针对人ccn1的抗体及其用途的制作方法

专利名称：针对人ccn1的抗体及其用途的制作方法
针对人CCN1的抗体及其用途
背景技术：
本发明涉及针对人CNNl的抗体(CCN1抗体)、其生产方法、含有所述抗体的药物组合物及其用途。CCNl (CYR61、GIG-I、IGFBP-10、SwissProt 000622)是一种生长因子诱导型立即早期基因，CCN蛋白质家族的一个成员，而且牵涉细胞粘附、血管发生、凋亡和生长停滞或生长刺激(综述见 Chen Y.和 Xiao-Yan D. , J. Cell. Biochem. 100 (2007) 1337-1345 及 Kubota，K.和 Tagikawa，Μ.，Angiogenesis 10(2007) 1-11) CCNl 由模块结构组成， 并且含有38个保守的半胱氨酸残基。CCm与其它CCN蛋白(除了缺乏C端模块的CCN5 外)共享共同的模块结构。CCm包含胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)样基序(域 I，IGF-BP，氨基酸沈-97)、冯维勒布兰德(von Willebrand) C型域(域II，VWC，氨基酸 98-164)、血小板反应蛋白I型域(域III，TSP，氨基酸228-273)和C端模块(域IV，CT, 氨基酸观6-360)。可变域(Var，氨基酸165-227)位于域II和III之间。CCNl结合整联蛋白ανβ3，并经由整联蛋白ανβ3发挥功能以促进促血管生成活性(Chen，N.等，J.Biol. Chem. 42(2004)44166-44176)。CCNl的整联蛋白α νβ 3结合位点在氨基酸116-135之间 (Chen N. J. Biol. Chem. 42 (2004) 44166-44176)并且在域 III 中(Leu, S. J.等，J. Biol. Chem. 278 (2003) 33801-33808)。整联蛋白Q6^1和肝素结合位点位于域III和IV中，介导细胞(Chen 等，J. Biol. Chem. 276 (2001) 47329-47337)。虽然CCN蛋白共享与N端接近的胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)样基序，但是不存在清楚的实验意义来提示在IGF信号传导途径中的功能(Grotendorst，G. R.等， Endocrinology 141 Q000) 22M-2256)。认为冯维勒布兰德C型域(VWC)、血小板反应蛋白 I型域、和C端模块(其在WISP2/CCN5中是缺乏的)对于蛋白质-蛋白质相互作用、寡聚化 (VffC)或与胞外基质分子和受体的相互作用是重要的。小鼠CCNl与人CCNl共享91 %氨基酸序列同一性。鼠CCNl和针对鼠CCNl的抗体参见 0，Brien, T. P.等，Mol. Cell. Biol. 10 (1990) 3569-3577)。CCNl 与结缔组织生长因子-II(CTGF 2/CTGH 2)间也有高同源性。找到与NOV和FISB-12进一步的(但是较低的) 同源性。Babic，A.M.等，于 Proc. Natl. Acad. ki. USA 95 (1998) 6；355_6360 描述了他们的针对人CCNl的抗体显示与小鼠CCNl而非与FISB-12的交叉反应性。在WO 96/001896(其涉及结缔组织生长因子-II”(CTGF-2))、W097/033995 (其涉及人CCN1)、WO 01/55210 (其涉及CCNl组合物和方法)、WO 2005/040191 (其涉及CCNl组合物和方法)、W0 02/04480(其涉及结缔组织生长因子-II ”(CTGHD)、W0 01/98359(其涉及CCNl作为用于治疗和诊断乳腺癌的靶物)、WO 02/26193 (其涉及CCNl在治疗和诊断人子宫平滑肌瘤中的用途)中提及CCm和针对CCm的抗体。Grotendorst，G. R.和Duncan， Μ. R.，FASEB J. 19 (2005) 729-738描述了针对CTGF域的抗体，而且发现了针对N端和C端域的抗体的一些活性。因为域是通过纤溶酶切割生成的，所以此切割在可变域内发生，并且所述域受到破坏。