专利名称：二鸟苷酸环化酶、其生产方法及其在制备环化-di-GMP及其类似物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的二鸟苷酸环化酶、其制备方法以及其在生产环化-di-GMP及环化-di-GMP类似物中的应用。
背景技术：
C-di-GMP或者双_(3' -5' )_环化二聚体鸟苷一磷酸(环化-di-GMP或者 c-di-GMP)是在细菌中发现的进行胞内信号转导的第二信使(1，2)。积累的证据提示 c-di-GMP调节多种细菌行为，如生物膜形成、能动性以及毒力表达(2)。c-di-GMP在生物膜形成和毒力表达中的关键作用表明c-di-GMP在由一些病原菌导致的慢性和急性感染中起关键作用。环化-di-GMP是广泛的细菌信使分子，具有作为治疗细菌感染的治疗剂的潜力。 环化-di-GMP及其类似物作为治疗剂的潜在应用包括抑制金黄色葡萄球菌(S. aureus) 建群和生物膜形成；抑制人结肠癌细胞增殖；免疫调节分子以及对于抗体产生具有强力作用，及在医疗设备和装置中如在肺吸入器、心脏支架、心脏瓣膜、肠道插管等中防止生物膜形成或者促进生物膜分散。鉴于越来越多的c-di-GMP信号传导与细菌发病机制之间的明显关联，在微生物学界特别感兴趣鉴别和鉴定c-di-GMP信号网络的成分。同时，也探索了 c-di-GMP直接作为治疗细菌感染的治疗剂的应用。据报道外源c-di-GMP可以降低体外细胞-细胞相互作用以及革兰氏阳性病原体金黄色葡萄球菌包括人甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌菌株和动物临床分离株的生物膜形成(9)。在乳腺炎感染的鼠模型中发现c-di-GMP抑制金黄色葡萄球菌建群和生物膜形成，导致宿主清除该病原体的能力增强(10)。研究表明c-di-GMP可以通过抑制人结肠癌细胞的基础增殖和生长因子诱导的增殖而调节宿主细胞应答(11)。研究还提示c-di-GMP是具有强力免疫预防性质和对抗体产生具有疫苗佐剂作用的免疫调节分子(12)。参与c-di-GMP信号传导的大分子包括酶和受体的生物化学鉴定需要使用 c-di-GMP作为生物化学测定的底物或者配体。C-di-GMP也可以用作起始材料以合成 c-di-GMP类似物作为化学探针或者抑制剂。尽管c-di-GMP可以直接得自细菌细胞，但是 c-di-GMP的较低细胞内浓度使得这种方法不适于c-di-GMP生产。环化di-GMP是由具有二鸟苷酸环化酶活性的蛋白质合成。这些蛋白质典型具有特征性GGDEF基序，其是指5个氨基酸的保守序列。所述GGDEF基序位于已经在681个细菌菌种中观测到的GGDEF结构域内。关于该结构域的信息可见于Pfam蛋白质家族数据库 (http //pfam. sanger. ac. uk/family ？ acc = PF00990)。目前使用已知的二鸟苷酸环化酶(DGC)蛋白质通过酶学合成c-di-GMP的产量低。环化di-GMP也是Gluconacetobacte.xylinus中纤维素合酶的别构抑制剂。已经发现c-di-GMP在许多细菌中起作用，这通过大量含有GGDEF、EAL和HD-GYP结构域的蛋白质的存在而证实(3，4)。GGDEF结构域发挥二鸟苷酸环化酶(DGC)功能，催化从GTP合成c-di-GMP (5,6), EAL和HD-GYP结构域发挥磷酸二酯酶(PDE-A)功能，降解 c-di-GMP (7，8)。目前在研究实验室中c-di-GMP是经化学或者酶法少量合成。溶液和固相化学合成方法由于合成途径的多个步骤而是昂贵且耗时的(13-17)。另一方面，通过使用含有DGC 结构域的蛋白质经酶学产生c-di-GMP的方法仅包括两个GTP分子的单缩合(6)。所述酶方法已经由一些实验室用于产生c-di-GMP以通过使用WspR、PIeD或者VCA0956进行生物化学测定，WspR、PieD和VCA0956是分别来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的三个含有嗜中温 DGC结构域的蛋白质(18-21)。