专利名称：用于对含有白蛋白的样品的白蛋白的转移特性变化进行esr－频谱测定的方法、实施此方 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种在医学、生物、生物工程和兽医学实践中应用的电子自旋共振(ESR)-频谱检测含有白蛋白的样品的白蛋白的转移特性变化的方法，该方法适用于诊断和检查人体和动物体内生理或病理的变化或用于对含有白蛋白的制剂，特别是血液制品的质量的检查。另外本发明的主题还包括实施本发明方法的ESR-频谱仪。
已知在诊断疾病时必须对在临床-化学常规检查中广泛应用的血液参数或涉及抗原、激素、酶和生物活性物质等加以考虑。
而且也可以应用NMR-和ESR-频谱检测血清中的蛋白-和脂肪成分的结构和功能特性进行疾病诊断。尽管在微分子已有技术中已经披露了在应用自旋标记的情况下应用ESR-频谱对转移过程进行研究，但由于设备费用高昂并且对信号的分析复杂和不可靠，所以这种测试方法迄今还不能广泛地应用于临床常规检查。
在SU 1319705A1中披露了一种用于诊断恶性肿瘤的方法，其中利用ESR对血浆或血清对自旋探针的键合能力进行测定。测定键合系数α，所述键合系数系峰值A振幅与峰值B振幅的比。当α＞1时，则涉及癌症。当α＜1时，则受检者是健康的。
所述方法的缺点是，该方法的灵敏度不够并因而不能提供可靠的诊断。对这种方法的调查表明，在初期患病阶段的虚-阳性和虚-阴性的诊断结果为≥30％。
EP0973043A1中披露了一种用于在血清中诊断恶性肿瘤的方法，其中在白蛋白的三个键合点测定一种表示自旋标记的脂肪酸的自旋试剂的自旋试剂的转移率的物理化学参数。
白蛋白是血液的转移系统中的主要成分，该成分将实现脂肪酸、色氨酸、胆红素、钙、类骨醇激素和其它对功能重要的活性物质向目标细胞的运送并且其中也参与多种毒素(其中也包括内源)的键合和分布。白蛋白是一种具有很大的对外源(药品)和内源物质键合能力的多肽(分子量68.000)。其由585氨基酸构成，所述氨基酸通过二氧化硫键被设置在一环结构内。在文献中对血清白蛋白上的各种键合点进行了区分。就脂肪酸而言，在白蛋白分子中有所谓的键合点1、2和3。
在采用EP0973043A1的诊断方法时是否患有癌症是根据自旋探针的键合参数是否偏离健康的受检者具有的值确定的。
即采用根据EP-0973043A1的ESR-方法测定的是血液中的白蛋白的具体的天然的形态，当患有癌症时，该形态将出现对应于健康受检者的形态的变化。经证明当存在血液中作用于白蛋白的附加的影响时，例如血脂值高、服用了药物或自旋探针溶剂的影响或由于在空气环境中对血液样品的保存，采用这种方法将得出虚-阳性或虚-阴性的结果。
本发明的目的在于提出一种用于进行对含有白蛋白的样品，尤其是血液样品的ESR-频谱测定的费用低廉和快速的方法，该方法在考虑到所述的影响对白蛋白形态的诊断结果是正确和可再现的并适用于临床-化学实验实践。
该方法应能实现对人体和动物体内的生理或病理变化的早期诊断和/或监视，对含有白蛋白的材料，特别是库存的血液进行质量检查，并对白蛋白分子的解毒能力进行判定。本发明的方法还在于提出一种有益的实施本方法的设备。
本发明的实现方案是利用ESR-频谱对待检样品中的白蛋白的转移特性的变化进行测定，其中利用极性试剂附加相应的自旋探针感应出待检样品中的目标的形态变化。经证明利用白蛋白形态的生物物理参数与自旋探针在特异性的白蛋白的已知的键合点键合的采用ESR测定的参数相关并可对人体或动物体上或也包括输血-或移植医学制剂中的生理或病理的变化得出最后可靠的结论。
根据本发明，对样品等份添加三种，优选达八种不同浓度的一种与白蛋白键合的自旋探针和附加至少三种不同浓度的一种极性试剂，借助掺加有自旋探针和极性试剂的样品等份的ESR-频谱，利用对ESR-频谱的计算机模拟测定根据自旋探针浓度和极性试剂的浓度的自旋探针的键合参数的变化并且根据对不同的浓度的自旋探针和极性试剂诱导的白蛋白的形态的自旋探针的键合参数值的变化计算出白蛋白的转移特性的变化，其中对有待添加的自旋探针的浓度进行选择，使自旋探针浓度与白蛋白浓度的比的平均值为2.5±0.5并且根据该平均值至少选出两种附加的浓度，所述浓度与该平均值的偏差不得少于1.0。选择的添加的极性试剂的浓度应使极性试剂在样品等份中的最终浓度为(0.6±0.25)·Cp，其中Cp为极性试剂的临界浓度，超过该临界浓度时将会导致白蛋白变性，并且以该平均值为基础至少选出两个极性试剂的浓度，所述浓度与该平均值的偏差至少为15％。