Dong Xie 等，于 J. Biol. Chem. 276 (2001) 14187-14194 描述了 CCNl 与较晚期的疾病有关，而且于Cancer Res. 64 (2004) 1987-1996描述了 CCNl在胶质瘤中过表达，并且牵涉整联蛋白连接性激酶介导的akt和β -联蛋白-TCF/Lef信号传导途径。Schuetze, N.等，Protein Expr. Purif. 42 (2005) 219-225 涉及重组 CCNl 的表达、 纯化、和功能测试。khuetze将可读框克隆入杆状病毒表达载体中，并将该构建体转染入 SF-21昆虫细胞中。将重组CCNl以与人IgG的Fc域的融合蛋白表达，并在蛋白G-kpharose 柱上使用亲和层析来纯化。因为CCNl拥有10%半胱氨酸残基，并且因此呈现一种非常粘的蛋白质，其可容易在纯化和处理过程中损失。该蛋白质还趋向于形成聚集体，并在纯化期间或之后沉淀。Fc标签的添加使这些困难最小化。作者不确定rCCm蛋白的Fc标签是否改变或影响蛋白质的生物化学特征。Leu, S. J.等，J. Biol. Chem. 278 (2003) 33801-33808描述了域I (IGFBP)、域II (VffC)和域III (TSPl)的加有六组氨酸标签的CCNl片段的重组表达。 天然的不加标签的蛋白质不可获得。Jedsadayanmata, A.等，J. Biol. Chem. 274(1999)24321-24327 提及了针对包含CCNl的可变域(a. a. 163至229)和TSPl域(a. a. 228-27 的各部分的肽生成的抗肽多克隆抗体，用于调查人血小板的激活依赖性粘附。通过用在大肠杆菌(E.coli)中重组生成的Var-GST融合蛋白免疫家兔来生成多克隆抗血清(Kireeva等，Exp. Cell Res. 233(1997)63-77)。US 7，521，540 要求保护一种结合人 Cyr61 的氨基酸 163-2 和 210-225的抗体。依照US 7，521，540,使用将Cyr61的氨基酸163至2 与GST融合的构建体通过免疫新西兰白色家兔来生成多克隆Cyr61特异性抗血清。发明概述本发明包括一种用于在哺乳动物细胞中重组表达哺乳动物细胞膜结合人CCNl或其CCNl域的方法，其特征在于用编码在C端与哺乳动物细胞跨膜域融合的CCNl或其CCNl 域OXNl融合蛋白)的核酸载体转化哺乳动物宿主细胞，在所述宿主细胞中表达所述CCNl 或CCNl域融合蛋白，并回收所述膜结合CCNl或所述其CCNl域。优选地，所述CCNl域是 CCNl的可变域。本发明进一步包括哺乳动物细胞膜结合CCNl或CCNl域用于生成针对CCNl的抗体的用途。膜结合ccm或ccm域可以作为免疫原使用和/或用于选择依照本发明的抗体。 优选地，所述CCNl域是CCNl的可变域。本发明进一步包括一种针对人CCNl的抗体，其特征在于特异性结合CCNl可变域的氨基酸210至228，并且特异性结合由在C端与PDGF-受体(人β型血小板衍生生长因子受体)的跨膜域融合的CCNl可变域组成的融合蛋白，所述融合蛋白在哺乳动物，优选地人细胞的表面上表达。此类细胞可以例如是哺乳动物肿瘤细胞系的细胞，如ΗΕΚ293或OTH 3Τ3。优选地，细胞是ΗΕΚ293。本发明包括一种特异性结合CCNl的抗体，其特征在于包含作为重链可变域的SEQ ID NO 1 的 CDR3 区。优选地，特异性结合CCNl的抗体的特征在于重链可变域包含SEQ IDNO 1的⑶R3 区和 SEQ ID NO 2 的 CDR2 区。优选地，特异性结合CCNl的抗体的特征在于重链可变域包含SEQ IDNO 1的⑶R3 区、SEQ ID NO 2 的 CDR2 区和 SEQ ID NO 3 的 CDRl 区。优选地，特异性结合CCNl的抗体的特征在于重链可变域包含SEQ IDNO 1的⑶R3区、SEQ ID NO 2的CDR2区和SEQ ID NO 3的CDRl区，以及特征在于轻链可变域包含SEQ ID NO 4 的 CDR3 区、SEQ ID NO 5 的 CDR2 区和 SEQ ID NO 6 的 CDRl 区。优选地，特异性结合CCm的抗体的特征在于重链可变域包含SEQ IDNO :7。优选地，抗体的特征在于重链可变域包含SEQ ID NO :7，而轻链可变域包含SEQ ID NO :8。重链可变域SEQ ID NO :7和轻链可变域SEQ ID NO :8是人λ同种型的。优选地，特异性结合CCNl的抗体的特征在于重链可变域是重链可变域SEQ ID NO 7的⑶R嫁接IgGl亚型形式，而轻链可变域是轻链可变域SEQ IDNO 8的⑶R嫁接λ同种型形式。