用于研究活细胞的扫描离子电导显微术的制作方法

专利名称:用于研究活细胞的扫描离子电导显微术的制作方法
技术领域：
本发明涉及扫描探针显微术及其在结构(特别是细胞)的柔性或弾性研究中的用途。
背景技术：
细胞是活体生物的最基本単位，不管是对于动物或是植物。对细胞的结构和组成，以及其各组分如何发挥功能的研究有利于洞察存在于完整生物系统中的复杂过程。这需要这样的技术，即所述技术使得可以实时、非损伤地进行细胞样品的研究，并且在模拟生理条件的溶液中进行这种研究，以使得细胞的功能性得以保持。
光学显微术(使用可见光)已经被广泛地应用于研究活细胞。然而，衍射将其分辨率限制在约200-250nm。为进行更加细致的研究，ー个通常被使用的方法是电子显微木， 此时有可能得到分辨率为IOnm的图像，但在成像之前需要将样品固定。因此，不可能利用电子显微镜来研究活细胞。
另ー种可能的高分辨技术是基于扫描探针显微术(SPM)的使用，其中一个尖的探针尖端紧密接近被研究的样品进行扫描。随之发生的相互作用及样品因此的化学/物理性质可以被绘制为尖端相对于样品的位置的函数，以形成该测量的相互作用的图(profile)。通常应用于生物成像的SPM家族的成员为原子力显微术(AFM)、扫描离子电导显微术(SICM)和扫描近场光学显微术(SNOM)。
在SICM中，用一个充满电解质的玻璃微米吸管(pipette)在浸泡在电解质溶液中样品的表面上进行扫描；见Hansma et al (1989) Science 243:641-3。通过监测流经管ロ的离子电流来将所述吸管-样品距离维持在ー恒定值。该流动位于两个电极(一个电极位于所述吸管内部，另ー个电极在外部的电解质溶液中)之间。由于电极之间的偏压，所述离子电流信号取决于微米吸管的电阻(Rp)和接入电阻(Rac)的组合，所述接入电阻是沿浸泡液至微米吸管开ロ处的会聚路径(convergent path)的电阻。Rp取决于所述微米吸管的尖端直径和锥度，而Rac显示出对浸泡液和样品的电化学性质、样品的几何形状，以及样品与探针的距离的复杂的依赖性。是Ri使所述吸管-样品的距离具有了离子电流敏感性，井利用它来保持该距离以使得不会发生接触。
已使SICM成为用于精细表面的非接触分析方法的最佳尖端-样品距离是所述尖端直径的约 1/2 ;參见 Korchev et al (1997)、J. Microsc. 188 17-23 和 Biophys. J. 73 653-8。控制尖端位置的系统的输出数据被用于生成样品表面的形状特征的图像。使用SICM可获得的空间分辨率依赖于尖端口径的大小，并一般为50nm-l. 5 μ m。这可产生相应的分辨率。
然而，仍然有对用于研究表面结构(例如细胞)的方法和装置进行改良的需求。
发明内容
本发明是基于这样的认识，即通过流经位于被研究表面附近的扫描探针的、受调节的液流，可以将局部化和受控的压カ或力施加到该表面上。通过监测所施加的压カ和所形成的表面的运动之间的关系，这种压力的施加可用于测量表面的柔性或弾性。它还可以用于刺激细胞表面组分，例如机械敏感性离子通道，通过监测随之发生的电生理信号或化学信号的随后的变化情況，对该刺激进行测量。
根据本发明的第一方面，ー种使用扫描探针显微术来查验(interrogate)表面的方法，包括使ー个扫描探针接近于所述表面，控制所述探针的位置以保持恒定的距离，其特征在于通过流经所述探针的受调节 的液流将压カ施加到所述表面上，随后监测所述探针的位置，其中所述探针的运动表明所述表面的随之发生的运动情況。
根据本发明的第二方面，ー种诱导细胞中电生理变化或化学变化的方法，包括使ー个扫描探针接近于所述细胞表面，通过流经所述探针的受调节的液流将ー个确定的压カ施加到所述表面上，并监测细胞电生理信号或化学信号的变化。
根据本发明的第三方面，是ー种用于查验表面的装置，包括ー个扫描探针显微镜和一个通过流经所述探针的受调节的液流将压カ施加到所述表面上的工具。