其中在给定的浓度范围内选出添加给某个样品等份的自旋探针和极性试剂的浓度，使其中至少一个等份内具有较少的探针浓度和较少的极性试剂浓度，至少在一个等份内具有较大的自旋探针浓度和较大的极性试剂浓度，并且至少在一个等份内具有中值的探针浓度和中值的极性试剂浓度(3-频谱-筛选-分析)。
优选还可以选择其它的浓度，在至少一个等份内具有较大的自旋探针浓度和较小的极性试剂浓度，并且特别优选的是在至少一个等份内具有较小的探针浓度和较大的极性试剂浓度(8-频谱-分析)。通过该浓度组合可以保证检测出在不同段内的白蛋白的转移特性，即在与疏水的化合物，例如脂肪酸键合时的生理状态(较小的探针浓度和较小的极性试剂浓度)、在血管系统中疏水化合物转移时的生理状态(较大的探针浓度和较小的极性试剂浓度)和在向靶细胞交出(卸载)疏水化合物时的生理特性(较大的探针浓度和较大的极性试剂浓度)。
根据SU1319705仅可以测定在天然状态的血浆或血清的键合系数并且根据EP 0 973 043 A1仅测定在被检血液样品中的白蛋白的具体的天然状态，而本发明的方法可以检测在极性试剂作用下白蛋白随的时间变化(形态转移特性)和随之的白蛋白的功能和白蛋白基质的键合参数的变化。由于这些变化可以在早期例如由于病理过程，例如癌变、由于医学治疗、由于吸毒、由于血浆组分的分离步骤和对血浆衍生物储存不当而造成的，所以根据本发明可以在白蛋白功能变化的早期阶段做出诊断结论。根据用于ESR-分析的介质的物理-化学特性，在血样中将改变白蛋白的形态并随之改变白蛋白系列基质的键合特性。
本发明的方法的特征还在于，利用ESR-频谱测定白蛋白，例如血液中的白蛋白的转移特性的变化(白蛋白功能)，其中在各种浓度的自旋探针存在的情况下，各种浓度的极性试剂将导致白蛋白分子有针对性的形态变化。优选建立在轴向各向异性的哈密顿函数基础上的数学模型对被各等份记录的频谱进行模拟，对实验频谱和模拟频谱进行比较并通过电子方式计算出在白蛋白的特异自旋探针键合点上的自旋探针的键合参数，优选通过这些键合点相对应的模型和实验测定的ESR-频谱的频谱值的差的平方最小化，其中将求出的自旋探针的键合的参数与白蛋白形态的生理参数相关并且分别视根据求出的参数的待诊断的生理或病理变化选出特异的参数并根据这些参数利用鉴别函数电子计算出作为判断标准的白蛋白形态的特异变性，即对在特异的病理和生理变化时白蛋白的形态的判决标准的极限值。
根据本发明可以采用一种与白蛋白可以产生特异键合的化合物作为自旋探针，尤其是具有自旋标记的脂肪酸、类固醇激素或者杂环碳氢化合物。而且用作为已知自旋探针的硝酰基加以标记的疏水化合物也可以在本发明方法中采用。在本发明的特别优选的实施方式中采用16-、5-、7-或12-脱氧-硬脂酸。在采用自旋标记的脂肪酸作为自旋探针时，可对在白蛋白的键合点1、2和3的自旋探针键合的参数加以测定。
极性试剂是醇或二甲化砜(DMSO)，其中优选的是C1-C6-醇，特别优选的是乙醇。
本发明所指的含有白蛋白的样品系指例如血液样品或含有白蛋白的药品-或制品的样品。
根据本发明用至少三种，优选也可以达八种的自旋探针浓度对ESR-频谱进行记录。例如用三种不同的浓度的每一种容积分别为50μl的16-脱氧-硬脂酸和用三种不同容积的一种极性试剂加入三个血清样品等份中，使在待检等份中的自旋探针的最终浓度分别为8.33*10-4摩尔/l、1.55*10-3摩尔/l和2.41*10-3摩尔/l和极性试剂的最终浓度分别为2.90摩尔/l、3.37摩尔/l和3.80摩尔/l(见表1)。
培养时间为7至15分钟，优选10分钟。在培养时应进行抖动。通常在37℃和在血液生理pH值对ESR-频谱进行记录。为了提高精度在样品在15至45℃的两种或多种不同的温度值和/或在血清样品的7.5至3.5的两种或多种不同的pH值对频谱进行记录。
对测出的ESR-频谱借助为分子-转移性-结构分析(MMS)专门研制的计算机软件进行电子分析。在至少三个，优选八个含有白蛋白样品的等份的基础上，优选在一种血清-或血浆样品的等份基础上记录的ESR-频谱被输入计算机软件中，以便计算出在各种键合点上自旋探针参数。根据ESR-频谱模拟对自旋探针键合参数进行分析。一种优选建立在具有轴向各向异性的哈密顿函数的ESR-频谱模型用于对实验获得的ESR-频谱进行模拟。在白蛋白中的自旋探针键合参数通过将模拟的和实验获得的如在EP 0973043A1中所述的ESR-频谱的差的平方的最小化实现对模拟的描述。
对各种键合点分别进行参数计算。通过ESR-频谱模拟计算出对在白蛋白分子的键合点上的自旋探针的键合加以说明的参数。一种优选建立在具有轴向各向异性的哈密顿函数基础上的自旋模型被用于计算频谱每一部分。所述计算如在EP 0973043A1，第4页下面至第7页的上面中所述进行。
