专利名称：使用固相和液相组合技术的促胰岛素肽合成的制作方法
使用固相和液相组合技术的促胰岛素肽合成本发明涉及利用固相和液相方法制备促胰岛素肽、特别是胰高血糖素样肽-I(GLP-I)及其负体的方法。本发明还涉及可以用在这些方法中的中间体肽片段。在文献中描述了很多肽合成方法(例如，参见美国专利号6，015，881 ；Mergler 等· (1988)四面体通讯(Tetrahedron Letters) 29 :4005-4008 ；Mergler 等· (1988)四面体通讯CTetrahedron Letters)四4009-4012 ;Kamber等.(编)，肽、化学和生物学 (Peptides, Chemistry and Biology), ESCOM, Leiden (1992) 525-526 ；Riniker 等· (1993) 四面体通讯(Tetrahedron Letters)49 :9307-9320 ；Lloyd-Williams 等.(1993)四面体通讯(Tetrahedron Letters)49 11065-11133 ；和 Andersson 等· (2000)生物聚合物 (Biopolymers) 55 =227-250)。许多合成方法以所述合成在其中发生的相的物理状态(即液相或固相)进行区分。在固相肽合成(SPPS)中，将氨基酸或肽基团结合到固体支持物树脂上。然后，将连续的氨基酸或肽基团附着到结合在支持物上的肽上，直到形成目的肽物质。然后结合在支持物上的肽典型地被从所述支持物上裂解，并且进行进一步的加工和/或纯化。在一些情形中，固相合成产生成熟的肽产物；在另一些情形中，从所述支持物上裂解下的肽(即， “肽中间体片段”)用于制备更大的、成熟的肽产物。由固相方法生成的肽中间体片段可以在固相或在液相合成过程(本文叫作“液相合成”)中偶联在一起。液相合成可以特别有效地用于通过固相合成有用的成熟肽是不可能的或不实际的情形中。例如，在固相合成中，更长的肽尽管仍然附着在固体支持物上，但是最终可能采取不规则的构象，使得很难将其它的氨基酸或肽物质添加到延长的链上。由于肽链在支持物树脂上变得更长，加工步骤诸如偶联和去保护的效率可能受到损害。除了起始材料如活化的氨基酸、辅助试剂和溶剂的增加的损失之外，这又可能导致更长的加工时间来弥补这些问题。这些问题可能随着肽长度的增加而增加。因此，仅利用固相方法，发现以单一片段合成长度大于30个氨基酸的成熟的肽相对是不常见的。相反，可以在固相上分开合成个体片段，然后在固相和/或液相中偶联，以构建需要的肽产物。这种方法需要仔细选择片段候选物。尽管一些通用原理可以指导片段选择，但是通常非常需要凭经验检测片段候选物。在一种情形中作用的片段策略可能在其它情形中不起作用。甚至在不包括合理的片段候选物时，对于合成策略仍然可能需要加工创新，以在商业合理条件下起作用。因此，利用杂合方案的肽合成通常是具有挑战性的，并且在许多情形中，在进行实际合成之前很难预测在合成方案中固有什么样的问题。在液相偶联中，两种肽中间体片段、或肽中间体片段和活性氨基酸在适当的溶剂中偶联，通常在促进偶联反应的效率和质量的其它试剂的存在下进行偶联。所述肽中间体片段是反应性排列的，因此一个片段的N端偶联到另一个片段的C端，或者反之亦然。另外，在液相偶联过程中，在固相合成过程中存在的侧链保护基通常保留在所述片段上，以确保所述片段末端的特异性反应性。这些侧链保护基典型地直到形成成熟的肽之后才去除。在综合合成方案中的一个步骤或多个步骤中的适度改进可以汇集成制备成熟的肽中的显著的改进。这样的改进可以导致时间和试剂的更大、全面的节约，并且还可以显著
10提高终产物的纯度和产量。尽管关于在杂合合成中的改进的重要性的讨论适用于利用这些方法生产的任何种类的肽，但是在治疗有用性的肽和以商业医药用途规模制造的肽的情形中特别重要。合成更大的生物分子药物，诸如治疗性肽，可能是非常昂贵的。由于试剂的成本、合成时间、许多合成步骤，连同其它因素，在这些更大的生物分子药剂的合成过程中的很小的改进可能对于生产这样的药剂是否甚至是经济可行的具有显著影响。这样的改进是必需的，原因在于对于更大的生物分子药剂的这些高生产成本，这是得到这样的事实的支持的，即，在许多情形中，对于这些类型的更大的生物分子药剂，存在很少(如果有一些的话)适当的治疗性备选物。这在胰高血糖素样肽-I(GLP-I)及其负体的情形中可以清楚的看出。这些肽已经作为可能的治疗剂参与治疗2型非胰岛素依赖型糖尿病(type 2 non-insulin-dependent diabetes mellitus)以及相关的代谢病症，诸如肥胖症(obesity)。Gutniak，Μ. K.，等，糖尿病护理(Diabetes Care) 1994 :17 :1039_44。Lopez等确定天然的GLP-I长度是37个氨基酸残基。Lopez，L. C.，等，美国国家科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sci. USA.)，80 :5485-5489 (1983)。这一确定得到 Uttenthal, L. 0.，等，临床内分泌学和代谢学杂志(J. Clin. Endocrinal. Metabol.)，61 472-479(1985)的工作的证实。天然GLP-I可以由符号GLP-I (1_37)表示。这一符号表示所述肽具有从1 (N端)到37 (C端)的全部氨基酸。天然的GLP-I (1-37)具有SEQ ID NO. 1 所述的氨基酸序列 HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGRG已经报道天然GLP-I (1-37)通常不能调控胰岛素的生物合成，但是该肽的生物学重要的片段确实具有促胰岛素特征。例如，SEQ ID N0. 2所述的长度为31个氨基酸的天然肽 GLP-I (7-37)HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGRG是促胰岛素的，并且具有天然GLP-I的7(N_端)_37(C_端)的氨基酸。 GLP-I (7-37)具有末端甘氨酸。当这个甘氨酸不存在时，得到的肽仍然是促胰岛素活性的， 并且叫作 GLP-I (7-36)，其为 SEQ ID N0. 3 HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGRGLP-I (7-36)通常以C端精氨酸为酰胺化形式存在，并且这种形式可以由符号 GLP-I (7-36)-NH2 表示。