优选地，抗体的特征在于结合单克隆抗体420 (SEQ ID NO :7和8)结合的相同CCNl表位。优选地，依照本发明的抗体的特征在于上文所提及的氨基酸序列或氨基酸序列片段和特性。优选地，依照本发明的抗体包含自人起源衍生的Fc部分。优选地，依照本发明的抗体是人IgGl或IgG4同种型的。下文序列表中提供了 IgGl和IgG4恒定链的例子。优选地，抗体是人IgGl类的。优选地，抗体是人源化的或者是人抗体。优选地，依照本发明的抗体以至少ΙΟΙ—1至KT1I1的亲和力特异性结合CCNl和膜结合CCNl可变区。依照本发明的抗体在10 μ g/ml时将EA-Hy-^6细胞与重组CCNl间的相互作用抑制超过50% (粘附测定法)。本发明进一步包括依照本发明的抗体用于治疗疾病，优选地肿瘤疾病的用途。本发明进一步包括依照本发明的抗体用于制造供治疗疾病，优选地肿瘤疾病用的药物的方法。本发明进一步包括一种用于制造供治疗疾病，优选地肿瘤疾病(尤其是乳腺癌、 原发性胶质瘤、胰腺癌、膀胱乳头状瘤、结肠腺癌、黑素瘤、髓母细胞瘤、儿科肿瘤、纤维肉瘤)用的药物的方法，其特征在于包含依照本发明的抗体。本发明进一步包括药物组合物，其包含依照本发明的抗体。本发明进一步包括依照本发明的抗体用于在疾病治疗中使用的用途。本发明进一步包括依照本发明的抗体用于在药物制造中使用的用途。发明详述术语“抗体”涵盖各种形式的抗体结构，包括但不限于全抗体和抗体片段。优选地，依照本发明的抗体是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、或别的遗传工程抗体，只要依照本发明的特征性特性得到保留。“抗体片段”包含全长抗体的一部分，优选地其可变域，或至少其抗原结合位点。抗体片段的例子包括双抗体、单链抗体分子、和自抗体片段形成的多特异性抗体。scFv 抗体例如记载于 Houston，J. S.，Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96。 另外，抗体片段包含如下的单链多肽，其具有Vh域的特征，即能够与\域一起装配，或结合 CCNl的\域的特征，即能够与Vh域一起装配成功能性抗原结合位点，并且由此提供依照本发明的抗体的特性。如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一氨基酸组成的抗体分子的制备物。术语“人源化抗体”指其中的框架和/或“互补决定区”(OTR)已经进行过修饰以包含与亲本免疫球蛋白相比不同物种的免疫球蛋白的⑶R的抗体。在一个优选的实施方案中，将小鼠CDR嫁接入人抗体的框架区中以制备“人源化抗体”。见例如 Riechmann，L.等，Nature 332 (1988) 323-327 ；及 Neuberger，Μ· S.等，Nature314(1985)268-270o如本文中所使用的，术语“CCN1域”就用于重组表达膜结合CCNl域的方法而言以及在所述膜结合ccm域用于生成针对CCNi的抗体的用途方面意指选自下组的ccm域胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)样基序(域I，IGF-BP，氨基酸沈-97)、冯维勒布兰德C 型域(域II，VWC，氨基酸98-164)、血小板反应蛋白I型域(域III，TSP，氨基酸228-273)、 和C端模块(域IV，CT,氨基酸观6-360)和可变域(Var，氨基酸165-227)。术语CCNl域就用于重组表达膜结合CCNl域的方法而言以及在所述膜结合CCNl域用于生成针对CCNl的抗体的用途方面还包括包含1至8个氨基酸的N端和/或C端删除的CCNl域片段。如本文中所使用的，术语“特异性结合CCN1”意指在细胞结合测定法中使用以每个细胞大于100. 000个分子CCNl的量重组表达其膜结合CCNl的细胞和经FITC标记的抗人 IgG抗体作为检测抗体通过FACS测量的抗体对人CCNl的结合。若抗体在10 μ g/ml的抗体浓度引起荧光与仅用检测抗体(抗人IgG抗体，经FITC标记的，相同浓度，10yg/ml)的背景染色相比升高至少10倍，则发现结合。如本文中所使用的，术语“特异性结合CCNl可变域”意指在细胞结合测定法中使用以每个细胞大于100. 