先前我们已经发现通过使用嗜中温DGC蛋白质如WspR制备 c-di-GMP仅产生有限量的c-di-GMP (8)。已知DGC蛋白质由细胞c-di-GMP浓度紧密调节。推测这种调节涉及PIeD中的 I-位点(22，23)。PIeD和WspR的晶体结构已经显示所述I-位点含有RXXD基序(23，24)。因为其作为细菌信号分子的作用及其在细菌毒力、发病机制和生物膜形成中的重要性，目前对c-di-GMP及其类似物特别感兴趣。作为主要的研究和开发焦点，需要产生大体积的c-di-GMP或者类似物。使用熟知的DGC蛋白质如WspR和PA290生产c-di-GMP的主要限制之一是在c-di-GMP制备期间酶活性明显丧失。目前可利用的方法有所不足，仅产生有限量的c-di-GMP。能获得大量环化di-GMP是开发该分子作为抗菌剂的前提条件。先前用于合成环化di-GMP的方法成本太高或者太耗时/耗力。发明概述本发明一方面提供了包含GGDEF基序和I-位点的二鸟苷酸环化酶多肽，其中I位点的保守氨基酸精氨酸或者天冬氨酸的至少一个由中性氨基酸置换，形成不结合c-di-GMP 的突变体二鸟苷酸环化酶。优选所述中性氨基酸是非极性氨基酸或者不带电荷的极性氨基酸。在一个实施方案中，所述非极性氨基酸是丙氨酸。在一个实施方案中，所述不带电荷的极性氨基酸是谷氨酰胺。在优选的实施方案中，所述二鸟苷酸环化酶多肽包含这样的氨基酸序列，其与分离自嗜热细菌的包含GGDEF基序的二鸟苷酸环化酶多肽具有至少90%同源性。优选所述嗜热细菌选自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、产乙醇热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)、泉生热袍菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)、多节 I^]烁杆菌 (Fervidobacterium nodosum) > Thermosipho melanesiensis> thermotoga petrophila 或者热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)。在一个实施方案中，所述嗜热细菌是海栖热袍菌。优选所述突变体二鸟苷酸环化酶包含在溶液中的单体。在优选的实施方案中，所述突变体二鸟苷酸环化酶包含SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 3所示或者SEQ ID NO 3所示序列。在一个实施方案中，所述二鸟苷酸环化酶与支持物偶联。在一个实施方案中，所述支持物是sol-gel。
本发明另一方面提供了能表达突变体二鸟苷酸环化酶多肽的多核苷酸，所述多肽包含GGDEF基序及I-位点，其中I位点的保守氨基酸精氨酸或者天冬氨酸的至少一个由中性氨基酸置换。在一个实施方案中，权利要求10的多核苷酸包含SEQ ID NO :1所示序列。本发明另一方面提供了包含本发明多核苷酸的表达载体，所述多核苷酸与能指导所述多核苷酸在宿主细胞中表达的调节序列可操纵地连接。本发明另一方面提供了产生不结合c-di-GMP的本发明突变体二鸟苷酸环化酶多肽的方法。在一个实施方案中，所述突变体二鸟苷酸环化酶多肽是化学合成的。在另一个实施方案中，所述突变体二鸟苷酸环化酶多肽在具有本发明的多核苷酸的本发明的表达载体中产生。本发明另一方面提供了制备环化di-GMP或者环化di-GMP类似物的方法，所述方法包括步骤a)将本发明的突变体二鸟苷酸环化酶多肽与鸟苷-5'-三磷酸温育；及b)分离所述环化di-GMP或者环化di-GMP类似物。在一个实施方案中，所述类似物包括6-硫代-环化di-GMP。在另一个实施方案中，所述类似物包括32P-放射性同位素标记的环化di-GMP。本发明另一方面提供了通过本发明的方法制备的包含下式的类似物