由于探针尖端距离表面的平均距离一般接近所述探针的内半径，流体的低流速流动形式(flow pattern)在所述表面上产生的压カ接近于施加到所述探针内液体上的静水压，并且通常施加到所述表面的净カ为该压カ(pressure)和所述探针尖端ロ的横断面积的乘积。所述尖端下的表面受到的局部压カ几乎恰好与外部施加到所述吸管(探针)上的压カ相同，而不管用何种方式形成该外部施加的压力。另外，施加到所述表面的力被证明非常接近乘以所述尖端的横断面积的压力。这两方面都已经通过经验来确定，并且通过分析来研究。它们使得对数据的解释十分直接，并且是本发明方法具体的优势所在。


对本发明的描述參考了附图，其中
图I(A)和⑶示出了用于研究细胞表面的SICM系统的构造，图I(C)示出细胞表面的扫描结果；
图2显示了用接触法和非接触法的SICM ；
图3显示了 SICM吸管接近人DRG神经元时的[Ca2+]；
图4显示了使用非接触法连续机械刺激NRG神经元的结果；
图5示出了接触法和非接触法与基于[Ca2+]的机械刺激关系的结果；
图6示出了通过机械刺激DRG感觉神经元激活的电流；以及
图7示出了使用本发明的SICM产生的NRG感觉神经元的荧光刺激。
具体实施方式
本发明提供了ー种将高度局部化和受控的压カ或力施加于ー个表面的方法。该方法可用于测量细胞表面的弾性，或者用于刺激多种响应于所述机械刺激而产生电生理信号或化学信号的生物结构。
用于进行本发明的装置通常包括一个探针；用于测量和/或控制所述探针与所述待查验表面的距离的工具；以及用于将受控的压力施加于所述探针内的液体上的工具。所施加的压カ产生了流经所述探针尖端的液流，而该液流又在被查验的表面形成了一个相关的压力。
术语“查验”意在指检测ー个结构表面处的变化的能力，例如探测在单个位点或随所述探针扫描所述表面时所述表面上的或所述表面处的结构变化的能力。
如果表面足够柔软，则施加至该表面的压カ将导致该表面运动。正压，即经探针流向所述表面，具有将表面从探针推离的作用，増加了表面和探针之间的间隔距离。负压将表面牵拉向探针，縮小了该间隔距离。然而，由于该装置的目的在于恒定地控制探针与表面的距离，所以表面的任何运动都会伴随着相应的探针运动。这产生的结果是，可监测所述液流、压カ和运动之间的内在关系。探针垂直位置的任何变化均提供了所述表面垂直位置变化的直接指示，所述表面垂直位置的变化可能是所施加的压カ的結果。因此，所施加的压カ和所产生的所述表面的运动之间的关系可提供所述表面结构的弾性方面的信息。
本发明还可用于刺激响应于机械刺激而发出电生理或化学信号的细胞结构。例 如，可以刺激离子通道，并且可以使用合适的探测器检测所产生的发射信号。这可用于机械感觉(mechanical sensation)的研究。机械感觉是不同机体过程运行的基础，所述机体过程包括渗透调节、生长、听觉、向重力性、平衡、本体感受和触觉(Ghazi et al. ,Biochemie,1998 ；80 :357-62)。与均通过激活G-蛋白偶联受体而发挥功能的嗅觉、味觉和视觉不同，触觉、痛觉和听觉背后的机械感觉的分子基础仍不清楚(Sukharev and Corey, Sci STKE,2004 ；219 re4 ；Kung, J. Appl. Physiol.，2005 ；98 :2328-36)。机械敏感(MS)离子通道由跨膜蛋白组成，所述跨膜蛋白将机械カ转换成电信号或化学信号(Sukharevand Corey,上文2004)。在很多生物中已经通过电生理方法检测到了 MS离子通道，所述生物包括细菌、酵母、植物和大量的动物细胞(Ghaziet al，上文1998 ;Kung，上文2005)。机械激活的通道似乎是ー组来自多个离子通道家族的异质膜蛋白，所述离子通道家族包括大肠杆菌的MscL和MscS、牵张激活的K+通道(6个跨膜区(TM) (SAKCa)和2TM(KATP))、DEG/ENaC型通道、机械门控双孔(4TM)K+泄漏通道和TRP家族的几个成员(Ghazi et al，上文1998 ;Sukharevand Corey,上文 2004)。