在对自旋探针的ESR-频谱的数学处理时将采用上述计算机程序。所述程序实施所述的数学算法。处理ESR-频谱的时间少于15秒钟。
作为每一个ESR-频谱的模拟计算的结果对三个白蛋白键合点获得的数值范围为48个键合参数。每个参数具有对应于被键合在白蛋白分子上的自旋探针分子的状态的特异的离散，所述被键合的自旋探针分子反映白蛋白分子的形态状况。总体上将对采用16-脱氧-硬脂酸作为自旋探针的情况由数值范围内选出表2的17个参数，所述参数将对白蛋白形态状况进行特异的说明。
表2的17个参数构成的组对键合在白蛋白键合点上的自旋探针分子的状态加以说明，所述自旋探针分子在键合点的键合特性的作用下以生理参数的形式反映出白蛋白分子实时的的形态状况。
由求出的17个参数构成的组计算出表3的各等份的自旋探针分布-和转移参数，其中由自旋探针组C1至C3的相对浓度参数通过将C1至C3与脂肪酸(F5)与血清白蛋白(SA)的浓度的比相乘计算出被键合在键合点的相对数量的自旋探针分子N1至N3的分布特性。
根据表3的公式计算出被固定在白蛋白键合点上的自旋探针分子的转移特性，其中根据高频-结构A1或A2的各向同性的常数计算出键合点1和2的微环境的极性系数。根据高频-结构A1或A2的各向同性的常数和高频-结构δA1或δA2的各向异性计算出定向系数S1和S2。根据频谱线的宽度WL、WM和WH计算出相关时间T’2和T”2。
其中根据自旋探针的浓度和极性试剂的浓度的变化采用对等份中自旋探针的的键合参数的比回归算法确定白蛋白的键合参数。作为白蛋白的键合特性等份的键合参数组由下述构成·KB＝键合常数，·N20＝脂肪酸键合点1的容量和·CP＝极性试剂的临界浓度利用在相对数量的被键合在脂肪酸键合点上的自旋探针分子(N1、N2、N3)与极性试剂(C)的浓度的比的回归根据下式I计算出N3=1KB·CP·N1(CP-C)·(N10-N1)---(I).]]>利用相对数量的被键合在脂肪酸键合点的自旋探针分子(N1、N2、N3)与极性试剂(C)的浓度的比的回归根据公式II求出作为各个等份的其它的键合参数的参数·R2＝在白蛋白天然状态下的脂肪酸键合点2与1的容量比，·K2＝脂肪酸键合点2的灵活系数和·L2＝白蛋白的形态稳定性的极限，N2＝R2·N1·(1+K2·C·(L2-N1)) (II)。
公式(I)和公式(II)对白蛋白分子的脂肪酸键合点的系统形态稳定性的模型做了描述，所述模型是在大量的实验研究的基础上提出的。
由针对等份计算出的白蛋白键合参数组，根据在制备等份时所采用根据表4的实验条件，计算出白蛋白的转移特性的变化。优选采用的实验条件可实现对特性的计算，所述特性决定用脂肪酸对白蛋白的加载(KL、NL0-实验条件C＝0，脂肪酸/白蛋白的比＝0.5)、脂肪酸的转移(NT0、KT-实验条件C＝0，脂肪酸/白蛋白的比＝1.5)和脂肪酸的卸载(DU、NU0-实验条件C＝3.37M，脂肪酸/白蛋白的比＝1.5)。这些特性根据下述公式计算出积分键合常数＝KL＝Kn*(N10+N20)，有效加载容量＝NL0＝(N10+N20)，有效转移容量＝NT0＝(N10+N20)，积分转移键合常数＝KT＝KB*(N10+N20)，离解常数＝DU＝1/KB，有效卸载容量＝NU0＝(N10+N20)。
本发明所述的ESR-方法适用于对人体或动物体内的生理或病理变化的诊断和/或监视，例如用于对癌症的早期诊断。在对疾病或生理变化进行诊断时针对在至少三个具有不同浓度的自旋探针和极性试剂分析的基础上的ESR-筛选-分析分别将表2的特定的键合参数带入鉴别函数内，以便确定对某个待诊断的疾病或病理变化的极限值并与基准样品的极限值进行比较。
例如在诊断癌症时根据表5求出参数Di。其中参数D1-D6中的任何一个参数足以满足实现可靠的诊断。为了进一步提高诊断结论的可靠性，宜对其它参数，尤其是D2、D3、D5、D6或所有六个参数Di加以确定。当其中的一个参数Di＞1时，则白蛋白的形态受到破坏并且例如涉及肿瘤。当Di＜1时，则受检者未患肿瘤。
本发明诊断方法的高的诊断准确性在212名患有癌症的患者和87名未患有癌症的患者身上得到了验证(见表6)。
表6表明本发明ESR-方法的高的诊断精确性为90％。可以在患病的最初期阶段实现对癌变的诊断。并且分别利用D2、D3、D5或D6的计算甚至可以实现达约95％的较高的诊断准确性。
因此对血液样品的ESR-分析可以实现对癌症和其它病症的诊断或甚至在患病的最初期阶段实现对生理变化的诊断。白蛋白的转移功能的变性是基于在白蛋白的特异脂肪酸键合点上的阻塞，该阻塞在患病初期已经出现。该键合阻塞是由于为完成正常的转移任务的白蛋白功能和白蛋白键合特性被完全破坏掉，但对提供新血浆的功能并未被破坏，因而存在癌细胞生长的前提。在脂肪酸键合点上的阻塞将导致明显地减少对正常细胞的提供并将导致免疫系统的破坏。而采用目前的临床-化学常规诊断的方法是不可能检测到这些变化的；只有利用本发明的ESR-方法才能对机体对癌扩散的最初的反应加以确证。