SEQ ID NO. 1_3所述的天然GLP-I (1-37)及其天然的、促胰岛素活性的负体是代谢不稳定的，在体内仅具有1-2分钟的血浆半衰期。外源施用的GLP-I也是快速降解的。这种代谢不稳定性已经限制了天然GLP-I及其天然片段的治疗性潜力。已经开发了具有提高的稳定性的GLP-I肽的合成负体。例如，在EP1137667B1中描述了 SEQ ID N0. 4的肽HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKAibR除了在位置8和35出现α-氨基异丁酸(示意性表示为缩写Aib)的非手性残基取代在这些位置的相对应的天然氨基酸之外，该肽与天然GLP-I (7-36)相似。非手性α-氨基异丁酸还叫作甲基丙氨酸。该肽可以表示为式(Aib8’35)GLP-I (7-36)或酰胺化形式(Aib8’35) glp-i-(7-36)-nh2。ep 1137667b1陈述seq id no. 4的肽及其负体可以利用固相技术构建为单一片段。由ep 1137667b1提出的单一片段合成方法是有问题的。如上述，为了能够以商业接受的产量、纯度和数量制造该肽及其负体，需要用于合成seq id no. 4的肽的改进的策略。本申请涉及利用固相和液相(“杂合”)方法合成的促胰岛素肽的制备。在一种方法中，所述方法包括利用固相化学原理合成三个不同的肽中间体片段。然后，利用液相化学原理将额外的氨基酸物质添加到一个片段上。然后，将所述片段在液相中偶联在一起。本发明非常有效地用于制成促胰岛素肽如glp-1、glp-i (7-36)以及这些的天然的和非天然的负体，特别是glp-i (7-36)以及它的天然的和非天然的负体。特别地，本申请提供制备去保护的促胰岛素肽的方法，所述去保护的促胰岛素肽包含氨基酸序列(seq id no. 9)z-hx8egtftsdvssylegqaakefiawlvkx35r-nh2其中z 是 h-;并且X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基，所述方法选自下述的方法。本申请提供制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤a)提供第一肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO. 5)Z-QAAKEFIAffLVKX35R-NH2其中z 是 h-；X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；b)提供第二肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO. 6)z-syleg其中z是n-端保护基；和所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；c)在溶液中将第一肽片段与第二肽片段偶联，以提供第三肽片段，所述第三肽片段包含氨基酸序列(seq id n0. 7)Z-SYLEGQAAKEFIAffLVKX35R-NH2其中z是n-端保护基；X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；d)去除第三肽片段的N-端保护基，以提供第四肽片段，所述第四肽片段包含氨基酸序列(seq id n0. 7)Z-SYLEGQAAKEFIAffLVKX35R-NH2其中
z 是 h-；x35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；e)提供第五肽片段，所述第五肽片段包含氨基酸序列(SEQ ID NO. 8)z-hx8egtftsdvs-b，其中x8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；z是n-端保护基；b，是-0h;并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；并且f)在溶液中将第五肽片段与第四肽片段偶联，以提供促胰岛素肽，所述促胰岛素肽包含氨基酸序列(seq id no. 9)z-hx8egtftsdvssylegqaakefiawlvkx35r-nh2其中z是n-端保护基；x8和x35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。本申请提供上述方法，所述方法进一步包括下述步骤g)将由步骤f)产生的促胰岛素肽的N-端保护基去除，以提供包含下述氨基酸序列(seq id no. 9)的促胰岛素肽z-hx8ex10tftsdvssylegqaakefiawlvkx35r-nh2其中z 是 h-；x8和x35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；并且h)将由步骤g)产生的促胰岛素肽与酸接触，从而使氨基酸侧链去保护，以提供包含下述氨基酸序列(seq id no. 9)的去保护的促胰岛素肽z-hx8egtftsdvssylegqaakefiawlvkx35r-nh2其中z 是 h-;并且x8和x35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基。本申请提供上述方法，其中由步骤h)产生的所述去保护的促胰岛素肽具有氨基酸序列(SEQ. ID No. 4)HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKAibR本申请还提供制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤a)提供第一肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO. 8)z-hx8egtftsdvs-b，其中x8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；
