度17cm，轰击持续时间50ms；和10～16小时；④水稻幼胚在轰击后继续置于含0.5mol/L蔗糖的N6B5培养基上高渗处理10～6小时；⑤高渗处理后的的水稻幼胚，转入N6B5培养基中，25～26℃恢复培养5天；⑥将恢复培养的幼胚转入选择培养基(N6B5培养基，附加相应抗生素或除草剂)，筛选抗性愈伤组织；⑦将抗性愈伤组织转入MS5K(MS培养基+KT激动素5mg/L+NAA 0.1mg/L)再生培养基上，25～26℃光照培养(12h光照，12h黑暗)，诱导芽的分化；⑧将分化好的绿芽转入MS生根培养基(MS培养基不加任何激素)中，25～26℃培养2～3周，待苗高7～10cm时进行移栽；⑨对获得的转基因植株进行生物学(如抗性鉴定)和分子生物学分析(如PCR检测、核酸杂交等)，筛选目的基因性状优良的单株。
利用农杆菌EHA105侵染法的转化水稻幼胚的操作为①取开花后12～15天的水稻种子，先用70％的乙醇消毒3min，再用2％的次氯酸钠消毒45min，无菌水冲洗干净后，取水稻幼胚，置于N6B5培养基上，25～26℃，培养2天，用于基因转化的受体；②含有双元表达载体(内含目的基因)的农杆菌，接种于含有抗生素的YEP培养基中，28℃和250rpm条件下摇动培养至生长对数期(菌液吸光度OD550为1.8-2.0)；③将培养好的菌液在5000rpm条件下离心10min，然后菌体重新悬浮于共培养缓冲介质N6B5AS培养液(N6B5培养基不加琼脂粉，附加乙酰丁香酮200μmol/L)中，稀释后的菌液浓度约2×108cfu/ml；④将经过预培养的水稻幼胚置于菌液中，25-26℃条件下缓慢摇动1.5h；⑤取出幼胚转入N6B5GAS(N6B5培养基+葡萄糖10g/L+乙酰丁香酮200μmol/L)共培养基中，25～26℃共培养3天；⑥是将共培养后的水稻幼胚，用附加500mg/L羧苄青霉素的无菌水洗3次，再用附加500mg/L羧苄青霉素的N6B5培养液洗1次，用无菌滤纸吸干水分；⑦将水稻幼胚，转入N6B5Cb(N6B5培养基+羧苄青霉素500mg/L)培养基中，25～26℃恢复培养5天；⑧将恢复培养的幼胚转入选择培养基(N6B5Cb培养基，附加相应抗生素或除草剂)，筛选抗性愈伤组织；⑨将抗性愈伤组织转入MS5K(MS培养基+KT 5mg/L+NAA 0.1mg/L)再生培养基上，25～26℃光照培养(12h光照，12h黑暗)，诱导芽的分化；⑩将分化好的绿芽转入MS生根培养基(MS培养基不加任何激素)中，25～26℃培养2～3周，待苗高7～10cm时进行移栽；⑩对获得的转基因植株进行生物学(如抗性鉴定)和分子生物学分析(如PCR检测、核酸杂交等)，筛选目的基因性状优良的单株。
(2)两种基因转化方法转化获得的水稻种质材料，与综合农艺性状优良的品种杂交，选育具有目的基因特征性状、综合农艺性状优良的水稻新品系。
8月下旬，选取正处于盛花期的稻穗，以农艺性状优良的生产品种和转基因水稻为亲本，45℃～46℃温水去雄，进行复交。将获得的杂交后代材料正季在本地种植，冬季在海南岛种植，加速育种进程。整个品系的选育过程主要依据以下步骤进行①获得F1代杂交种种植后，根据植株农艺性状表现，淘汰劣质杂种。②F2群体大田种植2000株以上，根据两类性状的表现进行单株选择a、具有转基因所赋予的特征性状；b、株高、穗型、生育期、丰产性等主要农艺性状符合育种目标。③在F3-F5低世代，将选择的单株按株系种植(每个株系保证20棵以上植株)，首先选择特征性状(如抗性)表现好的株系，然后在这些株系中选择农艺性状好的单株。④F6代种植1000株以上的群体，检测与目标基因紧密连锁的选择标记基因表达情况，作为判断目标基因是否存在的初步依据；并根据选择标记基因的分离情况，判断其为纯合体或杂合体；同时进行特征性状(如抗性)鉴定。⑤7代以后，对初步确定的纯合株系进行3个方面的工作a、利用PCR扩增或核酸杂交等分子检测技术，进一步验证目标基因是否存在；b、进行特征性状鉴定(如抗性等)；c、对产量、品质等育种目标性状进行评价。最终获得具有转基因特征性状(如抗性)、综合农艺性状优良的水稻新品系(种)。