000个分子可变域的量重组表达膜结合可变域的细胞和经FITC标记的抗人IgG抗体作为检测抗体通过FACS测量的抗体对人CCNl的可变域(Var，氨基酸 165-227)的结合。若抗体在10 μ g/ml的抗体浓度引起荧光与仅用检测抗体(抗人IgG抗体，经FITC标记的，相同浓度，10 μ g/ml)的背景染色相比升高至少8倍，则发现结合。通过以形态测定法测量阳性与阴性(对照，噪声信号)荧光样品间的区域交叠来量化FACS信号。一种有用的工具是来自MetaMorph成像软件的“测量共定位”算法 moleculardevices. com)。使用涵盖VAR域(163. aa至MO. aa)的合成肽通过ELISA来测定对CCNl的线性片段的结合。基于用交叠肽的测量，Mab420结合由人CCNl的氨基酸210至2 组成的CCNl 表位。依照本发明的CCNl抗体特异性结合膜结合CCNl可变域和CCNl的可变域上抗体Mab420结合的相同表位。通过FACS体外交叉阻断结合测定法测量的细胞结合测定法来测定本发明的CCNl抗体的表位结合特性，所述FACS体外交叉阻断结合测定法用于测定 Mab420抗体阻碍测试抗体结合膜结合CCNl或膜结合可变域的能力。对于此类测定法，将 Mab 420预先结合重组表达膜结合CCNl或膜结合CCNl可变域的细胞，随后添加测试抗体。 若对相同浓度(10 μ g/ml)的测试抗体的结合的抑制为至少15% (与相同浓度中但没有预先结合的Mab 420的情况中的测试抗体的结合相比)，则表位是“相同的”。如本文中所使用的，“依照本发明的抗体的可变域”(轻链可变域(\)，重链可变域(Vh))意为直接牵涉抗体结合抗原的轻链和重链域对之每种。轻链和重链可变域具有相同的一般结构，并且每个域包含通过三个“高变区”(或互补决定区，CDR)连接的四个框架 (FR)区，其序列是广泛保守的。框架区采用片层构象，而CDR可以形成连接β-片层结构的环。每条链中的⑶R通过框架区来保持其三维结构，并与来自另一条链的⑶R —起形成抗原结合位点。抗体的重链和轻链CDR3区在依照本发明的抗体的结合特异性/亲和力中发挥特别重要的作用，并且因此提供本发明的进一步的目的。术语“抗体的抗原结合部分”在本文中使用时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架”或“FR” 区是那些与本文中所定义的高变区残基不同的可变域区。因此，抗体的轻链和重链可变域包含自N至C端的域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、和FR4。特别地，重链的CDR3是最促成抗原结合，并限定抗体的特性的区。CDR和FR区依照Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)的标准定义和/或那些来自“高变环”的残基来确定。如本申请内所使用的，术语“氨基酸”意为天然存在的羧基α-氨基酸的组，其包括丙氨酸(三字母代码ala，单字母代码:A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，Ε)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，Μ)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，Τ)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸 (tyr、Y)、和缬氨酸(val、V)。如本文中所使用的，术语“核酸”或“核酸分子”意图包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链，但是优选的是双链DNA。在将核酸放入与另一核酸的功能关系中时，它是“可操作连接的”。例如，若前序列或分泌前导的DNA以参与多肽分泌的前蛋白表达，则它与多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响序列的转录，则它与编码序列可操作连接；或者若核糖体结合位点定位为使得便于翻译，则它与编码序列可操作连接。一般而言，“可操作连接的”意指所连接的DNA序列是共线的，并且在分泌前导的情况中，是连续的且在读码框中。然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制性位点处的连接来实现连接。