专利名称：一种鸟苷的生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种鸟苷的发酵生产方法。
背景技术：
鸟苷(guanosine)是嘌呤核苷类物质的一种，分子式C10H13N505，相对分子质量283. 24，白色结晶性粉末，二水化合物为针状结晶，110°C失水，熔点240°C (分解)，比旋光度-60°，能溶于稀矿酸、热乙酸、稀碱(lg/33mL)，沸水，微溶于冷水(lg/1320mL)，不溶于醇、醚、氯仿和苯。鸟苷是一个多用途的核苷，作为核苷类抗病毒药物三氮唑核苷、无坏鸟苷和食品增鲜剂5’ -鸟苷酸的合成原料，其应用前景不亚于肌苷。鸟苷在医药工业中作为很多高效药物的中间体，可用于三氮唑核苷、无坏鸟苷、鸟三磷，氟铁龙等药物的生产，对疱疹、感冒病毒，抗肝炎等有十分确切的疗效，目前人们对该类药品的认识水平日益提高，鸟苷的需求也不断增加。 目前鸟苷的生产方法有化学合成法，酶水解RNA法，菌体自溶法和发酵法，由于化学合成法需要大量的有机溶剂，存在原料来源及环境污染等问题在生产中极少试验。发酵法生产鸟苷从二十世纪六七十年代以来，关于发酵法生产鸟苷的研究报道越来越多，鸟苷发酵属于嘌呤类化合物的生产，其生物合成系统比较复杂，但许多微生物几乎都有相同的生物合成和调节系统，其中研究的比较详细的有枯草芽孢杆菌和产氨短杆菌，在枯草芽孢杆菌中，从PRPP开始经十步反应合成MP。由MP又分出两条环形路线，一条经XMP合成GMP，再还原生产頂P。另一条环路经SAMP合成AMP，再回到MP。经过详细研究已经清楚其反馈抑制和反馈阻遏的控制机制。核苷酸的生物合成途径有两条，一条是利用葡萄糖等碳源和氮源，以5’ -磷酸核糖为出发物质的全合成途径，一条是由嘌呤碱基通过核糖基化及磷酸化而合成的补救途径，但现有的鸟苷产量低、生产过程复杂。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种经济有效的鸟苷的生产工艺，该工艺具有操作简便、投资少、鸟苷的产量大的特点。为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是一种鸟苷的生产工艺，包括菌种活化、种子培养、发酵和鸟苷提取步骤，菌种活化是指取_30±3°C下保藏的甘油种，解冻至室温，吸取O. 1±0. 02ml接种于活化斜面，34±4°C恒温静置培养20_24h得工作种子。进一步在上述鸟苷的生产工艺中，所述的种子培养是指将载有工作种子的活化斜面接种至装有种子培养基的摇瓶中(种子培养基是本领域常用的)，用纱布封口，140r/mon摇床上36±5°C振荡培养8-10h得种子培养液。所述的发酵是取占摇瓶发酵培养基体积6-12%的种子培养液接入装有30mL发酵培养基的500mL摇瓶中，220r/min，36±5°C振荡培养60±5h ;所述摇瓶发酵培养基重量百分配比是味精1.0%、尿素O. 1%、蛋白胨2.0%、酵母粉2. O %、玉米浆水解液O. 5 %、磷酸二氢钾O. 03 %、硫酸铵O. 01 %、硫酸镁O. 01 %、碳酸钙O. 05 %、氯化钠O. I %、硫酸锰O. 01 %、氯化亚铁O. 02 %、这些物质重量比的误差均为±10%。所述的发酵是取占5L发酵罐发酵培养基体积10%的种子培养液接入5L自动控制发酵罐中，在5L发酵罐中装有3L发酵培养基，通风量5±lL/min，培养温度36±5°C，转速150±10rpm，养50土a ;所述5L发酵罐发酵培养基重量百分配比是味精1.0%、尿素O. I %、蛋白胨2. O %、酵母粉2.0%、玉米浆水解液10.0%、磷酸二氢钾O. 03 %、硫酸铵