z是n-端保护基；b，是-0h;并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；b)提供第二肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO. 6)z-syleg-b，其中b’是固相树脂；z 是 h-;并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；c)将第一肽片段与第二肽片段偶联，以提供第三肽片段，所述第三肽片段包含氨基酸序列(seq id no. 11)z-hx8egtftsdvssyleg-b，其中b’是固相树脂；z是n-端保护基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；d)将第三肽片段从所述固相树脂上取下，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO. 11)的第四肽片段z-hx8egtftsdvssyleg-b，其中b，是-0h;z是n-端保护基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；e)提供第五肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO. 5)Z-QAAKEFIAffLVKX35R-NH2其中z 是 h-;x35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；f)在溶液中将第四肽片段与第五肽片段偶联，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ id no. 9)的促胰岛素肽z-hx8egtftsdvssylegqaakefiawlvkx35r-nh2其中z是n-端保护基；x8和x35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。本申请提供上述方法，所述方法进一步包括下述步骤g)将由步骤f)产生的促胰岛素肽的N-端保护基去除，以提供包含下述氨基酸序列(seq id n0. 9)的促胰岛素肽
z-hx8egtftsdvssylegqaakefiawlvkx35r-nh2其中z 是 h-;x8和x35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；并且h)将由步骤g)产生的促胰岛素肽与酸接触，从而使氨基酸侧链去保护，以提供包含下述氨基酸序列(seq id no. 9)的去保护的促胰岛素肽z-hx8egtftsdvssylegqaakefiawlvkx35r-nh2其中z 是 h-;并且x8和x35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基。本申请提供上述方法，其中所述去保护的促胰岛素肽具有氨基酸序列(seq. id No. 4)HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKAibR-NH2本申请还提供制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤a)提供第一肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO. 12)z-sylegqaake-b，其中z 是 h-;并且B’是固相树脂；b)提供第二肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO. 8)z-hx8egtftsdvs-b，其中χ8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；z是n-端保护基；b’ 是-0h;并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；c)将第二肽片段与第一肽片段偶联，以提供第三肽片段，所述第三肽片段包含氨基酸序列(seq id no. 13)z-hx8egtftsdvssylegqaake-b，其中z是n-端保护基；B’是固相树脂；x8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。本申请提供上述方法，所述方法进一步包括下述步骤d)将第三肽片段从所述固相树脂上取下，以提供包含下述氨基酸序列(seq id NO. 13)的第四肽片段z-hx8egtftsdvssylegqaake-b，
其中z 是 h-;b，是-0h;x8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；并且e)提供第五肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO. 14)Z-FIAffLVKX35R-NH2其中x35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；f)在溶液中将第四肽片段与第五肽片段偶联，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ id no. 9)的促胰岛素肽z-hx8egtftsdvssylegqaakefiawlvkx35r-nh2其中Z是N-端保护基；X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；g)将由步骤f)产生的促胰岛素肽的N-端保护基去除，以提供包含下述氨基酸序列(seq id no. 9)的促胰岛素肽z-hx8egtftsdvssylegqaakefiawlvkx35r-nh2其中z 是 h-；x8和x35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；并且h)将由步骤g)产生的促胰岛素肽与酸接触，从而使氨基酸侧链去保护，以提供包含下述氨基酸序列(seq id no. 9)的去保护的促胰岛素肽z-hx8egtftsdvssylegqaakefiawlvkx35r-nh2其中z 是 h-;并且x8和x35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基。本申请提供上述方法，其中所述去保护的促胰岛素肽具有氨基酸序列(seq. id No. 4)HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKAibR-NH2本申请还提供制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤a)提供第一肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO. 14)Z-FIAffLVKX35R-NH2其中z 是 h-;X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