本发明的方法既可以用于在生产含有白蛋白的药剂时作为过程中检查参数，又可以用于测定和检验含有白蛋白的制剂，优选血液-或血浆制品的质量，其中将本发明特定的白蛋白转移特性的变化代入与原材料和/或健康受检者的天然的血清白蛋白的转移特性的关系式中。本发明方法的应用还包括对各种不同的用于去除与分子结合在一起的配体对白蛋白提纯的方法的效率的测定并包括诸如采取与原材料和提纯的含有白蛋白的材料比较的抽血和去除内毒素的血液透析等方法。
本发明的方法费用低廉并且节省时间。本发明可实现对各种ESR-频谱的自动测定。得到三个样品等份的每次筛选实验的结果不到10分钟，对八个样品等份的综合ESR-分析仅需要大约24分钟。
本发明的主题还包括实施本发明方法的实验器具，所述器具包括一个微滴定板，所述微滴定板含有固定的、稳定的、精确剂量的、必要的不同浓度的自旋探针和极性试剂。实验器具也可以仅包括在一提取容器内，例如密封试管内的精确剂量的自旋探针和极性试剂，所以在实验室内仅需要将预剂量的量加入待检测样品的等份内。
本发明的主题还包括实施本发明方法的频谱仪和实现ESR-频谱记录的高精度、稳定度和灵敏度的方法。本发明的ESR-频谱仪作为自动ESR-分析仪满足现代临床实验室内使用简便和可靠的要求，其中自动设备控制、信号寄存和与用于测量数据的诊断分析的计算机程序相配合的信号分析被综合在一起。
如
图1所示，用于实施本发明方法的ESR-频谱仪1由一个具有霍耳稳定系统2的加以屏蔽的结构紧凑的电磁铁；一个测量共振器3，所述测量共振器与零差超高频单元5耦合；一个设备控制-和一个信号寄存单元9和一个检测样品的恒温器调节系统7。
设备控制-和信号积存单元9由两个单扳机(图中未示出)构成，其中的一个单扳机作为自动调谐和稳定的系统控制器10，而第二个单扳机作为ESR-信号处理器11，产生频谱的扫描-算法、对信号数据累加、数字滤波和记录。
为对ESR-频谱进行记录，将检测样品插入共振器3的测量竖井内，其中由超高频单元5的主振荡器发射超高频-电波。利用作为超高频-辐射源的零差波导单元对ESR-信号进行测量，其中所述超高频-辐射被测量共振器3反射。
由电磁铁2产生用于激发ESR-信号所需的磁场。由一ESR-信号处理器11对电磁铁2的电压源6进行调整。
由设备控制单元10对超高频-单元5进行调整，所述设备控制单元可实现对具有超高频-单元5的主-振荡器的测量共振器3的频率的微调，对检测样品的恒温器调整7进行控制并将ESR-频谱仪1与操作人员用于频谱仪控制和数据分析的个人计算机8耦合。
已知的ESR-频谱仪仅包含一个用于发生器-或谐振频率调谐的调谐件，其中仅利用发生器的调谐实现在很大的频率范围的调谐，而谐振器的调谐仅对小的频率范围进行调整，为此实现在测量各种样品时的稳定的频率，与此相反，本发明的频谱仪配备有两个耦合的控制设备，其中的一个用于发生器频率，第二个用于谐振频率。为了一方面可以实现用于检测各种和各种形式样品应用大的带宽并且同时实现根据本发明的方法对等份样品检测时的ESR-频谱的特性绝对必要的重合和再现性，此点是必要的。
其中的一个控制设备安装在超高频-单元5的主-振荡器上，用于对200-400兆赫，优选为300兆赫，中心频率为9.45±0.5千兆赫的频率调谐。第二个控制设备安装在测量共振器3上，用于利用借助发动机驱动的连杆的谐振腔容积的变化实现对在范围为10-50兆赫，优选30兆赫的谐振频率的调谐。
只有当谐振频率调谐范围不够时，才在调换检测样品后对超高频-单元5的主-振荡器进行平衡。在调换检测样品类型的情况下或在基本改变样品制备过程的情况下将出现此类问题。
在检测一组相同类型的样品时，实际上用超高频-频率对其频谱进行记录。在此情况下，基本-(背景-)频谱线对所有被记录的频谱都是相同的，此点对接着进行的被检测的目的物的特性的计算的精确度是特别重要的。
恒温器调节系统7用于以高的精度将样品温度稳定在30℃至50℃范围内。
与已知的ESR-频谱仪不同的是，本系统7包括一个以附加的图中未示出的调节环路形式的的分系统。恒温器调节系统7的通常调节环路由一个对温度进行调节的气流构成，所述气流分别根据需要将预热的或预先冷却的风吹入共振器竖井内，实现对样品安錇的调节。