利用PIG基因枪和农杆菌介导法已将抗虫的cry1Ab基因(连同抗除草剂的bar基因)和抗水稻白叶枯病菌的Xa21(连同报道基因gusA基因)分别转入水稻中，获得了大量的抗虫、抗病水稻种质材料。利用这些抗性种质材料，采用杂交等常规育种技术，并结合分子标记辅助育种技术，已选育获得了一批抗螟虫、白叶枯病双抗水稻新株系、品系。
将现代生物技术(转基因技术)与常规育种技术(杂交等)相结合，可达到利用有限的转基因育种材料，获得最大限度地育种效果；其不但提高了育种关键性状的可预见性，又能不断创造新的性状来满足市场对品种需求的变化，有效地解决了因栽培品种的淘汰更换而给生物技术育种所带来的困难。采用两种不同基因导入方法，可以避免或减少同源性序列存在，降低多基因聚合时同源序列引起的基因沉默。分子标记辅助选择技术的应用，还可大大缩短育种周期，有利于加快育种进程，提高育种工作效率。
图1利用基因双导与杂交相结合的水稻新品系选育方法流程1中，1是取开花后12-15天的水稻种子，先用70％的乙醇消毒3min，再用2％的次氯酸钠消毒45min，无菌水冲洗干净后，取水稻幼胚，置于N6B5培养基上，25～26℃，培养2天，用于基因转化的受体；2是利用基因枪对幼胚进行导入基因(轰击)前，将预培养的幼胚转入含0.5mol/L蔗糖的N6B5高渗培养基上处理4小时；3是利用PIG基因枪轰击水稻幼胚，进行基因转化；4是将轰击后水稻幼胚在含0.5mol/L蔗糖的N6B5高渗培养基上继续处理10～16小时；5是将水稻幼胚，转入N6B5培养基中，25～26℃恢复培养5天；6是将恢复培养的幼胚转入选择培养基(N6B5培养基附加相应选择试剂)，筛选抗性愈伤组织；7是用制备好的农杆菌菌液侵染预培养的水稻幼胚；8是将侵染后水稻幼胚转入共培养基，完成基因转化；9是将共培养后的水稻幼胚，用附加500mg/L羧苄青霉素的无菌水洗3次，再用附加500mg/L羧苄青霉素的N6B5培养液洗1次，用无菌滤纸吸干水分；10是将水稻幼胚，转入N6B5Cb培养基(N6B5培养基+羧苄青霉素500mg/L)中，25～26℃恢复培养5天；11是将恢复培养的幼胚转入选择培养基(N6B5Cb培养基附加相应选择试剂)，筛选抗性愈伤组织；12是将抗性愈伤组织转入MS5K(MS培养基加5mg/L的激动素，0.1mg/L NAA)再生培养基上，25-26℃光照培养(12h光照，12h黑暗)，诱导芽的分化；13是将分化好的绿芽转入MS生根培养基中，25-26℃培养2～3周，待苗高7～10cm时进行移栽；14是对获得的转基因植株进行生物学(如抗性)、分子生物学分析(PCR检测、Southern杂交等)，获得目的基因性状优良的转基因植株；15是选择含低拷贝外源基因的转基因植株多代自交，获得遗传稳定的转基因株系；16是利用两种导入方法获得的目的性状优良、遗传稳定的转基因株系与生产品种杂交，选育具有多目的基因性状、综合农艺性状优良的水稻新品系(种)。
(五)具体实施方法实施例抗水稻螟虫、白叶枯水稻新品系的选育利用基因枪法和农杆菌侵染法分别转化获得的抗螟虫和抗白叶枯病的水稻种质材料，在此基础上，将获得的抗性种质材料与综合农艺性状优良的品种杂交，选育获得了综合农艺性状优良、高抗水稻螟虫和白叶枯的水稻新品系。整个品系的选育过程如下取开花后12-15天的水稻品种中国91种子，先用70％的乙醇消毒3min，再用2％的次氯酸钠消毒45min，无菌水冲洗干净后，取中国91的幼胚，置于N6B5培养基上，25～26℃，培养2天(1)；将预培养的中国91幼胚转入含0.5mol/L蔗糖的N6B5高渗培养基上处理4小时(2)；利用PIG基因枪轰击中国91幼胚，转化的质粒为pBTW(内含抗虫cry1Ab基因和抗除草剂的bar基因)，轰击时基因枪的操作参数为样品室真空度29-30in.Hg，氦气压力60PSI，轰击高度17cm，轰击持续时间50ms；(3)；将轰击后中国91幼胚在含0.5mol/L蔗糖的N6B5高渗培养基上继续处理10～16小时(4)；将水稻幼胚，转入N6B5培养基中，25～26℃恢复培养5天(5)；将经过恢复培养的中国91的幼胚转入含有除草剂的选择培养基(N6B5培养基+PPT 