0.01%、硫酸镁O. 01 %、碳酸钙O. 05%、氯化钠O. I %、硫酸锰O. 01 %、氯化亚铁O. 02%，这些物质的重量比误差均为±10%。在发酵过程中，通过自动流加氨水溶液控制发酵液的pH=6.4±0.03。在发酵过程，如果泡多，可以通过消泡泵手动或自动加入已灭菌的泡敌数滴消泡，发酵开始时流加玉米浆水解液，到45小时停止，所加玉米浆水解液的总量是培养基的10%。所述的鸟苷提取步骤是本领域技术人员常用的技术。(泡敌是发酵过程中起泡时，为了防污染及有利于氧的传递而加入的物质，通常泡敌就是本领域技术人员常用的消泡剂。与现有技术相比，本发明菌种活化就是将保藏状态的菌种接入斜面培养基中扩大培养，一般需要2-3代的活化过程，多次转接培养是为了得到纯而壮的培养物，即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。因为保存条件往往和培养条件不一致，所以要活化，让菌 种逐渐适应培养环境。使用时取一支工作种再次转活，按上述条件培养为斜面种后，接入种子液。为了获的足够多的活力强的菌液，必须进行种子扩大培养。培养的关键点是把握好种子的生长曲线，在其对数生长期的后期进行移种。这样能保证种子的活力，缩短发酵的延滞期。生产菌的上游工程改造可以提高鸟苷的产量，但在发酵生产过程中对其优化代谢调控同样对鸟苷的产量起着相当大的影响，本发明可以使鸟苷产量提高25%以上。
具体实施例方式下面，将通过本发明的实施例进行更加详细的说明。但以下这些实施例只是为了对本发明进行详细的说明而列举的示例，本发明的范围并不只局限于这些实施例。实施例I (摇瓶发酵)菌种活化菌种活化就是将保藏状态的菌种接入斜面培养基中扩大培养,一般需要2-3代的活化过程，多次转接培养是为了得到纯而壮的培养物，即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。因为保存条件往往和培养条件不一致，所以要活化，让菌种逐渐适应培养环境。本案例为取-30°C保藏的甘油种，快速解冻至室温，吸取O. Iml接种于活化斜面，34°C恒温静置培养20-24h，作为工作种于10°C保存。使用时取一支工作种再次转活，按上述条件培养为斜面种后，接入种子液。种子培养为了获的足够多的活力强的菌液，必须进行种子扩大培养。培养的关键点是把握好种子的生长曲线，在其对数生长期的后期进行移种。这样能保证种子的活力，缩短发酵的延滞期。接一环生长良好的活化斜面种至装有25mL的种子培养基的500mL摇瓶中，9层纱布封口，置于旋转式摇床上(140r/mon)，36°C振荡培养8_10h。发酵摇瓶发酵培养的关键是环境培养条件严格控制，使各摇瓶的培养条件一致，不会因为放置的位置不同而造成瓶内发酵液的培养条件不同，导致产苷水平不一致或体现不出发酵水平的差异。发酵前，取上述种子培养液以6-12%接种量(指占摇瓶发酵培养基体积6-12%的种子培养液)接入装有30mL发酵培养基的500mL摇瓶中，220r/min，36°C振荡培养60h。
摇瓶发酵培养基配比味精I. O %、尿素O. I %、蛋白胨2.0%酵母粉2. O %、玉米浆水解液O. 5%、磷酸二氢钾O. 03%、硫酸铵O. 01 %、硫酸镁O. 01 %、碳酸钙O. 05%、氯化钠
O.I %、硫酸锰0.01%、氯化亚铁0.02%、玉米浆水解液5.0%。通过高效液相进行检测，与以往的数据比较，鸟苷产量提高27%。实施例2(5L罐发酵)按10%接种量将种子液接入5L自动 控制发酵罐(发酵液溶氧自动显示。温度和PH值自动控制)中，装液量3L，通风量5L/min，培养温度36°C，转速150rpm。通过自动流加氨水溶液控制PH值为6. 4 ± O. 03。发酵过程泡沫较多时，通过消泡泵手动或自动加入已灭菌的泡敌数滴即可迅速消泡，Oh流加玉米浆水解液，到45小时停止，总量为10%，50h停止发酵。发酵罐培养基配比味精I. 0%，尿素O. I %，蛋白胨2.0%酵母粉2.0%玉米浆1.0%,磷酸二氢钾O. 