恒温器调节系统7的附加的调节环路用于通过减少共振器竖井内的反差度实现对样品温度的稳定性的精密的提高。为此共振器体3利用自动加热的磁铁通过其热辐射被预热到具体的样品温度上。为此利用一温度传感器4对共振器体3的温度进行测量。当中断频谱记录时为此将电磁铁2的电压源接在增大的或减少的值上。被屏蔽的紧凑的电磁铁2的结构和大的质量附加保证了共振器3与环境影响的热隔离。
与已知的频谱仪相比，为根据本发明的方法利用ESR-频谱模拟对ESR-频谱进行分析，需要提出一种专门用于数字滤波的方法，以便利用模拟对频谱参数进行计算，确保对频谱以精确的形式进行记录，这是因为与已知的方法相比，必须减少在对信号噪声和脉冲干扰滤波时以及由于对噪声的抑制而出现的测量信号中的相关，以便通过保证ESR-频谱记录所需的高的精度、频谱仪的稳定性和灵敏度实现用于本发明方法的本发明的频谱仪的应用。
为此ESR-信号处理器利用对电压源的调节产生频谱扫描的算法。
利用一频率为10千赫的模/数转换器对由超高频-单元5读出的ESR-信号进行转换并在信号处理器11的存储器中进行累加。
由于通常频谱扫描时间大于1分钟并且频谱点的数量少于10,000，所以每个频谱点是由60或60以上的信号读出产生的。
如果不考虑到此点，由于ESR-频谱仪是一个对电磁干扰或机械振动会做出反应的超灵敏的仪器，则累加出的频谱读数的特定部分往往是错误的。
与已知的ESR-频谱仪相比，本发明的高的灵敏度和稳定性是通过如下方案实现的，采用计算每个频谱点的专用的算法，其中对每个频谱点对ESR-信号Si的N个记录进行累加，利用一专门的加权系数ki相加，该系数与相应记录的测量误差的平方成反比。
作为读出Si与其它(N-1)读出的算术平均值之间的差计算出第i个误差ΔiΔi=1N-1(Σp=1NSp-Si)-Si]]>ki=1(Δi)2=(N-1)2/(Σp=1NSp-Si·N)2]]>得出的用于计算信号点的表达式为S=(Σi=1Nki·Si)/(Σi=1Nki)]]>当读出Si包含有一个脉冲噪声时，误差值Δi将增大(例如增大十倍)并且相应的加权系数ki将减小多倍(例如一百倍)。这样与已有的频谱仪相比，在本发明的ESR-频谱仪中将从频谱信息的记录中排除掉具有脉冲噪声的读出。该算法对频谱的每一个测量点的累加都是适用的。
其结果是可以实现记录的ESR-频谱的高的灵敏度和稳定性。同时还防止了相邻频谱点之间附加的相关的形成，该相关在已知的对ESR-信号滤波的方法中构成利用频谱模拟测定频谱参数的精度降低的主要原因。
利用一专用的ESR-软件(MMS)对获得的ESR-频谱进行分析，其中用于ESR-筛选-分析的程序产生用于测量三个等份的测量算法，并且根据分析的规定利用表5的鉴别函数得出结果。
在实施综合ESR-分析时，程序产生为为五个直至优选八个等份的测量算法，在应用回归算法根据测定白蛋白的转移特性的规定得出结果。
程序保证了对样品测量和分析简单自动的实施，而不需要对测量人员进行专门的培训或再培训。
下面将对照实施例对本发明做进一步的说明例1利用ESR-筛分分析(3-频谱分析)对肿瘤患者和健康患者进行检查利用血液离心分离获取血清并将血浆分成三等份。对这些分别为50μL的血清样品分别掺入10、12、14μl的乙醇自旋探zhen溶剂(自旋探针最终浓度8.33×10-4摩尔/L、1.55×10-3摩尔/L和2.41×10-3摩尔/L)。对制备好的混合物在37℃在连续抖动的情况下培养10分钟。
在对制备好的样品培养后将样品输入三根毛细管。在恒定的温度37±0.2℃的情况下对ESR-频谱仪的共振器中的每个毛细管的ESR-频谱加以记录。
每个被记录的ESR-频谱是固定在各个键合位置的自旋探针分子的具体频谱的叠加，所述频谱具体地说是长链脂肪酸的。这些键合位置设置在被检测的血清中的血清白蛋白内。
三个被记录的ESR-频谱被加入计算机中，以便对自旋探针键合的参数进行计算。利用上述对ESR-频谱模拟的方法对每个键合位置分别进行分析。
表7和图2包含对检测患有和未患癌症的几名患者的血清白蛋白中(16-DS)-自旋探针参数的测定举例。I.患有癌症的患者1.患者，检验编码506临床诊断食道癌2.患者，检验编码507临床诊断胃癌3.患者，检验编码528临床诊断乳腺癌4.患者，检验编码529临床诊断肺癌II.未患癌症的患者1.患者，检验编码110，42岁临床诊断弥散性乳腺病，未有癌组织征兆2.患者，检验编码111，23岁临床诊断健康3.患者，检验编码，22岁临床诊断健康4.患者，检验编码113，40岁临床诊断风湿性心脏病表7和图2表明对癌症患者和未患癌的患者检测出的的自旋探针的键合参数只有在极性试剂的醇浓度较高的情况下才能加以区分(血清样品B和C)。该区别表明癌症患者的血液样品的血清分子的形态转移性的特异变性。