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所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；b)提供第二肽片段，其包含氨基酸序列(seq ID no. 12)z-sylegqaake-b，其中z是n-端保护基；b’ 是-0h;并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；并且c)在溶液中将第一肽片段与第二肽片段偶联，以提供第三肽片段，所述第三肽片段包含氨基酸序列(seq. id no. 7)Z-SYLEGQAAKEFIAffLVKX35R-NH2其中Z是N-端保护基；x35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。本申请提供上述方法，所述方法进一步包括下述步骤d)将第三肽片段的n-端保护基去除，以提供包含下述氨基酸序列(seq. id no. 7) 的第四肽片段Z-SYLEGQAAKEFIAffLVKX35R-NH2其中z 是 h-；x35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；e)提供第五肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO. 8)z-hx8egtftsdvs-b，其中x8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；z是n-端保护基；b’ 是-0h;并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；f)在溶液中将第五肽片段与第四肽片段偶联，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO. 9)的促胰岛素肽z-hx8egtftsdvssylegqaakefiawlvkx35r-nh2其中Z是N-端保护基；并且x8和x35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；g)将由步骤f)产生的促胰岛素肽的N-端保护基去除，以提供包含下述氨基酸序列(seq id n0. 9)的促胰岛素肽z-hx8egtftsdvssylegqaakefiawlvkx35r-nh2其中
z 是 h-；X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；并且h)将由步骤h)产生的促胰岛素肽与酸接触，从而使氨基酸侧链去保护，以提供包含下述氨基酸序列(seq id no. 9)的去保护的促胰岛素肽z-hx8egtftsdvssylegqaakefiawlvkx35r-nh2其中z 是 h-;并且x8和x35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基。本申请提供上述方法，其中所述去保护的促胰岛素肽具有氨基酸序列(seq. id No. 4)HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKAibR-NH2本申请提供一种肽，其氨基酸序列为(seq id no. 5)Z-QAAKEFIAffLVKX35R-NH2其中z是h-或n-端保护基；X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。本申请提供一种肽，其氨基酸序列为(SEQ ID NO. 7)Z-SYLEGQAAKEFIAffLVKX35R-NH2其中z是h-或n-端保护基；x35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。本申请提供一种肽，其氨基酸序列为(seq id no. 8)z-hx8egtftsdvs-b，其中x8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；z是h-或n-端保护基；b’是-oh或固相树脂；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。本申请提供一种肽，其氨基酸序列为(seq id no. 11)z-hx8egtftsdvssyleg-b，其中b，是-oh或固相树脂；z是h-或n-端保护基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。本申请提供一种肽，其氨基酸序列为(seq id n0. 12)z-sylegqaake-b，
其中Z是H-或N-端保护基；并且B，是-OH或固相树脂。本申请提供一种肽，其氨基酸序列为(SEQ ID NO. 13)Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKE-B，其中Z是H-或N-端保护基；B，是-OH或固相树脂；X8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且