若不存在此类位点，则依照常规的实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。如本文中所使用的，表述“细胞”、“细胞系”、和“细胞培养物”可互换使用，并且所有此类名称包括后代。如此，词语“转化体”和“经转化的细胞”包括原代主题细胞和自其衍生的培养物，而不考虑转移的数目。还应当理解，由于有意或无意的突变，所有后代在DNA内容上可能不是正好相同的。包括具有如在初始转化细胞中筛选的相同功能或生物学活性的变体后代。优选地，依照本发明的抗体的特征在于恒定链是人起源的。此类恒定链是现有技术中公知的，并且例如由 Kabat 等,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991) 描述。例如，有用的人轻链恒定区包含SEQ ID NO :9的λ -轻链恒定区的氨基酸序列。 例如，有用的人重链恒定区包含SEQ ID NO 10至13。本发明的进一步的实施方案是编码依照本发明的抗体的重链和轻链的核酸。本发明包括一种用于治疗需要治疗的患者的方法，其特征在于对患者施用治疗有效量的依照本发明的抗体。本发明包括依照本发明的抗体用于治疗的用途。本发明包括依照本发明的抗体用于制备供治疗肿瘤疾病用的药物的用途。本发明包括依照本发明的抗体用于治疗肿瘤疾病的用途。另外，依照本发明的抗体包括具有“保守序列修饰”(变体抗体)，即不影响或改变上文所提及的依照本发明的抗体的特征的核苷酸和氨基酸序列修饰的此类抗体。可以通过本领域中已知的标准技术，诸如定点诱变和PCR介导的诱变来引入修饰。保守氨基酸替代包括其中的氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替换的。本领域中已经限定了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、 酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。如此，优选地，人抗CCNl抗体中预测为非必需的氨基酸残基可以用来自同一侧链家族的另一氨基酸残基替换。因此，“变体”抗CCNl抗体在本文中指在氨基酸序列上与“亲本”抗CCNl抗体氨基酸序列在亲本抗体的一个或多个可变区中相差多至10，优选地约2至约5处添加、删除和/或替代的分子。可以基于分子建模通过诱变来实施氨基酸替代，如由Riechmarm，L.等，Nature 332 (1988) 323-327 及 Queen，C.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033 所描述的。就序列而言的同一性或同源性在本文中定义为在比对序列并引入缺口(若必要的话)以实现最大百分比序列同一性后候选序列中与亲本序列相同的氨基酸残基的百分比。对抗体序列的N端、C端、或内部延伸、删除、或插入无一应当解释为影响序列同一性或同源性。变体保留结合人CCNl的可变域的能力，并且优选地，具有优于亲本抗体的那些特性的特性。例如，变体在治疗过程中可以具有降低的副作用。例示性的“亲本”抗体包含抗体Mab420的⑶R区，并且优选地用于制备变体。优选地，亲本抗体具有人框架区，并且若存在的话，具有人抗体恒定域。例如，亲本抗体可以是人源化的或人的抗体。优选地，通过重组手段来生成依照本发明的抗体。此类方法是现有技术中普遍已知的，并且包括在原核和真核细胞中的蛋白质表达，随后分离抗体多肽，并且通常纯化至药学可接受的纯度。对于蛋白质表达，通过标准的方法来将编码轻链和重链或其片段的核酸插入表达载体中。在合适的原核或真核宿主细胞，诸如CHO细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、 HEK293细胞、COS细胞、酵母、或大肠杆菌细胞中实施表达，并自细胞(自上清液或在细胞裂解后)回收抗体。抗体的重组生成是现有技术中公知的，并且记载于例如下列综述文章 Makrides, S. C. , Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202 ；Geisse, S.等，Protein Expr. Purif. 8(1996) 271—282 ；Kaufman, R. J.，Mol. Biotechnol. 