例2对健康公众(妇女和男人)的天然血浆中白蛋白转移功能的综合ESR-频谱分析(3-和8-频谱分析)对每50μL容量的血清样品分别用三种，典型值为八种浓度的16-脱氧-硬脂酸-自旋探针(溶解在乙醇中)加以混合，从而实现自旋探针最终浓度为0.83×10-3摩尔/L至/和2.34×10-3摩尔/L和乙醇最终浓度为1.86摩尔/L至/和3.8摩尔/L。血清样品的PH值在与自旋探针混合后为7.4±0.05。对制备好的混合物在连续抖动温度为37℃的情况下培养10分钟并且在玻璃毛细管中培养后进行ESR-频谱记录和分析。在本发明的ESR-频谱仪中进行频谱记录。在保持恒定温度37±0.2℃的情况下对在ESR-频谱仪的共振器中的每个毛细管的ESR-频谱进行记录。在综合ESR-分析仪中利用本发明的计算机软件对每个样品所有被记录的ESR-频谱(3和8个频谱)计算出自旋探针键合。在对实验获得的各种自旋探针的ESR-频谱模拟时采用了一个ESR-频谱模型(具有轴向各向异性的哈密顿函数)。血清白蛋白中的自旋探针键合的参数通过对模拟和实验获得ESR-频谱之间差的平方的最小化对模拟进行描述。对每个键合点分别进行分析并通过计算机程序产生白蛋白功能和形态特性。
在表8中给出作为无伤的白蛋白转移功能举例的健康的血液-和血浆供者的天然血清中的白蛋白转移功能的参数。利用综合ESR-频谱分析得出这些健康受检者的血清样品中未见异常。例3对患有血液系统疾病(骨髓组织增殖、慢性淋巴细胞造白血细胞增殖(CML)、浆细胞增多)患者的天然血清中的白蛋白转移功能的扩展的ESR-频谱分析(3-频谱-和3-D-分析)利用血液离心分离获取血清并将血浆分成三等份。对这些分别为50μL的血清样品掺入10、12、14μL乙醇自旋探针溶剂(自旋探针最终浓度8.33×10-4摩尔/L、1.55×10-3摩尔/L和2.41×10-3摩尔/L)。对制备好的混合物在37℃在连续抖动的情况下培养10分钟。
在培养好制备的样品后，将这些样品导入三个毛细管中。在恒定温度为37±0.2℃的情况下对在本发明的ESR-频谱仪共振器中的每个毛细管进行ESR-频谱记录。将所记录的三个ESR-频谱加在计算机中，以便计算出自旋探针键合的参数。利用上述的ESR频谱模拟的方法采用本发明的计算机软件对每个键合点分别进行分析。
采用ESR-筛选可以检测出恶性的血液系统疾病。在表9中列出患有CML的5名患者的血清样品的和3名患有浆细胞增多的患者的鉴别参数。通过鉴别函数D1-D5可以得出存在致癌疾病的印象，此存在也在脂肪酸键合点的3-D-分析中表达出。例4对含有白蛋白的药剂样品的白蛋白转移功能进行扩展的ESR-频谱分析(3-频谱-和3-D-分析)，以便进行质量检查对每份容量为50μL含有白蛋白的药剂(白蛋白溶液、冷冻新鲜血浆)分别用用三种，典型值为八种不同的浓度的16-脱氧-硬脂酸-自旋探针(溶解在乙醇中)进行混合，从而实现自旋探针最终浓度为0.83×10-3摩尔/L至/和2.34×10-3摩尔/L和乙醇最终浓度为1.86摩尔/L至/和3.8摩尔/L。血清样品的PH值在与自旋探针混合后为7.4±0.05。对制备好的混合物在连续抖动温度为37℃的情况下培养10分钟并且在玻璃毛细管中培养后进行ESR-频谱记录和分析。在本发明的ESR-频谱仪中进行频谱记录。在保持恒定温度37±0.2℃的情况下对在ESR-频谱仪的共振器中的每个毛细管的ESR-频谱进行记录。在综合ESR-分析仪中利用本发明的计算机软件对每个样品所有被记录的ESR-频谱(3和8个频谱)计算出自旋探针键合。在对实验获得的各种自旋探针的ESR-频谱模拟时采用了一个ESR-频谱模型(具有轴向各向异性的哈密顿函数)。血清白蛋白中的自旋探针键合的参数通过对模拟和实验获得ESR-频谱之间差的平方最小化对模拟进行描述。对每个键合点分别进行分析并通过计算机程序产生白蛋白功能和形态的特性。
在制备含有白蛋白的药剂时，对白蛋白转移功能进行的扩展的ESR-频谱分析(3-频谱-和3-D-分析)适用于质量-和中间过程检验。表10和11示出对采用不同方式获得的(全血血浆与Apherese-血浆)和处理的(过滤的＝去除白细胞的)血浆制品(表10)，以及对无伤的和变形的白蛋白(表11)进行3-和8-频谱分析时伴随过程的对ESR-技术的应用。很明显可以对最终产品(例如白蛋白、用于输血的冷冻的新鲜的血浆)的白蛋白的转移功能的能力进行评价，但也可以就白蛋白转移性能质量的影响对制作过程的各个阶段进行分析。表1自旋探针(16脱氧硬脂酸)和极性试剂(乙醇)的优选浓度1.ESR-筛选-分析
2.综合ESR-频谱分析