所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。本申请提供一种肽，其氨基酸序列为(SEQ. ID NO. 7)Z-SYLEGQAAKEFIAffLVKX35R-NH2其中Z是H-或N-端保护基；X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。本申请提供一种肽，其氨基酸序列为(SEQ. ID NO. 14)Z-FIAffLVKX35R-NH2其中Z是H-或N-端保护基；X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。本申请还提供上述肽的任一种，其中Z是Fmoc。“N-端保护基”意指选自由下列各项组成的组的基团Bz (苯甲酰基)，Ac(乙酰基)，Trt (三苯甲基)Boc (叔丁氧基羰基)，CBz (苄氧基羰基或Z)，Dts(dithiasuccinoyl), Rdtc (R =烷基或芳基，dtc = 二硫代氨基甲酸盐)， DBFmoc (2，7- 二叔丁基Fmoc或1，7- 二叔丁基芴_9_基甲氧基羰基)，Alloc (烯丙氧基羰基)，PNZ(对硝基苄氧基羰基)，Nsc([[2-[(4-硝基苯基)磺酰基]-乙氧基]羰基])， Msc (2-甲基磺酰基乙氧基羰基)，MBz (4-甲氧基CBz)，Poc (2-苯基丙基( -氧基羰基)， Βροο[(1-[1,Γ -联苯基]-4-基-1-甲基乙氧基)羰基]，&ipeOC[[2，2-双(4-硝基苯基)-乙氧基]羰基]，CBz[(苯基甲氧基)羰基]，Aoc[(l，l-二甲基丙氧基)羰基]，和 Moz [ [ (4-甲氧基苯基)甲氧基]羰基]。优选的N-端保护基为Fmoc，Bpoc, Trt, Poc和 Boc ο在一个方面，上述任一种方法可以利用选自由下列各项组成的组的N-端组氨酸保护基(N-端保护基)FmoC(9-芴基甲氧基羰基)，Boc(叔丁氧基羰基)，CBz(苄氧基羰基或Z)，Dts(dithiasuccinoyl), Rdtc (R =烷基或芳基，dtc = 二硫代氨基甲酸盐)，DBFmoc (2，7-二叔丁基Fmoc或1，7-二叔丁基芴-9-基甲氧基羰基)，Alloc (烯丙氧基羰基)，PNZ(对硝基苄氧基羰基)，Nsc([[2-[(4-硝基苯基)磺酰基]乙氧基]羰基])，Msc(2-甲基磺酰基乙氧基羰基)，MBz(4-甲氧基CBz)，Βροο[(1-[1,Γ -联苯基]-4-基-1-甲基乙氧基)羰基]，&ipeOC[[2，2-双(4-硝基苯基)乙氧基]-羰基]， CBz [(苯基甲氧基)羰基]，Aoc [(1,1- 二甲基丙氧基)羰基]，和Moz [ [ (4-甲氧基苯基) 甲氧基]羰基]，其中如果可以使用酸在完全侧链去保护步骤中去除N-端组氨酸保护基，则不需要先去除N-端组氨酸保护基。“非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基”是这样的氨基酸，其可以衍生自天然的非手性甘氨酸或另外的非手性氨基酸。优选地，所述非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基选自由下列各项组成的组甘氨酸(G)、2-甲基丙氨酸(Aib)和2-苯甲基-苯丙氨酸。最优选地，所述非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基选自G或Aib。本发明针对利用固相和/或液相技术制备肽如胰高血糖素样肽-1 (GLP-I)以及它的天然和非天然的促胰岛素活性负体的合成方法。本发明的肽分子可以是被保护的、未被保护的、或部分保护的。保护可以包括N端保护，侧链保护，和/或C端保护。尽管本发明通常针对这些胰高血糖素样肽、它们的负体、片段以及它们的负体、和融合产物以及它们的这些的负体的合成，但是本发明的创造性教导还可以适用于合成其它肽，特别是利用固相和液相方法的组合合成的那些。本发明还适用于合成与杂质特别是与焦谷氨酸杂质缔合的肽中间体片段。用于实施本发明的优选的GLP-I分子包括天然的和非天然的GLP-I (7-36) 以及它们的负体。当用于本文时，术语“包含氨基酸序列”优选地意指“具有氨基酸序列”。当用于本文时，“负体”是指肽的天然的和非天然的类似物、衍生物、融合化合物、 盐等。当用于本文时，肽类似物通常是指相对于另一种肽或肽负体具有修饰的氨基酸序列的肽，诸如通过一个或多个氨基酸取代、缺失、翻转、和/或添加而进行的修饰。取代可以包括一个或多个天然的或非天然的氨基酸。取代优选地可以是保守的或高度保守的。保守取代是指用通常具有相同的净电荷和通常相同的大小和形状的另一种氨基酸取代氨基酸。例如，当在它们的侧链中的碳和杂原子总数的差别不多于约4个时，具有脂肪族或取代的脂肪族氨基酸侧链的氨基酸具有近似相同的大小。当在它们侧链中的分支数目的差别不多于约一个或两个时，它们具有近似相同的形状。认为在它们的侧链中具有苯基或取代的苯基的氨基酸具有大约相同的大小和形状。以下列出的是5组氨基酸。用同一组的另一种氨基酸取代化合物中的氨基酸通常导致保守取代。组I 甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，甲硫氨酸，和具有C1-C4脂肪族或C1-C4羟基取代的脂肪族侧链的(直链或单分支的)非天然存在的氨基酸。组II 谷氨酸，天冬氨酸和具有羧酸取代WC1-C4脂肪族侧链的(无分支或一个分支点的)非天然存在的氨基酸。组III 赖氨酸，鸟氨酸，精氨酸和具有胺或胍取代的C1-C4脂肪族侧链的(无分支的或一个分支点的)非天然存在的氨基酸。组IV 谷氨酰胺，天冬酰胺，和具有酰胺取代的C1-C4脂肪族侧链的(无分支的或一个分支点的)非天然存在的氨基酸。组V 苯丙氨酸，苯基甘氨酸，酪氨酸和色氨酸。当用于本文时，术语“负体”更优选地是指肽的盐，或指它的在C端酰胺化的衍生物。
“高度保守的取代”是用在侧链上具有相同的官能团并且大小和形状几乎相同的另一种氨基酸取代氨基酸。当在它们侧链中的碳和杂原子的总数的差别不多于2个时，具有脂肪族或取代的脂肪族氨基酸侧链的氨基酸具有几乎相同的大小。当它们在它们的侧链中具有相同数目的分支时，它们具有几乎相同的形状。高度保守的取代的实例包括缬氨酸取代亮氨酸，苏氨酸取代丝氨酸，天冬氨酸取代谷氨酸，和苯基甘氨酸取代苯丙氨酸。“肽衍生物”通常是指具有其侧链基团、α碳原子、末端氨基、和/或末端羧酸基中的一个或多个的化学修饰的肽、肽类似物、或其它肽负体。例如，化学修饰包括，但不限于， 添加化学结构部分，生成新的键，和/或去除化学结构部分。在氨基酸侧链基团的修饰包括，但不限于，赖氨酸e_氨基的酰化，精氨酸、组氨酸或赖氨酸的N-烷基化，谷氨酸或天冬氨酸羧酸基团的烷基化，和谷氨酰胺或天冬酰胺的脱酰胺化。末端氨基的修饰包括，但不限于，脱氨基，N-低级烷基、N-二-低级烷基、和N-酰基(例如，-CO-低级烷基)修饰。末端羧基的修饰包括，但不限于，酰胺、低级烷基酰胺、二烷基酰胺、和低级烷基酯修饰。因此，部分或完全保护的肽组成了肽衍生物。在本发明的实施中，如果化合物能够刺激、或引起刺激、或辅助引起刺激激素胰岛素的合成或表达，那么该化合物具有“促胰岛素”活性。在优选的实施方式中，促胰岛素活性可以依据在美国专利号6，887，849和6，703，365中所述的测定证明。