权利要求
1.包含GGDEF基序及I-位点的二鸟苷酸环化酶多肽，其中I-位点的保守氨基酸精氨酸或者天冬氨酸的至少一个由中性氨基酸置换，形成不结合c-di-GMP的突变体二鸟苷酸环化酶。
2.权利要求1的二鸟苷酸环化酶多肽，其中所述中性氨基酸是非极性氨基酸。
3.权利要求2的二鸟苷酸环化酶多肽，其中所述非极性氨基酸是丙氨酸。
4.权利要求1的二鸟苷酸环化酶多肽，其中所述中性氨基酸是不带电荷的极性氨基酸。
5.权利要求4的二鸟苷酸环化酶多肽，其中所述不带电荷的极性氨基酸是谷氨酰胺。
6.权利要求1或2的二鸟苷酸环化酶多肽，其包含与分离自嗜热细菌的包含GGDEF基序的二鸟苷酸环化酶多肽具有至少90%同源性的氨基酸序列。
7.权利要求6的二鸟苷酸环化酶多肽，其中所述嗜热细菌选自海栖热袍菌 (Thermotoga maritima)、产乙酉享热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)、泉生热袍菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)、多节闪烁杆菌(Fervidobacterium nodosum)、Thermosipho melanesiensis、thermotoga petrophila 或者热醋禾裏尔氏菌 (Moorella thermoacetica)0
8.权利要求6的二鸟苷酸环化酶多肽，其中所述嗜热细菌是海栖热袍菌。
9.权利要求1-8任一项的二鸟苷酸环化酶多肽，其中所述突变体二鸟苷酸环化酶包含在溶液中的单体。
10.权利要求1-8任一项的二鸟苷酸环化酶多肽，其中所述突变体二鸟苷酸环化酶包含 SEQ ID NO :2ο
11.权利要求1-8任一项的二鸟苷酸环化酶多肽，其中所述突变体二鸟苷酸环化酶包含 SEQ ID NO :3ο
12.权利要求1-8任一项的二鸟苷酸环化酶多肽，其中所述突变体二鸟苷酸环化酶包含 SEQ ID NO :4ο
13.前述权利要求任一项的二鸟苷酸环化酶多肽，其中所述突变体二鸟苷酸环化酶与支持物偶联。
14.权利要求13的二鸟苷酸环化酶多肽，其中所述支持物是sol-gel。
15.一种多核苷酸，所述多核苷酸能表达包含GGDEF基序及I-位点的突变体二鸟苷酸环化酶多肽，其中所述I-位点的保守氨基酸精氨酸或者天冬氨酸的至少一个由中性氨基酸置换。
16.权利要求15的多核苷酸，其包含SEQID NO=I的序列。
17.—种表达载体，其包含权利要求15或16的多核苷酸，所述多核苷酸与能指导所述多核苷酸在宿主细胞中表达的调节序列可操纵地连接。
18.权利要求1-14任一项的二鸟苷酸环化酶多肽，其中所述突变体二鸟苷酸环化酶多肽是化学合成的。
19.权利要求1-14任一项的二鸟苷酸环化酶多肽，其中所述突变体二鸟苷酸环化酶多肽在权利要求17的表达载体中产生。
20.生产环化-di-GMP或者环化-di-GMP类似物的方法，包括步骤a.将权利要求1-14任一项的突变体二鸟苷酸环化酶多肽与鸟苷-5’-三磷酸温育；及b.分离所述环化-di-GMP或者环化-di-GMP类似物。
21.权利要求20的方法，其中所述类似物包含6-硫代环化-di-GMP。
22.权利要求20的方法，其中所述类似物包含32P-放射性同位素标记的环化-di-GMP。
23.通过权利要求20的方法制备的类似物，其包含下式
全文摘要
本发明描述了一种新的独立的二鸟苷酸环化酶多肽，其具有GGDEF基序及不结合c-di-GMP的一个突变的I-位点。我们证实了通过推定的调节性I-位点中保守残基的突变显著增加c-di-GMP及类似物的产量。本发明报道了c-di-GMP类似物的合成。
文档编号C07K17/04GK102421892SQ201080019476
公开日2012年4月18日 申请日期2010年2月18日 优先权日2009年3月2日
发明者梁照珣, 饶枫 申请人:南洋理工大学