为对图像进行描述通过程序加入一个带有最终浓度的点(P0)P0＝白蛋白天然形态的实验极限值*＝血清或生理血浆35-45g/l**＝极性试剂乙醇值图3示出等份的浓度分布矩阵(例如在BS-2中自旋探针分子的相应的数量)。表2由ESR-频谱测出的16-DS-自旋探针参数及其与白蛋白形态和功能特性的相关
*注由于在键合点的自旋探针的频谱的第三部分与低的亲和力相关，所以其其它的特性是不重要的。表3 表4对白蛋白的转移特性的参数的测定 表5鉴别功能举例
*参数C1、C2、C3分别是键合点1、2和3上的相关自旋探针浓度的值。根据下式计算出极性系数P2，P2＝1.47333/A2(mT)，其中A2表示脂肪酸键合点2的各向同性的HFS-常数。符号A、B和C分别表示如下的被检测的血液样品的测量的血清样品的一个系列的样品编号A-自旋探针浓度为8.3*10-4摩尔/l的血清样品B-自旋探针浓度为1.61*10-3摩尔/l的血清样品C-自旋探针浓度为2.34*10-3摩尔/l的血清样品。系数K1至K6取决于对尽可能大量的癌症患者和健康人血清白蛋白的参数的所采用的反应物的具体浓度和扩展的结果和数据的精密度。系数K1至K6例如可取K1＝7.843 K2＝-1.517 K3＝6.3 K4＝1.881 K5＝3.009 K6＝1.002。表6根据在对212名癌症患者(胃癌、食道癌、直肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌)和87名没有患有癌症的患者的临床检测结果中的鉴别功能的实验诊断精确度
表7在实旋例中和表3中列举的患有癌症和没有癌症的患者的白蛋白的具体的键合点上的自旋探针的键合参数
对每名患者通过对三个分别用A、B、C标示的血清样品进行的ESR-分析对所示参数进行确定。对样品A、B和C分别用10μl、12μl和14μl的自旋探针的乙醇溶液加以混合(自旋探针浓度8.33*10-4摩尔/l、1.55*10-3以及2.41*10-3摩尔/l)。所示参数为C1-键合点1上相关的自旋探针浓度；C2-键合点2上相关的白旋探针浓度；C3-键合点3上相关的自旋探针浓度。表8健康的患者的ESR-参数(16名男性，18名女性)白蛋白功能的筛选参数
脂肪酸键合点的物理-化学特性
白蛋白-转移、-加载和-卸载的系数
表9白蛋白功能的筛选参数
表10经不同方式获得的和处理的血浆制品(冷冻的新鲜血浆)的ESR-参数
表11无伤的和变性的白蛋白溶液白蛋白功能的筛选参数
在图1中1ESR-频谱仪2电磁铁3测量共振器4温度传感器5超高频单元6电压源7恒温器调节系统8PC-机9设备控制和信号积存单元10 设备控制单元11 信号处理器图2示出作为乙醇对白蛋白分子形态影响结果的患有和未患有癌症的患者的血清蛋白中导致的自旋探针的键合参数的变性，A)血清样品含有50μL的血清、浓度为0.5*10-2摩尔/L的10μL乙醇自旋探针溶液，和自旋探针浓度为8.33*10-4摩尔/L。
B)血清样品含有50μL的血清、浓度为0.8*10-2摩尔/L的12μL醇自旋探针溶液，和自旋探针浓度为1.55*10-3摩尔/L。
C)血清样品含有50μL的血清、浓度为1.1*10-2摩尔/L的14μL醇自旋探针溶液，和自旋探针浓度为2.41*10-3摩尔/L。
图3为自旋探针(16-脱氧-硬脂酸)和极性试剂(乙醇)的优选浓度。
权利要求
1.一种用于对含有白蛋白样品的白蛋白的白蛋白的转移特性的变化的ESR-频谱测定的方法，其中对等份的样品添加三种不同浓度的一种与白蛋白键合的自旋探针和附加至少三种不同浓度的一种极性试剂，在待检测的样品中诱导产生白蛋白分子的有针对性的形态变化，借助掺加有自旋探针和极性试剂的等份样品的ESR-频谱，利用对ESR-频谱的计算机模拟，测定根据自旋探针浓度和极性试剂的浓度的自旋探针的键合参数的变化并且由不同的浓度的自旋探针和极性试剂诱导的白蛋白的形态状态，根据自旋探针的键合参数值的变化计算出白蛋白的转移特性的变化，其中对有待添加的的自旋探针的浓度进行选择，使自旋探针浓度与白蛋白浓度的比的平均值为2.5±0.5并且根据该平均值至少选出两种附加的浓度，所述浓度与该平均值的偏差不得少于1.0，并且选择的添加的极性试剂的浓度应使极性试剂的最终浓度为(0.6±0.25).Cp，其中Cp为极性试剂的临界浓度，超过该临界浓度时将会导致白蛋白变性，并且以该平均值为基础至少选出两个极性试剂的浓度，所述浓度与该平均值的偏差至少为15％，其中在给定的浓度范围内选出添加给样品等份的自旋探针和极性试剂的浓度，使其中至少一个等份内具有较少的探针浓度和较少的极性试剂浓度，至少在一个等份内具有中值极性试剂浓度和中值探针浓度并且至少在一个等份内具有较高的探针浓度和较高的极性试剂浓度。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，对自旋探针和极性试剂附加的其它的浓度组合进行选择，使在至少一个等份内具有高的探针浓度和低的极性试剂浓度。
