专利名称:用于检测和鉴定分子结构的扫描探针显微图像基于模型的融合的制作方法
用于检测和鉴定分子结构的扫描探针显微图像基于模型的融合
相关申请
本申请是2002年10月17日提交的、在审中的序列号为10，273，312的美国专利
申请的部分继续申请。
发明领域
本申请总体上涉及成像，更特别地，涉及图像基于模型的融合(model-basedfusion)。某些公开的方法是涉及测定结构，包括生物分子诸如蛋白、肽、脂类、多糖和/或核酸的结构。
技术背景
在各种形式的成像技术诸如扫描探针显微技术(scanning probemicroscopy,SPM)中，可以应用不同的传感形式(sensing modalities)对特定的对象进行成像。在传统方法中，各个图像可以被单独阐释(interpreted)，其仅仅对图像的各种常规特征作定性的交叉参照(cross-referencing)。在SPM中，图像通常用目测(visual observation)来阐释。当必须阐释大量的数据时，如鉴定各种样品中一种或者多种特定的分子结构时，图像的阐释可能是耗费时间且效率低下的。通过不同的扫描探针形式诸如原子力显微技术(atomic force microscopy,AFM)、扫描穿隧显微技术(scanning tunneling microscopy,STM)和/或磁力显微技术(magnetic force microscopy, MFM)摄取的图像中的结构特征的交叉参照是非常缓慢的，而且容易产生操作失误或错误阐释。
在确定已知的对象是否存在于样品中时，通常并不会将用于对样品进行成像的不同传感形式组合起来以提供样品的同一区域的融合图像(fused image)。在样品的多个图像被组合时，通常是通过在逐点(point-by-point)或逐象素(pixel_by-pixel)的基础上将不同组的数据组合起来实现的。然而，图像的组合不能充分利用在不同图像中相互独立的信息。而且，在逐点或逐象素的基础上组合图像需要各个图像精确的对准(alignment)，以在同一栅格(grid)创造出多特征(multi-feature)图像。在不存在用于对准的已知的校正地标(calibrationlandmarks)时,这样的对准对于纳米级结构的SPM图像是非常困难的。因此需要利用生物分子的已知结构特征来辅助SPM图像的鉴定和分析的图像融合方法。
附图简述
下面的附图形成本说明书的一部分，用来进一步阐述公开的方法和仪器。通过参考其中一幅或多幅附图并结合本文中的详细描述，可以更好的理解这些方法和仪器。
图I显示了图像参量基于模型的融合的示范性方法。
图2显示了流程图,其示出了对一组图像进行基于参量的分析(parameter-basedanalysis)的示范性方法。[0008]图3显示了将SPM图像与分子结构的物理模型组合起来形成该结构基于参量的表征的示范性方法。
图4显示了示范性的利用SPM的对象鉴定体系。
图5显示了示范性的 通过原子力显微技术获得的消化λ DNA图像。
图6 显不了用微流态分子梳(microf luidic molecular combing, MMC)对准 DNA分子的实例。
图7 显不了用微流态分子梳(microf luidic molecular combing, MMC)对准 DNA分子的另一个实例。
图8显示了示范性的由13个独立寡核苷酸链杂交在一起的寡核苷酸SPM探针。
图9显示了图8的SPM探针的各个寡核苷酸组分。注意，如图8中所示，有9个片段(按次序标记为PTl到PT9)用于组成SPM探针的上链；有4个片段(标记为#1到#4)组成SPM探针的下链。杂交的SPM探针显示出可由扫描探针显微技术检测到的分支点(branchpoints)。
图10列出了 PTl到PT9的全序列，包括分支点。
图I I显示了通过原子力显微技术成像的图8和图9的SPM探针(箭头，图的右上角)。为了比较，2. 8kb的线性质粒DNA也被显示出来。
示范性实施方案详述定义
如本文中所用的，“一”、“一个”(“a”和“an”)可以指一个或者一个以上的某事物。
如本文中所用的，“对象(subject)”可以是能够通过SPM技术成像的任何物体，包括但不局限于生物分子。技术人员将会理解，生物分子可以指发现于生物系统的任何分子，包括但不局限于蛋白质、多肽、肽、糖蛋白、脂蛋白、脂类、多糖、糖脂、脂多糖、寡核苷酸、多聚核苷酸、核酸和核蛋白。“对象”不局限于单分子，也可以包括两个或多个分子的复合物。
“核酸”包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)，可以是单链的、双链的或三链的，以及其任何化学修饰。“核酸”可以是任何长度的，从2个碱基大小的到全长染色体。事实上，核酸的任何共价或非共价修饰都在请求保护的主题的考虑范围之内。“核酸”包括，但不局限于寡核苷酸和多聚核苷酸。