16(2000) 151 — 161 ；Werner, R. G. , Drug Res. 48 (199 870-880。抗体可以存在于全细胞中、在细胞溶胞物中、或者以部分纯化的、或基本上纯的形式存在。通过标准的技术，包括柱层析和本领域中公知的其它技术(参见 Ausubel, F.等编 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987))来实施纯化以消除其它细胞成分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白质。NSO细胞中的表达由例如Barnes，L.M.等， Cytotechnology 32(2000) 109-123 ；Barnes, L. Μ.等，Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270 描述。瞬时表达由例如Durocher，Y.等，Nucl.Acids. Res. 3(K2002)E9描述。可变域的克隆由 Orlandi, R.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(1989)3833-3837 ；Carter, P.等，Proc. Natl. Acad. ki. USA 89(1992)4285-4289 ；Norderhaug, L.等，J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87 描述。一种优选的瞬时表达系统(HEK 293)由 khlaeger， Ε. -J.和 Christensen, K.，于 Cytotechnology30 (1999) 71-83，及由 Schlaeger，E. -J.，于 J. Immunol. Methods 194(1996) 191-199描述。可以通过常规的免疫球蛋白纯化规程诸如例如蛋白A-kpharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析来自培养液适当地分离单克隆抗体。容易使用常规的规程将编码单克隆抗体的DNA和RNA分离并测序。杂交瘤细胞可以充当此类DNA和RNA的来源。一旦分离，可以将DNA插入表达载体中，然后将所述表达载体转染入在其它情况中不生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞诸如HEK 293细胞、CHO细胞、或骨髓瘤细胞中，以获得重组单克隆抗体在宿主细胞中的合成。自所述细胞系可获得的抗体是本发明的优选的实施方案。通过将合适的核苷酸变化引入抗体编码DNA中，或者通过肽合成来制备人CCm抗体的氨基酸序列变体。然而，此类修饰可以仅在非常有限的范围中实施，例如如上文所描述的。例如，修饰不改变上文所提及的抗体特征诸如IgG同种型和表位结合，但是可以改善重组生成的产率、蛋白质稳定性、或者便于纯化。还可以替换任何不牵涉维持抗CCNl抗体的正确构象的半胱氨酸残基，一般用丝氨酸进行，以改善分子的氧化稳定性，并且阻止异常交联。相反，可以对抗体添加半胱氨酸键以改善其稳定性(特别地在抗体是抗体片段诸如Fv 片段的情况中)。抗体的另一类氨基酸变体改变抗体的初始糖基化样式。“改变”意味着除去抗体中找到的一个或多个碳水化合物模块和/或添加一个或多个不存在于抗体中的糖基化位点。抗体的糖基化通常是N连接的。N连接的指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-χ-丝氨酸和天冬酰胺-χ-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是碳水化合物模块对天冬酰胺侧链的酶促附着的识别序列。如此，多肽中的这些三肽序列之任一种的存在创建潜在的糖基化位点。通过改变氨基酸序列，使得它含有一个或多个上文所描述的三肽序列(用于N连接的糖基化位点)来方便地实现对抗体添加糖基化位点。通过本领域中已知的多种方法来制备编码抗CCNl抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括但不限于自天然来源的分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情况中)或通过较早制备的变体或非变体型式的人源化抗CCNl抗体的寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变、和盒式诱变进行的制备。抗体的另一类共价修饰包括以美国专利No. 4，640，835 ；4, 496，689 ；4, 301，144 ； 4，670，417 ；4, 791，192 ；4, 179，337中所列的方式将抗体与多种非蛋白质性聚合物之一，例