在优选的实施方案中，本发明提供用于合成合成的(X8，X35)GLP-I (7-36)肽及其负体的方法，所述(X8，X35)GLP-I (7-36)肽具有下式(SEQ. ID NO. 9)hx8egtftsdvssylegqaakefiawlvkx35r-nh2其中在位置8和35的符号X的每个独立地表示非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基。X8和/或X35残基中的任一个任选地可以包含侧链保护基。依据该式所述的肽与天然GLP-I (7-36)不同，不同至少在于，所述非手性的、任选地是空间位阻的X8和X35残基取代在位置8和35的天然氨基酸残基。非手性X8和X35氨基酸的应用不但帮助稳定得到的肽，而且现在还发现使用这些氨基酸作为结构单元的接头还有利于如在方案1所示和在下文进一步描述的本发明的合成途径。可以按照本发明的原理合成的(X8，X35)GLP-I (7-36)肽的特别优选的实施方案包括依据式(SEQ. ID NO. 4)HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKAibR-NH2所述的肽及其负体，其优选地在C端酰胺化(如所示)。该肽使用非手性α -氨基异丁酸残基(示意性表示为缩写Aib)作为X8和X35，优选地在C端具有酰胺，在位置10使用天然G残基，并且可以指定为式(Aib8’35)GLP-l(7-36)-NH2。这种符号表示与氨基酸“Aib” 相对应的氨基酸残基出现在位置8和35，取代天然的丙氨酸。非手性α-氨基异丁酸也叫作甲基丙氨酸。SEQ ID NO. 4的肽在EP 1137667B1中描述。在位置8和35存在Aib残基减缓了在体内的代谢降解，使得该肽在体内比天然GLP-I (7-36)肽更稳定得多。本发明提供用于制备GLP-I (7-36)肽如(Aib8’35) GLP-I (7_36)-NH2的改进的方法。 例如，方案1和方案2显示用于合成GLP-I (7-36)肽以及它们的负体的示例性方案。据信方案1和方案2特别适用于GLP-I (7-36)肽的按比例增加合成。典型地进行按比例增加的步骤，以提供用于商业销售数量的肽。例如，在按比例增加步骤中的肽的量可以是500g或 Ikg/批次，并且更典型地数十千克至数百千克/批次或更多。在优选实施方案中，所述创造性方法可以提供这样的改进减少加工(合成)时间，提高产物产量，提高产物纯度，和或减少需要的试剂和起始原料的量。在方案1所示的合成利用固相和液相技术的组合来制备肽产物。
权利要求
1.制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤a)提供第一肽片段，其包含氨基酸序列(seqID NO. 5) Z-QAAKEFIAffLVKX35R-NH2其中 z 是 h-；X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；b)提供第二肽片段，其包含氨基酸序列(SEQID NO. 6) z-syleg其中Z是N-端保护基；和所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；c)在溶液中将第一肽片段与第二肽片段偶联，以提供第三肽片段，所述第三肽片段包含氨基酸序列(seq id no. 7)Z-SYLEGQAAKEFIAffLVKX35R-NH2 其中Z是N-端保护基；X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；d)去除第三肽片段的N-端保护基，以提供第四肽片段，所述第四肽片段包含氨基酸序列(seq id no. 7)Z-SYLEGQAAKEFIAffLVKX35R-NH2 其中 z 是 h-；X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；e)提供第五肽片段，所述第五肽片段包含氨基酸序列(SEQID NO. 8)z-hx8egtftsdvs-b' 其中χ8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基； Z是N-端保护基； b，是-0h;并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；f)在溶液中将第五肽片段与第四肽片段偶联，以提供促胰岛素肽，所述促胰岛素肽包含氨基酸序列(seq id no. 9)z-hx8egtftsdvssylegqaakefiawlvkx35r-nh2 其中Z是N-端保护基；X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；g)将由步骤f)产生的促胰岛素肽的N-端保护基去除，以提供包含下述氨基酸序列 (seq id no. 9)的促胰岛素肽z-hx8ex10tftsdvssylegqaakefiawlvkx35r-nh2 其中 z 是 h-；x8和x35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；并且h)将由步骤g)产生的促胰岛素肽与酸接触，从而使氨基酸侧链去保护，以提供包含下述氨基酸序列(seq id no. 9)的去保护的促胰岛素肽z-hx8egtftsdvssylegqaakefiawlvkx35r-nh2 其中z是h-;并且x8和x35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基。
2.权利要求1的方法，由步骤h)产生的所述去保护的促胰岛素肽具有氨基酸序列 (seq. id no. 4)HAibEGTFTSDVS SYLEGQAAKEFIAWLVKAibR。