14mg/L)，筛选抗性愈伤组织，共获得了6个抗性愈伤组织系(6)；将筛选获得抗性愈伤组织系转入MS5K(MS培养基加5mg/L的激动素，0.1mg/L NAA)再生培养基上，25-26℃光照培养(12h光照，12h黑暗)，诱导芽的分化(12)；将分化好的绿芽转入MS生根培养基中，25-26℃培养2～3周，待苗高7～10cm时进行移栽，共获得了100余株转基因植株(13)；对获得的部分转基因植株进行除草剂抗性鉴定、二化螟抗性鉴定和PCR检测、Southern杂交分析、Northern杂交分析，结果表明，cry1Ab基因和bar基因已整合到水稻的染色体基因组中，并在部分转基因植株中进行了有效地表达，转基因植株表现出良好的抗虫效果(14)；选择含低拷贝外源基因的转基因植株连续自交4代，获得一遗传稳定、抗虫性强的转基因株系，命名为T91(15)。
取开花后12-15天的水稻品种圣稻301的种子，先用70％的乙醇消毒3min，再用2％的次氯酸钠消毒45min，无菌水冲洗干净后，取豫粳6号幼胚，置于N6B5培养基上，25～26℃，培养2天(1)；将含有双元表达载体pCXK1301(内含抗白叶枯病菌的Xa21基因和报道基因gusA)的农杆菌EHA105，接种于含有100mg/L卡那霉素的YEP培养基中，28℃和250rpm条件下摇动培养至生长对数期(菌液吸光度OD550为1.8-2.0)，将培养好的菌液在5000rpm条件下离心10min，然后菌体重新悬浮于共培养缓冲介质N6B5AS培养液(N6B5培养基不加琼脂粉，附加乙酰丁香酮200μmol/L)中，稀释后的菌液浓度约2×108cfu/ml，将经过预培养的豫粳6号幼胚置于菌液中，25-26℃条件下缓慢摇动1.5h(7)；取出幼胚转入N6B5GAS(N6B5培养基+葡萄糖10g/L+乙酰丁香酮200μmol/L)共培养基中，25-26℃共培养3天(8)；将共培养后的豫粳6号幼胚，用附加500mg/L羧苄青霉素的无菌水洗3次，再用附加500mg/L羧苄青霉素的N6B5培养液洗1次，用无菌滤纸吸干水分(9)；将水稻幼胚，转入N6B5Cb(N6B5培养基+羧苄青霉素500mg/L)培养基中，25～26℃恢复培养5天(10)；将恢复培养的幼胚转入含潮霉素选择培养基(N6B5Cb培养基+潮霉素30mg/L)，筛选抗性愈伤组织，共获得52个抗性愈伤组织系(11)；将抗性愈伤组织转入MS5K(MS培养基+KT 5mg/L+NAA 0.1mg/L)再生培养基上，25～26℃光照培养(12h光照，12h黑暗)，诱导芽的分化(12)；将分化好的绿芽转入MS生根培养基(MS培养基不加任何激素)中，25～26℃培养2～3周，待苗高7～10cm时进行移栽，共获得214株转基因植株(13)；对获得的转基因植株进行GUS活性的组织化学染色，PCR检测、Southern杂交分析和Norhtern杂交分析，结果表明Xa21基因和gusA基因已整合于水稻的染色体基因组中，并在部分植株中进行了有效表达，转基因植株表现出良好的抗白叶枯的特性(14)；选择含低拷贝外源基因的转基因植株连续自交3代，获得多个遗传稳定、抗病性强的转基因株系，命名为SX系列(15)。
以T91与综合性状优良的生产品种豫粳6号为亲本，进行复交，同年冬季在海南岛种植F1，并根据田间农艺性状表现，淘汰劣质杂种。F2代种植群体1000余株。每个组合随机选取50株左右的单株，苗期进行除草剂Basta抗性鉴定，并提取部分除草剂抗性植株总DNA，进行PCR检测，发现所有的具有除草剂抗性的植株PCR均为阳性，表明在杂交过程中，cry1Ab基因与bar基因仍表现为紧密连锁遗传。在整个大田生长期不喷施杀虫剂的情况下，在每个组合的F2群体中，选择没有受稻纵卷叶螟、二化螟等鳞翅目害虫为害的且株高、生育期、丰产性等基本农艺性状符合育种目标的单株，经抗除草剂抗性鉴定后，阳性的植株收获种子。此后对收获的单株种植成50株左右的群体的系行，用上述同样的方法，进行标记选择和表型筛选。从F7代中获得1个抗虫性强，农艺性状优良的株系，定名为YB(16)。