如聚乙二醇、聚丙二醇、或聚氧化烯连接。将依照本发明的重链和轻链可变域与启动子、翻译起始、恒定区、3’非翻译区、多聚腺苷酸化、和转录终止的序列组合以形成表达载体构建体。可以将重链和轻链表达构建体组合成单一载体，共转染、连续转染、或者分开转染入宿主细胞中，然后将所述宿主细胞融合以形成表达这两条链的单一宿主细胞。在另一方面，本发明提供了含有与药学可接受载体一起配制的本发明的一种单克隆抗体或单克隆抗体的组合，或其抗原结合部分的组合物，例如药物组合物。如本文中所使用的，“药学可接受载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂层材料、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收/再吸收延迟剂，等等。优选地，载体适合于注射或输注。可以通过本领域中已知的多种方法来施用本发明的组合物。如熟练技术人员会领会的，施用的路径和/或模式会随期望的结果而变化。药学可接受载体包括无菌水溶液或分散体和供制备无菌可注射溶液或分散体用的无菌粉剂。对药学活性物质使用此类介质和药剂是本领域中已知的。在水外，例如，载体可以是等张缓冲盐水溶液。不管选定的施用路径。通过本领域技术人员已知的常规方法来将本发明的化合物(其可以以合适的水合形式使用)和/或本发明的药物组合物配制成药学可接受剂量形式。可以改变活性成分在本发明的药物组合物中的实际剂量水平，从而获得对于实现特定患者的期望的治疗响应、组成、和施用模式有效的，而对患者无毒的活性成分量(有效量)。选定的剂量水平会取决于多种药动学因素， 包括所采用的本发明的特定组合物的活性、施用路径、施用时间、所采用的特定化合物的排泄速率、与所采用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、重量、状况、一般健康和先前的医学史等医学领域公知的因素。本发明包括依照本发明的抗体用于治疗患有肿瘤的患者的用途。本发明进一步提供了一种用于制造包含与药学可接受载体一起的有效量的依照本发明的抗体的药物组合物的方法及依照本发明的抗体对于此类方法的用途。本发明进一步提供了有效量的依照本发明的抗体优选地与药学可接受载体一起用于制造药物剂的用途，所述药物剂用于治疗患有癌症，如乳腺癌、原发性胶质瘤、膀胱乳头状瘤、结肠腺癌、黑素瘤、髓母细胞瘤、儿科肿瘤、纤维肉瘤、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌的患者。本发明还提供了有效量的依照本发明的抗体优选地与药学可接受载体一起用于制造药物剂的用途，所述药物剂用于治疗患有肿瘤的患者。提供了以下实施例和序列表以帮助理解本发明，其真正的范围在所附权利要求书中列出。应当理解，可以在不背离本发明精神的前提下在所列的规程上做出修饰。序列表的描述SEQ ID NO 1 重链 CDR3Mab420SEQ ID NO 2 重链 CDR2Mab420SEQ ID NO 3 重链 CDRlMab420SEQ ID NO 4 轻链 CDR3Mab420SEQ ID NO 5 轻链 CDR2Mab420SEQ ID NO 6 轻链 CDRlMab420SEQ ID NO :7 可变重链 Mab420SEQ ID NO :8 可变轻链 Mab420SEQ ID NO :9 人 λ 轻链SEQ ID NO 10 A Y 1(同种异型 Glml，17)恒定区SEQ ID NO 11 人 γ 1(同种异型 Glml7)恒定区SEQ ID NO :12 人 IgG4SEQ ID NO :13 人 IgG4SPLE_ 突变体实施例1免疫a)用人突变体CCNl免疫小鼠通过腹膜内注射用50μ g含有单一氨基酸替换E173D或F185L的重组人CCm在第 0天与完全弗氏佐剂一起，第28天和第56天(两者都与不完全弗氏佐剂一起)及用50 μ g 重组蛋白在第84天与不完全弗氏佐剂一起免疫Balb/c和NMRI小鼠。在第91天和第108 天采集血液，并制备血清，其用于通过ELISA(见下文)进行滴度测定。选择具有最高滴度的动物以在第112天通过静脉内注射50 μ g重组人CCNl来加强。