3.制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤a)提供第一肽片段，其包含氨基酸序列(SEQID NO. 8) z-hx8egtftsdvs-b'其中χ8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基； z是n-端保护基； b，是-0h;并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；b)提供第二肽片段，其包含氨基酸序列(seqID NO. 6) z-syleg-b，其中b’是固相树脂； z是h-;并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；c)将第一肽片段与第二肽片段偶联，以提供第三肽片段，所述第三肽片段包含氨基酸序列(seq ID no. 11)z-hx8egtftsdvssyleg-b ’ 其中b’是固相树脂；z是n-端保护基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；d)将第三肽片段从所述固相树脂上取下，以提供包含下述氨基酸序列(seqID no. 11)的第四肽片段z-hx8egtftsdvssyleg-b ’ 其中b，是-oh ；Z是N-端保护基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；e)提供第五肽片段，其包含氨基酸序列(SEQID NO. 5) Z-QAAKEFIAffLVKX35R-NH2其中 Z 是 H-；x35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；f)在溶液中将第四肽片段与第五肽片段偶联，以提供包含下述氨基酸序列(SEQID NO. 9)的促胰岛素肽z-hx8egtftsdvssylegqaakefiawlvkx35r-nh2 其中Z是N-端保护基；x8和x35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；g)将由步骤f)产生的促胰岛素肽的N-端保护基去除，以提供包含下述氨基酸序列 (SEQ ID NO. 9)的促胰岛素肽z-hx8egtftsdvssylegqaakefiawlvkx35r-nh2 其中 Z 是 H-；x8和x35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；h)将由步骤g)产生的促胰岛素肽与酸接触，从而使氨基酸侧链去保护，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO. 9)的去保护的促胰岛素肽z-hx8egtftsdvssylegqaakefiawlvkx35r-nh2 其中Z是H-;并且x8和x35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基。
4.权利要求3的方法，其中所述去保护的促胰岛素肽具有氨基酸序列(SEQ.ID NO. 4) HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH2。
5.制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤a)提供第一肽片段，其包含氨基酸序列(SEQ ID NO. 12)Z-SYLEGQAAKE-B，其中Z是H-;并且B’是固相树脂；b)提供第二肽片段，其包含氨基酸序列(SEQID NO. 8) z-hx8egtftsdvs-b'其中χ8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基； Z是N-端保护基； b，是-0h;并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；c)将第二肽片段与第一肽片段偶联，以提供第三肽片段，所述第三肽片段包含氨基酸序列(seq id no. 13)z-hx8egtftsdvssylegqaake-b ’ 其中Z是N-端保护基； B’是固相树脂；X8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；d)将第三肽片段从所述固相树脂上取下，以提供包含下述氨基酸序列(seqid no. 13) 的第四肽片段z-hx8egtftsdvssylegqaake-b ’ 其中 z 是 h-； b，是-oh ；X8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；并且e)提供第五肽片段，其包含氨基酸序列(seqID NO. 14) Z-FIAffLVKX35R-NH2其中X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；f)在溶液中将第四肽片段与第五肽片段偶联，以提供包含下述氨基酸序列(SEQID no. 9)的促胰岛素肽z-hx8egtftsdvssylegqaakefiawlvkx35r-nh2 其中Z是N-端保护基；X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；g)将由步骤f)产生的促胰岛素肽的N-端保护基去除，以提供包含下述氨基酸序列 (seq id no. 9)的促胰岛素肽z-hx8egtftsdvssylegqaakefiawlvkx35r-nh2其中 Z 是 H-；X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；并且h)将由步骤g)产生的促胰岛素肽与酸接触，从而使氨基酸侧链去保护，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO. 9)的去保护的促胰岛素肽z-hx8egtftsdvssylegqaakefiawlvkx35r-nh2 其中Z是H-;并且X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基。
6.权利要求5的方法，其中所述去保护的促胰岛素肽具有氨基酸序列(SEQ.ID NO. 4) HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH2。