“蛋白质”指任何长度的由氨基酸组装而得的聚合分子。“蛋白质”可以包括自然发生的、修饰的、衍生的、标记的和/或非自然发生的氨基酸和/或氨基酸类似物。“蛋白质”包括，但不局限于肽、多肽、糖蛋白和脂蛋白。
本文中描述的方法和仪器可用于SPM图像基于模型的融合。SPM图象基于模型的融合可以用来检测、鉴定和/或表征一种或多种生物分子。参量可以源自已知的对象的多份图像，这些图像是利用不同的SPM成像形式获得的。所述参量可以与所述对象的模型融合，从而形成所述对象基于参量的表征。
在下面的详细描述中，为了解释的目的，描述了许多具体的细节。然而，应该理解，请求保护的方法和仪器没有这些具体细节也可以实施。在其他方面，众所周知的电路、结构、技术和装置没有详细描述。
下面描述的各种方法可以用硬件组件来实施，或者可以根据可由机器执行的指令来实施，所述指令可以被用来获得由所述指令编程的通用的或专用的处理器或逻辑电路以实施这些方法。可选择地，这些方法可以通过硬件和软件的组合来实施。
生物分子
下面的讨论关于已知生物结构的非限制性实施例，诸如核酸和蛋白质。本领域技术人员将认识到，其他类型的已知生物结构，包括但不局限于脂类、糖类、肽、寡核苷酸、糖蛋白、糖脂、脂蛋白也可以用公开的方法和仪器分析。
核酸待分析的核酸可以用本领域已知的任何技术制备。将被分析的核酸可以包括纯化或部分纯化的DNA或RNA样品。事实上，任何自然发生的核酸都可以被分析，包括但不局限于染色体、质粒、叶绿体和线粒体DNA和信使RNA、核糖体RNA、转运RNA和不均一核RNA。纯化核酸的方法是已知的(如 Guide to Molecular Cloning Techniques, eds. Berger andKimmel, Academic Press, New Your, NY,1987 ；MoleculaCloning A Laboratory Manual,2nd Ed. ,eds Sambrook,Fritsch andManiatis, Cold Spring Harbor Press, Cold SpringHarbor Press,NY, 1989)。核酸纯化试剂盒也可以商购(如 Qiagen, Valencia, CA ;Ambion,Austin, TX ；Clontech, Palo Alto, CA)。这些方法和试剂盒只是示范性的,本领域技术人员知道的任何变化都可以被应用。
将被分析的其他类型的核酸可以用引物延伸或聚合酶链式反应(PCR )制备(如美国专利4，683，195 ;4，683，202和4，800, 159)。可选择地，核酸可以被插入到各种载体中，诸如BAC、YAC、质粒、病毒、柯斯质粒(cosmids)、噬菌体等，并复制和/或纯化这些插入片段(参见如Berger and Kimmel , 1987 ；Sambrook etal. ,1989)。核酸插入片段可以从载体DNA分离得到，例如通过用合适的限制性内切酶切割，再进行琼脂糖凝胶电泳来分离。分离核酸插入片段的方法是本领域已知的。公开的方法不限制待分析的核酸的来源，任何类型的核酸包括原核生物、细菌、病毒、真核生物、哺乳动物和/或人的核酸都可以在请求保护的主题范围内被分析。
目前确定核酸分子结构的方法主要是指核酸测序，这主要是利用Sanger双脱氧测序方法的某些变型或与芯片阵列上的已知寡核苷酸序列杂交的方法来测定。可以用计算机处理方法来分析核酸序列，鉴定结构特征，诸如茎-环(stem-loop)形成序列、回文序列、发夹结构和蛋白结合结构域。目前其他的核酸结构分析方法包括核磁共振(NMR)成像和X射线晶体学(参见如http://ndbserver. rutgers. edu/)。NMR仅适用于鉴定短的、相对简单的核酸结构，而X射线晶体学需要繁琐、耗时的单分子晶体形成过程，并需要大量的纯化核酸。
已知的核酸结构通常归入表I中总结的几类中的其中一类。这些结构有时被称作双链DNA的A、B和Z结构。表I.已知的核酸结构
权利要求
1.一种检测和鉴定分子结构的方法，包括 a)在分析之前，将生物分子附着到表面上并且通过分子梳在所述表面上以平行的方式对准所述生物分子； b)用至少两种不同形式的扫描探针显微技术(SPM)对所述生物分子进行成像； c)使用基于模型的分析，利用已知生物分子的一个或多个物理结构模型来分析所述图像； d)由所述图像获得一个或多个参量的值的估量和与一个或多个参量的值的所述估量相关的误差； e)融合由不同的图像获得的估量参量和所述误差，以获得最终参量估量；和 f)鉴定所述生物分子的结构， 其中所述分子梳包括将所述生物分子附着到所述表面并且利用抽出所述生物分子通过移动的弯月面将所述附着的生物分子对准。