本发明不仅可用于查验细胞或细胞表面结构，而且可用于研究任何以下的表面在施加通过扫描显微镜施加的适当水平的压カ时会变形的表面，或者对这种压カ有不同水平抗性的表面。所述表面可以是固体或液体。例如，所述表面可以是乳液或以水为基础的液体的表面，其中所述表面的机械特征可掲示所述乳液或液体的性质。例如，以水为基础的液体中的油滴与水相比，将提供对所施加压カ的不同水平的抗性，因此本发明可用于鉴定水包油组合物的特征。该方面可以用于确定许多食品、化妆品和清洁产品的体特性(bulkcharacteristic)。被研究的液体水通常与用于灌注探针的液体是不混溶的。
另外，本发明可用于研究非生物结构，例如以橡胶为基础的材料或者以塑料为基础的材料，其中所施加的压カ可掲示这些材料的结构中的差异。
所述探针还可以用于扫描ー个表面，即通过扫描探针显微木。可形成ー个图像，且所研究的表面的一部分可被鉴定为具有一特定特征。可以很精确地在选定的位置对所述表面施加正压或负压，从而使得可測量所述表面的机械反应或运动。可以在所述表面的相同或不同部分重复该过程，以提供所述表面的详细信息。
所述探针还可以用于扫描所述表面，并同时对其施加压力。这样，由于所述表面对所施加的压カ有反应，因而本发明可用于建立所述表面的详细图像，以掲示表面和亚表面结构。
在所述表面特别柔软且施加正压的区域中，所述表面可塌陷至下面的亚结构上，例如细胞膜可显示其下面的细胞骨架的形状。在所述表面特别柔软且施加负压的区域中，提升所述表面的变化程度可掲示，例如细胞膜的哪些部分锚定于细胞骨架上以及哪些部分可自由移动。
本发明的ー个优点是，不需要将探针与表面接触即可查验该表面，而探针与表面的接触会导致所述表面的损伤、所述尖端的污染以及重复实验中所述表面的交叉污染。
可使用常规的装置进行本发明。例如，可以使用扫描离子电导显微术(SICM) oSICM系统一般包含所有扫描探针显微镜都具有的特征部件，即扫描探针、压电(Piezo)执行器 扫描元件、控制电子部分和计算机。这些部件可内置的并且位于一台倒置显微镜上周围，所述倒置显微镜例如 Diaphot 200 (Nikon Corporation, Tokyo, Japan) 0
可以使用任何合适的中空的探针。所述探针一般为微米吸管或纳米吸管。这种探针可通过使用基于激光的微吸管牵拉仪(例如P-2000型，Sutter Instrument Co.,San Rafael, CA，USA)牵拉硼硅酸盐玻璃毛细管来制备，所述玻璃毛细管具有例如分别为
I.OOmm和0. 58mm的外径和内径。可获得圆锥形的纵向逐渐变细且具有200nm、400nm和
I.O μ M顶端直径的探针。安装所述装置，通常使得探针尖端距表面的平均距离约为所述探针的内半径。
可以通过常规的方法施加压力，以控制流经所述探针的液流。通常，一个可编程的压カ注入器系统(例如ΡΜ-4型,Warner Instruments,Hamden,CT,USA)通过软管与SICM吸管固定器的柄耦合，所述注入器被编程以产生所需的压力/时间谱。所需的压力大小可由本领域技术人员确定。一般施加至少IOkPa的正压，例如10-50kPa。更通常施加13_40kPa的压力。
还可以用ー些可测量电生理信号或化学信号的工具来实施本发明，这些信号可以由细胞或生物表面产生并且可用本发明进行刺激。这种测量工具在扫描离子电导显微术中是常规的，并且可被应用于本发明中。
以下的实施例可举例说明本发明。
实施例
以下的实施例在人和大鼠DRG感觉神经元的研究中，通过与常规的接触SICM方法的对比，研究了本发明的非接触SICM方法。
扫描离子电导显微镜(SICM)