7.制备促胰岛素肽的方法，所述方法包括下述步骤a)提供第一肽片段，其包含氨基酸序列(SEQID NO. 14) Z-FIAffLVKX35R-NH2其中 Z 是 H-；X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；b)提供第二肽片段，其包含氨基酸序列(SEQID NO. 12) Z-SYLEGQAAKE-B，其中Z是N-端保护基； b，是-0h;并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；c)在溶液中将第一肽片段与第二肽片段偶联，以提供第三肽片段，所述第三肽片段包含氨基酸序列(SEQ. ID NO. 7)Z-SYLEGQAAKEFIAffLVKX35R-NH2 其中Z是N-端保护基；X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；d)将第三肽片段的N-端保护基去除，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ.ID NO. 7)的第四肽片段Z-SYLEGQAAKEFIAffLVKX35R-NH2 其中 Z 是 H-；X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；e)提供第五肽片段，其包含氨基酸序列(SEQID NO. 8)z-hx8egtftsdvs-b' 其中χ8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基； z是n-端保护基； b，是-0h;并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；f)在溶液中将第五肽片段与第四肽片段偶联，以提供包含下述氨基酸序列(SEQID NO. 9)的促胰岛素肽z-hx8egtftsdvssylegqaakefiawlvkx35r-nh2 其中Z是H-;并且x8和x35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；g)将由步骤f)产生的促胰岛素肽的N-端保护基去除，以提供包含下述氨基酸序列 (SEQ ID NO. 9)的促胰岛素肽z-hx8egtftsdvssylegqaakefiawlvkx35r-nh2 其中 Z 是 H-；x8和x35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护；并且h)将由步骤h)产生的促胰岛素肽与酸接触，从而使氨基酸侧链去保护，以提供包含下述氨基酸序列(SEQ ID NO. 9)的去保护的促胰岛素肽z-hx8egtftsdvssylegqaakefiawlvkx35r-nh2 其中Z是H-;并且x8和x35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基。
8.权利要求7的方法，其中所述去保护的促胰岛素肽具有氨基酸序列(SEQ.ID NO. 4) HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR-NH2。
9.制备去保护的促胰岛素肽的方法，所述去保护的促胰岛素肽包含氨基酸序列(SEQ ID NO. 9)z-hx8egtftsdvssylegqaakefiawlvkx35r-nh2 其中Z是H-;并且x8和x35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基， 所述方法选自如权利要求1、3、5和7中所述的方法。
10.一种肽，其氨基酸序列为(SEQ ID NO. 5) Z-QAAKEFIAffLVKX35R-NH2其中z是h-或n-端保护基；x35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。
11.一种肽，其氨基酸序列为(seq id no. 7) Z-SYLEGQAAKEFIAffLVKX35R-NH2其中Z是H-或N-端保护基；x35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。
12.—种肽，其氨基酸序列为(seq id no. 8)z-hx8egtftsdvs-b' 其中χ8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基； Z是H-或N-端保护基； B’是-OH或固相树脂；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。
13.—种肽，其氨基酸序列为(seq id no. 11)z-hx8egtftsdvssyleg-b ’ 其中b’是-oh或固相树脂；Z是H-或N-端保护基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。
14.一种肽，其氨基酸序列为(seq id no. 12) Z-SYLEGQAAKE-B，其中Z是H-或N-端保护基；并且 B’是-OH或固相树脂。
15.一种肽，其氨基酸序列为(seq id no. 13)z-hx8egtftsdvssylegqaake-b ’ 其中Z是H-或N-端保护基； B’是-OH或固相树脂；x8是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。
16.一种肽，其氨基酸序列为(SEQ.ID N0. 7) Z-SYLEGQAAKEFIAffLVKX35R-NH2其中Z是H-或N-端保护基；x35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。
17.一种肽，其氨基酸序列为(SEQ. ID NO. 14) Z-FIAffLVKX35R-NH2其中Z是H-或N-端保护基；X35是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基；并且所述序列中的一个或多个残基任选地包含侧链保护。
18.权利要求10-17中任一项的肽，其中Z是Fmoc。
全文摘要
本发明涉及利用固相和液相(“杂合”)方法进行的促胰岛素肽的制备，所述促胰岛素肽包含氨基酸序列(SEQ ID NO.9)Z-HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2其中Z是H-，并且X8和X35各自独立地是非手性的、任选地是空间位阻的氨基酸残基。通常，所述方法包括利用固相化学合成三种不同的肽中间体片段。然后，利用液相化学将第二片段与第一片段偶联。备选地，将不同的第二片段与固相中的第一片段偶联。接着，利用液相化学添加第三片段，由此将第三片段偶联到在液相中的偶联的第一和第二片段上。
文档编号C07K14/605GK102414220SQ201080019254
公开日2012年4月11日 申请日期2010年4月28日 优先权日2009年5月1日
发明者克里斯托夫·R·罗伯茨, 陈林, 韩渊奎 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司