选择YB和SX系列中农艺性状优异、米质好的单株进行复交(有性杂交)。应用与YB选育相同的方法，经分子标记辅助选择(除草剂抗性鉴定、GUS活性组织化学染色检测、PCR检测、核酸杂交等)、田间抗病虫性鉴定、农艺性状筛选，经过6～7代加代繁殖，选育出了抗病虫性强、农艺性状良好、遗传稳定的纯合株系230个，多抗水稻新品系6个(SK-1、SK-2、SK-3、SK-4、SK-5、SK-6)。选育出的多抗水稻新品系，高抗水稻螟虫、白叶枯病和除草剂，亩产在700公斤以上，生育期155天，主要品质指标达到国标二级以上(16)。
权利要求
1.一种利用基因双导与杂交相结合的水稻新品种选育方法，其特征在于使用PIG基因枪导入基因时，基因枪的操作参数为样品室真空度29-30in.Hg，氦气压力60PSI，轰击高度17cm，轰击持续时间50ms，水稻幼胚在轰击前后分别在含0.5mol/L蔗糖的N6B5培养基上高渗处理4小时和10～16小时；利用农杆菌菌株EHA105侵染水稻幼胚导入基因时，菌液浓度2×107～8cfu/ml，共培养缓冲介质为N6B5AS培养液(N6B5培养基不加琼脂粉，另附加乙酰丁香酮200μmol/L)，共培养基为N6B5GAS(N6B5培养基+葡萄糖10g/L+乙酰丁香酮200μmol/L)，共培养温度25℃～26℃。
2.权利要求1所述一种利用基因双导与杂交相结合的水稻新品种选育方，特征在于基因枪法和农杆菌侵染法导入基因时，基因转化的受体为水稻开花后12～15天，再在N6B5培养基上预培养2～3天的水稻幼胚。
3.根据权利要求1所述一种利用基因双导与杂交相结合的水稻新品种选育方法，其特征在于使用的N6B5培养基的组成成份为每升培养基中含硝酸钾(KNO3)2830mg、硫酸胺((NH4)2SO4)463mg、硫酸镁(MgSO4·7H2O)185mg、磷酸氢二钾(KH2PO4)400mg、氯化钙(CaCl2·2H2O)166mg、硫酸锰(MnSO4·4H2O)10mg、硼酸(H3BO3)3.0mg、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)2.0mg、碘化钾(KI)0.75mg、钼酸钠(NaMoO4·2H2O)0.25mg、硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.025mg、氯化钴(CoCl2·6H2O)0.025mg、硫酸铁(FeSO4·7H2O)27.8mg、乙二胺四乙酸二钠(C10H14N2O8Na2·2H2O)37.4mg、盐酸硫胺素(C12H17ClN4OS·HCl)1mg、盐酸吡哆锌(C8H11O3N·HCl)1mg、烟酸(C6H5O2N)1mg、脯氨酸(C5H9NO2)500mg、甘氨酸(C2H5NO2)2mg，肌醇(C6H12O6)100mg、2，4-D 2mg、酶解酪蛋白50mg、琼脂粉10g、蔗糖(C12H22O11)30g、pH5.8。
全文摘要
在利用基因枪法和农杆菌侵染法，分别转化获得具有目标性状(如抗病、抗虫)转基因水稻种质材料的基础上，与杂交等常规水稻育种技术相结合，并结合分子标记辅助选择，选育具有多目标性状水稻新品种。该技术集合了生物技术和常规育种两者的优点，可达到利用有限的转基因育种材料，获得最大限度地育种效果；不但提高了育种关键性状的可预见性，又能不断创造新的性状来满足市场对品种需求的变化，有效地解决了因栽培品种的淘汰更换而给生物技术育种所带来的困难。采用两种不同基因导入方法，还可以避免或减少同源性序列存在，降低多基因聚合时同源序列引起的基因沉默。
文档编号C12N15/82GK1769467SQ20051004482
公开日2006年5月10日 申请日期2005年9月28日 优先权日2005年9月28日
发明者温孚江, 朱常香, 姚方印, 宋云枝, 姜明松 申请人:山东农业大学