我们使用SICM探针来选择膜的亚微米区域并对其进行机械刺激，所述亚微米区域通常是用于进行机械刺激的较大探针所无法接近的。我们获得形貌图像(topographicimage),并使用一台SICM(Ionoscope Limited, London, UK)对所述细胞进行机械刺激。用于活细胞形貌成像的基本的SICM排布在以前已有记载(Korchev et al. ,Biophys. J. 1997a ；73 :653-8 ；Korchev et al. ,J. Microsc. 1997b ； 188 (Ptl) :17-23)。简言之，SICM 使用ー个与样本垂直排布的膜片钳纳米吸管作为扫描探针。这种装配在一个三轴压电平移平台上的吸管接近所述细胞表面并在其上进行扫描(图1B)，同时使用可使通过所述吸管的离子电流保持恒定的SICM反馈控制来保持尖端-样品间隔距离不变。SICM控制器可产生所述细胞的表面图像(图1C)，并使以下事件成为可能，即使吸管垂直精确地接近所述细胞经鉴定的特定区域或结构，至距离膜约IOOnm以内。然后，用SICM吸管探针机械地刺激所述细胞，同时进行膜片钳电生理学研究，以测量膜电流或细胞内Ca2+成像(图1A)。
使用基于激光的电极牵拉仪(P-2000,Sutter Instrument,Novato, California),由硼娃玻璃毛细管(Intrafil, I. Omm ODxO. 58mm ID ；Intracel Ltd, Herts, UK)拉制 SICM纳米吸管，以得到当被没入至槽液中时阻抗为15-20ΜΩ的吸管。基于被没入至槽液中时的吸管电阻，所述吸管尖端内半径为约200nm。
机械刺激
我们用SICM的纳米吸管探针施加两种不同类型的机械刺激。在第一种方法(“接触法”)中，在确定距离和持续时间的步骤中关闭SICM反馈控制，并通过压电控制将该吸管对着该细胞膜垂直降低(图2A)。在该方法中，所述吸管与ー个小区域( 700nm =所述吸管尖端的外径)上的膜直接接触并使其凹陷，由于所述吸管的物理堵塞而使流经所述吸管的电流(I/I#)減少(图2C)。第二种方法是“非接触法”，其中通过压电控制使所述吸管垂直地向着细胞膜降低，与之同时从所述吸管的尖端向该细胞施加压カ射流(图2B)。在 实施所述向下刺激的步骤之前的几秒钟，经由所述SICM吸管的柄施加正压(13-40kPa)，以产生从所述吸管尖端出来的液体射流，然后立即停止施加所述正压。溶液射流阻止了与膜的接触并因此防止所述吸管的堵塞，这可以通过流经所述吸管的电流没有显著減少来证实(图2D)。该方法可产生对细胞的“非接触”机械刺激，这是因为它防止了对细胞膜的任何接触和物理损伤。
我们用以下的实验处理了机械方法造成的假象问题对记录槽的底部玻璃表面施加压カ射流，目的是观察当我们施加可能造成吸管运动或吸管电阻变化的压カ射流时所述吸管是否会出现欺骗性运动，但没有发现所述SICM吸管的显著运动(< 10nm)。
细胞培养
人DRG感觉神经兀的制备如Anand et al. , Neurosci. Lett. 2006 ；399 :51_56 中所述述。简言之，从5名成年男性患者(η = 5，年龄区间21-28岁)获得完整的颈DRG，这5名患者在此前最长达两周的时间里在交通事故中发生臂丛撕脱伤，即中枢轴突切断(centralaxotomy)。在神经重建外科手术过程中作为神经修复的必要程序而切下DRG，并在有患者的知情书面同意以及地区伦理委员会的许可的情况下对其进行研究。将来自每个患者的2-3个颈神经节切碎，并在含有青霉素(lOOyg/ml)、链霉素(100 μ g/ml)、0. 5%分散酶(8U/mg,GIBC0)和 0. 2%胶原酶(IV 型 Worthington，168U/mg)的 Ham' s F12 营养培养基(GIBCO)中于37°C下酶消化3小时，然后在Ham' s F12+10%胎牛血清中进行机械解离。将250 μ I含约3000个细胞/ml的细胞悬液铺于用聚左旋赖氨酸(20 μ g/ml，Sigma)和层粘连蛋白(20 μ g/ml, Sigma)包被的 8 孔 Permanox Labtek 玻片(Nalge Nunc Int.)。姆个孔中加入 2ml Ham' s F12+10% FCS，并将 NGF-7S (100ng/ml Sigma Aldrich)、rh⑶NF (50ng/ml)和rhNT3 (50ng/ml)加入至半数的孔中。将所述细胞在37°C下于8% CO2/空气的湿润环境中培养5天，并且每3天更换一次培养基。