03%，硫酸铵O. 01 %，硫酸镁O. 01 %，碳酸钙O. 05%，氯化钠O. I%硫酸锰O. 01 %，氯化亚铁O. 02 %。通过高效液相进行检测，与以往的数据比较，鸟苷产量提高25%。实施例3(50L罐发酵)在摇瓶发酵及5L罐发酵可行的基础上，进行放大发酵。种子制备过程与实施例2相同。按10%接种量将种子液接入50L自动控制发酵罐(发酵液D0、温度、PH值、转速自动控制)，装液量30L，通风量8L/min，培养温度36 °C，转速200rpm，通过设定的pH值为6.4±0. I自动控制氨水溶液的流加。发酵后期泡沫较多，通过消泡泵自动加入已灭菌的泡敌消泡，Oh后流加玉米浆水解液，到45小时停止，总量为10%，约50h停止发酵。发酵罐培养基配比味精1.0%，尿素O. I %，蛋白胨2.0%酵母粉2.0%玉米浆1.0%,磷酸二氢钾O. 03%，硫酸铵O. 01 %，硫酸镁O. 01 %，碳酸钙O. 05%，氯化钠O. I%硫酸锰O. 01 %，氯化亚铁0.02%。通过高效液相进行检测，与以往的数据比较，鸟苷产量提高26%。
权利要求
1.一种鸟苷的生产工艺，包括菌种活化、种子培养、发酵和鸟苷提取步骤，其特征在于菌种活化是指取-30±3°C下保藏的甘油种，解冻至室温，吸取O. 1±0. 02ml接种于活化斜面，34±4°C恒温静置培养20-24h得工作种子。
2.根据权利要求I所述鸟苷的生产工艺，其特征在于所述的种子培养是指将载有工作种子的活化斜面接种至装有种子培养基的摇瓶中，用纱布封口，140r/mon摇床上36 ±5°C振荡培养8-10h得种子培养液。
3.根据权利要求2所述鸟苷的生产工艺，其特征在于所述的发酵是取占摇瓶发酵培养基体积6-12%的种子培养液接入装有30mL发酵培养基的500mL摇瓶中，220r/min，36 ±5°C振荡培养60±5h ； 所述摇瓶发酵培养基重量百分配比是味精1.0%、尿素O. 1%、蛋白胨2.0%、酵母粉2. O %、玉米浆水解液O. 5 %、磷酸二氢钾O. 03 %、硫酸铵O. 01 %、硫酸镁O. 01 %、碳酸钙O. 05%、氯化钠O. I %、硫酸锰O. 01 %、氯化亚铁O. 02%、这些物质重量比的误差均为+10% ο
4.根据权利要求2所述鸟苷的生产工艺，其特征在于所述的发酵是取占5L发酵罐发酵培养基体积10%的种子培养液接入5L自动控制发酵罐中，在5L发酵罐中装有3L发酵培养基，通风量5±lL/min，培养温度36±5°C，转速150± lOrpm，养50±2h ； 所述5L发酵罐发酵培养基重量百分配比是味精1.0%、尿素O. 1%、蛋白胨2.0%、酵母粉2. O %、玉米浆水解液10. O %、磷酸二氢钾O. 03 %、硫酸铵O. 01 %、硫酸镁O. 01 %、碳酸钙O. 05 %、氯化钠O. I %、硫酸锰O. 01 %、氯化亚铁O. 02 %，这些物质的重量比误差均为+10% ο
5.根据权利要求4所述鸟苷的生产工艺，其特征在于在发酵过程中，通过自动流加氨水溶液控制发酵液的pH = 6. 4±O. 03。
6.根据权利要求4或5所述鸟苷的生产工艺，其特征在于在发酵过程，通过消泡泵手动或自动加入已灭菌的泡敌数滴消泡，发酵开始时流加玉米浆水解液，到45小时停止。
全文摘要
本发明公开了一种鸟苷的生产工艺，包括菌种活化、种子培养、发酵和鸟苷提取步骤，其特征在于菌种活化是指取-30±3℃下保藏的苷油种，解冻至室温，吸取0.1±0.02ml接种于活化斜面，34±4℃恒温静置培养20-24h得工作种子。该工艺具有操作简便、投资少、鸟苷的产量大的特点。
文档编号C12P19/40GK102864193SQ20121032768
公开日2013年1月9日 申请日期2012年8月30日 优先权日2012年8月30日
发明者黄永嫦, 谢畅丰, 郑凝坚, 冯今亮 申请人:广东肇庆星湖生物科技股份有限公司