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b)用人突变体CCNl免疫NZW家兔用100 μ g含有单一氨基酸替换E173D或F185L的重组人CCNl在第0天与完全弗氏佐剂一起及用100 μ g蛋白质在第21天、第43天、第65天和第85天与不完全弗氏佐剂一起免疫新西兰白色家兔。所有免疫在数个部位皮下完成。在第77天和第98天制备血清以进行滴度测定。通过静脉内注射IOOyg重组蛋白来完成最终的加强。杂交瘤生成和筛选遵循标准的规程通过将小鼠或家兔脾细胞与小鼠P3)(63-Ag8653骨髓瘤细胞或 M0E-W2家兔浆细胞瘤细胞融合来生成杂交瘤。通过ELISA (见下文)来对杂交瘤筛选对含有单一氨基酸替换E173D或F185L的人重组CCNl或小鼠重组CCNl的结合。在域结合测定法中及在用两种来自可变域的肽进行的肽ELISA中进一步表征CCNl结合抗体(表1)。表1
权利要求
1.用于在哺乳动物细胞中重组表达哺乳动物细胞膜结合人CCNl或其CCNl域的方法， 其特征在于用编码在C端与哺乳动物细胞跨膜域融合的CCNl或其CCNl域(CCN1融合蛋白)的核酸载体转化哺乳动物宿主细胞，在所述宿主细胞中表达所述CCNl或CCNl域融合蛋白，并回收所述膜结合CCNl或所述其CCNl域。
2.依照权利要求1的方法，其特征在于所述CCNl域是CCNl的可变域。
3.哺乳动物细胞膜结合人CCNl或CCNl域用于生成针对人CCNl的抗体的用途。
4.依照权利要求3的用途，其特征在于所述CCNl域是CCNl的可变域。
5.依照权利要求3或4的用途，其特征在于用哺乳动物细胞膜结合CCNl或CCNl域免疫非人动物，并回收针对所述CCNl或针对所述CCNl域的抗体。
6.针对人CCNl的抗体，其特征在于特异性结合CCm可变域的氨基酸210至228，并且特异性结合由在C端与PDGF-受体(人β型血小板衍生生长因子受体)的跨膜域融合的 CCNl可变域组成的融合蛋白，所述融合蛋白在人细胞的表面上表达。
7.针对人CCNl的抗体，其特征在于包含作为重链⑶R区的SEQID NO 1的⑶R3区、 SEQ ID NO 2的CDR2区和SEQ ID NO 3的CDRl区，及特征在于SEQ ID NO 4的轻链可变域 CDR3 区、SEQ ID NO 5 的 CDR2 区和 SEQ ID NO 6 的 CDRl 区。
8.依照权利要求7的抗体，其特征在于重链可变域包含SEQID NO :7。
9.依照权利要求7的抗体，其特征在于轻链可变域包含SEQID NO :8。
10.针对CCm的抗体，其特征在于结合单克隆抗体420(SEQ ID NO :7和8)结合的相同ccm表位。
11.依照权利要求6至10中任一项的针对人CCNl的抗体用于治疗疾病的用途。
12.依照权利要求11的用途，其中所述疾病是肿瘤疾病。
13.依照权利要求6至11中任一项的针对人CCNl的抗体用于制造药物的用途。
14.用于制造供治疗疾病用的药物的方法，其特征在于包含依照权利要求6至11中任一项的针对人CCNl的抗体。
15.一种药物组合物，其包含权利要求6至10中任一项的抗体。
16.依照权利要求6至10中任一项的针对人CCNl的抗体，其用于在疾病治疗中使用。
17.依照权利要求16的抗体，其特征在于所述疾病是肿瘤疾病。
18.依照权利要求6至10中任一项的针对人CCNl的抗体，其用于在药物制造中使用。
全文摘要
用于在哺乳动物细胞中重组表达哺乳动物细胞膜结合人CCN1或其CCN1域的方法，其特征在于用编码在C端与哺乳动物细胞跨膜域融合的CCN1或其CCN1域(CCN1融合蛋白)的载体转化哺乳动物宿主细胞，在所述宿主细胞中表达所述CCN1或CCN1域融合蛋白，并回收所述膜结合CCN1或所述其CCN1域。以及此类膜结合CCN1和域用于生成抗体的用途。针对人CCN1的抗体可用于治疗疾病。
文档编号C07K16/18GK102414219SQ201080019442
公开日2012年4月11日 申请日期2010年6月2日 优先权日2009年6月4日
发明者D.庞赛尔, E.托克索兹, H.诺特金, H-W.克雷尔, J.尼沃纳, S.米勒 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司