通过CO2窒息将成年Wistar大鼠杀死，获得所有脊髓水平的DRG并将它们混合。将DRG 集中在 Ham' s F12Nutrient Mix (Invitrogen LifeTechnologies Ltd, Paisley, UK)中，并在新鲜Ham' s F12中离心-洗漆3次。然后将DRG转移至I. 5ml eppendorf管中，并于37°C和5% CO2下在Iml的10U/ml木瓜蛋白酶溶液(Sigma)中浸50分钟。将消化的组织离心，除去过量的木瓜蛋白酶，然后在胰蛋白酶抑制剂溶液(Sigma)中浸软。将大鼠和人感觉神经元铺于以聚左旋赖氨酸(20yg/ml)和层粘连蛋白(10yg/ml)(均来自Sigma)预包被的圆形盖玻片(直径13mm)上。将细胞在37°C下于95%空气和5% CO2的气氛中培养至少48小时，使用的是补充有神经营养生长因子(NGF-7S 100ng/ml、⑶NF 50ng/ml和hNT350ng/ml)的完全BSF2培养基(Ham' s F12、牛血清白蛋白、脱铁运铁蛋白、孕酮、胰岛素、亚硒酸钠、腐胺、青霉素、链霉素和2% (用于大鼠)或10% (用于人)热灭活的胎牛血清)；然后将细胞用于实验中。
电生理学
将培养于盖玻片上的DRG感觉神经元转移至灌注槽(per-fusionchamber) (RC-25, Warner Instruments Inc.)中，使用单独的膜片甜前级探头(patch clamp headstage)和电极进行了标准的全细胞电压-钳记录。由与用于制备SICM吸管的玻璃毛细管相同的玻璃毛细管制备膜片钳电极(patch electiOde)，吸管电阻为10-16ΜΩ。膜片钳吸管溶液包含 130mM CsCl、5mM NaCl、5mM EGTA-Na 和 IOmM HEPES，pH 7.3。槽液和 SICM 吸管溶液包含 140mM NaCl、5mM KCl、2mM MgCl2U. 8mM CaCl2、IOmM 葡萄糖和 IOmM HEPES，pH 7.4。所有无机盐和试剂均购自 Sigma-Aldrich Company Ltd. (Sigma,Gillingham,UK)。通过膜片钳电极将_60mV的保持电位施加至被膜片钳钳住的细胞,并且使用一台Axopatch 200B膜片甜放大器和 Clampex-pClamp 9 (Axonlnstruments, Burlington, California)以 IOkHz连续对记录值进行取样，并以2kHz进行在线过滤。用该软件减去电容泄漏电流和/或线性池漏电流° 使用 Clampfit-pClamp 9 和 Origin 5 (Microcal,Northampton,Massachusetts)进ー步分析数据。所有实验均在23±2°C的室温下进行。
钙成像
在室温下用4μΜ 的 fluo-4 こ酸氧甲酯(fluo_4AM ；Molecular probes, Eugene,Oregon)加载DRG感觉神经元I小时。洗掉剩余的fluo_4,然后进行15分钟的脱脂,然后转移至所述灌注槽中。通过在450-480nm下激发fluo-4对Ca2+波动进行成像，并使用增强型CCD (CoolView IDIcamera system, Photonic Science, Sussex, UK)检测> 520nm 的发射突光，该增强型CCD与一台Nikon TE-2000倒置显微镜耦联并受Image-ProPlus软件(MediaCybernetics, Wokingham, UK)控制。以姆秒2巾贞的速度米集图像,各巾贞曝光时间为100ms。相应的时间迹线(time trace)以所研究区域中突光与初始突光的比值(F/F。)的形式示出了标准化的荧光强度。
结果