2.权利要求
I的方法，其中所述融合基于所述生物分子的物理结构的模型。
3.权利要求
I的方法，进一步包括鉴定所述生物分子。
4.权利要求
3的方法，进一步包括将所述一个或多个融合参量与由已知生物分子确定的参量相比较，从而鉴定是否存在已知生物分子。
5.权利要求
I的方法，其中SPM成像包括选自下列形式的至少两种形式原子力显微术(AFM)、扫描穿隧显微术(STM)、侧向力显微术(LFM)、化学力显微术(CFM)、力调制成像、磁力显微术(MFM)、高频MFM、磁阻敏感绘图(MSM)、电力显微术(EFM)、扫描电容显微术(SCM)、扫描扩展电阻显微术(SSRM)、穿隧AFM和传导AFM。
6.权利要求
I的方法，其中所述参量通过水平集技术、TOE(偏微分方程)技术和/或活性表面技术来估量。
7.权利要求
6的方法，进一步包括将所述技术嵌入到概率(贝叶斯)估算框架，来表示模型的不确定性和仪器噪音。
8.权利要求
I的方法，进一步包括将向量量化、支持向量机和/或统计分类器运用于所述融合的参量，从而对所述生物分子进行分类。
9.权利要求
8的方法，进一步包括利用已知的生物分子结构来产生训练数据集。
10.权利要求
I的方法，进一步包括利用已知的生物分子结构来获得每类生物分子的参量范围。
11.权利要求
10的方法，其中所述已知生物分子的参量范围被用于估量所述参量。
12.分子结构鉴定系统，包括 a)包括分子结构的表面，所述分子结构在分析以前通过分子梳以平行的方式对准； b)用于拍摄图像的具有多种成像形式的扫描探针显微镜； c)控制扫描探针显微镜的操作的控制器；和 d)包括一个或多个已知分子结构的表征的存储器； 其中所述控制器包含处理器，其被设定用于由所述图像获得一个或多个参量的值的估量和与一个或多个参量的值的所述估量相关的误差和融合由不同的图像获得的估量参量和所述误差，以获得最终参量估量，其中所述分子结构是生物分子，并且所述分子梳包括将所述生物分子附着到所述表面并且利用抽出所述生物分子通过移动的弯月面将所述附着的生物分子对准。
13.权利要求
12的系统，其中所述的已知结构的表征代表来自多个已知的生物分子结构的融合参量的集合。
14.权利要求
13的系统，其中所述的已知结构的表征被用于分析一组SPM图像。
15.权利要求
14的系统，其中所述的SPM图像被分析，以鉴定样品中是否存在一种或多种已知结构。
16.权利要求
15的系统，其中所述SPM图像按下面方法分析(i)分析粗数据集，以检测已知结构可能出现的位置；和(ii)再一次或多次重新分析可能的出现位置，每一次分析利用比在前分析中所利用的数据集更精练的数据集。
17.权利要求
15的系统，其中所述多个图像形式选自原子力显微术(AFM)、扫描穿隧 显微术(STM)、侧向力显微术(LFM)、化学力显微术(CFM)、力调制成像、磁力显微术(MFM)、 高频MFM、磁阻敏感绘图(MSM)、电力显微术(EFM)、扫描电容显微术(SCM)、扫描扩展电阻显微术(SSRM)、穿隧AFM和传导AFM。
18.权利要求
I所述的方法，其中分子梳包括微流态分子梳。
19.权利要求
I所述的方法，其中分析包括同时分析多个不同的已知生物分子的存在。
20.权利要求
I所述的方法，其中分析包括纳米级结构的三维分析。
21.权利要求
I所述的方法，其中分析包括确定所述生物分子的一级结构。
22.权利要求
I所述的方法，其中分析包括确定所述生物分子的二级结构。
23.权利要求
I所述的方法，其中分析包括确定所述生物分子的三级结构。
24.权利要求
I所述的方法，其中分析包括确定所述生物分子的四级结构。
专利摘要
在本发明某些实施方案中，可以使用不同的成像技术诸如不同形式的扫描探针显微技术捕获一个或多个对象的一系列图像。利用已知的分子结构的一种或多种模型，可以由所述的一系列图像估算出参量，以提供基于模型的分析。所述的估算出的参量可以与来自已知的分子结构的物理模型的进一步输入相融合。融合参量可以用来表征对象。这样的表征可以包括检测和/或鉴定特定的分子结构，例如具有已知序列和/或结构的蛋白、肽和/或核酸。在本发明的某些实施方案中，结构表征可以用来鉴定对象分子的先前未知的性质。
文档编号G01Q60/50GKCN1706002 B发布类型授权 专利申请号CN 200380101491
公开日2012年11月21日 申请日期2003年10月16日
发明者A·伯林, E·汉娜, H·奥瑟克, M·山川, N·孙达拉简, S·陈 申请人:英特尔公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (5), 非专利引用 (5),