我们使用Ca2+成像实验来表征DRG感觉神经元对机械刺激的反应。首先，使用接触法在细胞体的ー个小区域(< I μ m2)上刺激DRG神经元。图3所示为SICM吸管在两个I μ m的步骤中接近人DRG神经元表面时的結果。通过第一个步骤，该神经元显示出小的[Ca2+] i升高。fluo-4的荧光强度从基础水平(图3A，框I)増加至框2中的水平。将所述吸管进ー步推进I μ m——在达到Ca2+反应的峰值时——激发了 [Ca2+] i的额外升高(图3A，框3)。[Ca2+] i在约2分钟后返回至基础水平(图3A，框4)，这时2 μ m的第3次刺激再次引起[Ca2+] i升高(图3A，框5)。我们在人(η = 12)和大鼠(n = 24) DRG神经元上都对接触法进行了评估。然而，在使用这种接触法时有ー个很大的限制。在ー个指定实验中成功的连续刺激的数目是有限的。所述吸管毎次触及细胞表面，都会粘附在膜上并且会造成所述细胞的物理损伤；这可以通过荧光团从细胞中漏出，导致荧光的快速降低而获得证明(图3A，框6)。通过这项判据，所述接触方案会“损伤”64±8%的被研究神经元(η = 36)。
我们使用非接触法产生了与使用接触法时观察到的那些反应类似的反应(An =8 ;大鼠η = 32)，但这时的刺激产生非常小的损伤。以非接触法刺激仅损伤2. 5±2. 5%的神经元(η = 40)(參见图5C)。图4示出了使用非接触方案对大鼠DRG神经元连续施加机械刺激，每次都使细胞膜凹陷3 μ m。每 次凹陷均升高[Ca2+] i (图4B和C)。初次刺激产生了比后续刺激更大的Ca2+反应。所给予的机械刺激是高度局部化的，不会干扰相邻的细胞(数据未示出)。图4D所示实例为经以下方式进行刺激的一个细胞的反应，即使用非接触方案用三个强度递增的连续机械刺激进行刺激。检测到了 [Ca2+] i的逐级升高。
图5比较了接触法和非接触法。我们计算了以[Ca2+] i升高的方式对MS作出应答的细胞的百分数；与非接触法相比，接触法在明显更多的细胞中引发了反应(图5A)。例如，使用SICM吸管对所述细胞膜进行3 μ m总位移的相似刺激，75%的细胞对接触MS (η = 16)作出反应，仅44%对非接触(η = 14)作出反应。另外，在使用接触法吋，[Ca2+]i的升高显著高于用非接触法(图5B)。然而，接触法产生了全或无类型的反应，而非接触法产生了分级的反应。使用接触法时[Ca2+]i的升高显示出几乎与刺激強度无关，而用非接触法时Ca2+反应的幅度依赖于刺激強度。形成I. 5 μ m和3 μ m凹陷的机械刺激诱发了不断増大[Ca2+]i升高，4·5μπι凹陷达最高值(图5Β)。
在培养自成年大鼠的DRG感觉神经元中，我们观察到通过机械刺激激活的全细胞内向电流。在使用接触法和非接触法时，机械刺激都诱发了具有瞬态分量和持续分量(transient and sustained component)的内向阳离子电流(图 6A 和 B),如 McCarter etal, Neurosci. Lett. 1999,273 :179-82 ；Drew et al, J. Neurosci 2002,22 RC228 ;和 Drewet al, J. Physiol. 2004,556 :691-710中报道的。接触法的应用是有局限的，这是因为细胞很快被破坏；或者膜片钳吸管移动，由于直接的物理接触而破坏了高电阻的膜片；以及/或者所述机械刺激的干扰。然而，非接触机械刺激可以被无限次重复，这是因为SICM探针和细胞之间没有直接接触，避免了损伤。图6示出了使用非接触法对电压钳处理的大鼠DRG神经元的3次连续机械刺激。所述SICM吸管使细胞膜凹陷Ιμπι，激活了具有瞬态分量和持续分量的内电流。同样地，所述接触方案激活了ー个相当的电流(图6Β)。使用Iym的机械刺激得到的这些结果与图5Β中所示的[Ca2+] i升高是一致的，其中对于给定的第二大的机械刺激，用接触法激活的全细胞峰电流(图6C) (342. 7±37. 8pA，n = 6)显著大于使用非接触刺激得到的全细胞峰电流(122. 1± 12. 4ρΑ，η = 4)。
为了确定在使用非接触法的刺激过程中所施加的压カ射流是否能够产生足以激活机械敏感离子通道的细胞膜位移，我们进行了对照实验以测量仅由压力射流产生的细胞膜位移。在使用最高比所述非接触刺激过程中使用的压カ高3倍的压カ时，我们观察到膜移动最长达500nm，而重要的是没有检测到全细胞电流的变化(图6D)。这意味着，当施加压カ且探针也移动了 Imm或以上时，不仅仅是压力自身，而是还有另外的位移使细胞膜产生更大的变形，并因此激活机械敏感通道。
人DRG感觉神经元的神经突非常细，直径小至数百纳米。使用先前的技术很难接近它们。在本文中，我们使用非接触法来研究直径约l_2um的树突对机械刺激的反应。在本文中，我们证明了这样的实例，即在两个直径2μπι的树突之间的交叉处施加机械刺激，所述两个树突来源自不同神经元的会聚(图7，箭头2)。所述SICM吸管接近膜，同时施加13kPa的压カ射流，使该表面移位750nm。荧光强度増加，从刺激点沿神经突以12 μ m/s的速度扩散开(图7，箭头I)，而其他神经突(图7，箭头3)中的荧光没有増加。
上文中描述的所有出版物的内容均通过弓I用 方式纳入本文。
权利要求
1.ー种用于检测表面上或表面处的结构变化，或者检测表面内或表面处的电变化或机械变化的方法，所述方法是通过使用扫描探针显微术测量所述表面的柔性或弾性实现的，所述方法包括使ー个扫描探针接近于所述表面，控制所述探针相对于所述表面的位置以保持恒定的距离，其特征在于通过流经所述探针的受调节的液流将压カ施加到所述表面上，随后监测所述探针的位置，其中所述探针的运动表明所述表面的随之发生的运动情况以藉此掲示所述变化。
2.根据权利要求
I的方法，其中将正压施加于所述表面上。
3.根据权利要求
I的方法，其中将负压施加于所述表面上。
4.根据前述权利要求
任ー项的方法，其中所述探针为微米吸管或纳米吸管。
5.根据权利要求
I的方法，其中所述表面是细胞结构或亚细胞结构。
6.根据权利要求
I的方法，其中所述表面是ー种液体的表面。
7.根据权利要求
6的方法，其中所述液体是ー种乳液。
8.根据权利要求
I的方法，其中所述表面是非生物结构的表面。
9.根据权利要求
I的方法，其中所述扫描探针显微术是扫描离子电导显微木。
10.根据权利要求
I的方法，用于监测所述表面内或表面处的电变化或机械变化。
11.一种用于诱导细胞中电生理变化或化学变化的方法，包括使ー个扫描探针接近于所述细胞表面，通过流经所述探针的受调节的液流将ー个确定的压カ施加到所述表面上，并监测所述细胞的电生理信号或化学信号的变化。
12.根据权利要求
11的方法，其中所述电生理信号或化学信号与存在于细胞上的离子通道有夫。
13.根据权利要求
11或12的方法，其中使用扫描离子电导显微术使所述探针接近于所述细胞。
14.ー种用于检测表面上或表面处的结构变化，或者检测表面内或表面处的电变化或机械变化的装置，包括一个扫描探针显微镜和ー种通过流经所述探针的受调节的液流将压力施加到所述表面上的压カ注入工具。
15.根据权利要求
14的装置，其中所述扫描探针显微镜是扫描离子电导显微镜。
专利摘要
一种使用扫描探针显微术来查验表面的方法，包括使一个扫描探针接近于所述表面，控制所述探针相对于所述表面的位置以保持恒定的距离，其特征在于通过流经所述探针的受调节的液流将压力施加到所述表面上，随后监测所述探针的位置，其中所述探针的运动表明所述表面的随之发生的运动情况。
文档编号G01Q60/44GKCN101517393 B发布类型授权 专利申请号CN 200780035662
公开日2012年10月10日 申请日期2007年8月1日
发明者D·P·桑切斯-赫雷拉, M·J·拉博, Y·E·科奇夫 申请人:离子显微有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan非专利引用 (1),