3.按照权利要求2的方法，其特征在于，对自旋探针和极性试剂附加的其它的浓度组合进行选择，使在至少一个等份内具有低的探针浓度和高的极性试剂浓度。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，采用一种血液样品或一种药品样品作为含有白蛋白的样品。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，采用一种化合物作为自旋探针，所述化合物接受与白蛋白的特异键合，优选是自旋标记的脂肪酸，特别优选的是脱氧硬脂酸。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，极性试剂是醇或二甲化砜(DMSO)，优选是乙醇。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，在15至45℃的各种温度和/或为7.5至3.5的各种pH值的情况下，对血液样品的等份的自旋键合参数进行测定。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，根据自旋探针的浓度和极性试剂的浓度的变化采用对自旋探针的键合参数的比例的回归算法对白蛋白的键合参数进行测定并根据该键合参数计算出白蛋白的转移特性的变化。
9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法用于在人体或动物体内的生理或病理的变化进行诊断和/或监视，其中根据求出的白蛋白的键合参数，视有待诊断的生理或病理的变化测定特异参数，优选测定等份间的脂肪酸键合点上的相对自旋浓度C1、C2、C3的比例并将此比例与利用鉴别函数求出的基准样品的极限值进行比较。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法用于对癌症的诊断和/或监视。
11.按照权利要求10所述的方法，其特征在于，求出根据表5的一个或多个参数Di，当一个参数Di＞1时，则患有癌症。
12.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法用于对含有白蛋白的药剂，优选对血液-或血浆制品的质量进行测定和检查，其中根据权利要求1确定的白蛋白的转移特性的变化被代入与原始材料和/或健康受检者的天然血清白蛋白转移特性的关系式中。
13.用于实施按照权利要求1至12的方法的实验器具，由一具有多个孔的塑料板构成，优选一个微滴定管，其孔包含有固定的稳定的并且精确剂量的不同浓度的自旋探针和极性试剂。
14.用于实施按照权利要求1至12的方法的实验器具，包括在实验容器内的精确剂量的浓度的自旋探针和极性试剂。
15.用于实施按照权利要求1至12的方法的的ESR-频谱仪，由具有霍耳稳定系统(2)的加以屏蔽的结构紧凑的电磁铁；一个测量共振器(3)，所述测量共振器与超高频单元(5)耦合，所述超高频单元具有一个主震荡器，所述主震荡器用于在中频为9.45±0.5GHz的第一范围200至400MHz内进行频率调谐；一个设备控制-和一个信号寄存单元(9)和一个检测样品的恒温器调节系统(7)构成，其中针对检测样品的等份的频谱寄存时的频率差的补偿对测量共振器(3)进行调整，测量共振器(3)与另一个控制器耦合，对在第二频率范围10至50MHz内利用共振器空腔变化进行谐振频率调谐。
16.按照权利要求15所述的频谱仪，其特征在于，恒温器调节系统(7)具有一个附加的调节环路，所述环路通过电磁自动加温减少共振器竖井内的梯度从而精确的提高样品温度的稳定性，在中断频谱扫描时通过对电磁铁电流馈送的调节实现对自动加热的控制，热辐射对共振器加热。
17.按照权利要求15和16的ESR-频谱仪，其特征在于，共振体(3)与一个温度传感器(4)连接，所述温度传感器用于对电磁铁的电磁自动加热进行调节，使共振器被加热到具体的样品温度上。
18.一种利用根据权利要求15至17所述色ESR-频谱仪实现ESR-频谱记录高精度、稳定性和灵敏度的方法，其特征在于，在信号寄存单元(9)被寄存的信号数据被处理，以便通过对ESR-频谱的计算机模拟实现高的精度，其中通过对记录的ESR-信号的数字滤波减少在对信号噪声和脉冲干扰滤波时出现的信号数据相关，其中利用一个专门的算法实现了对每个频谱点的计算，根据此算法将ESR-信号Si的N个记录累加并与一加权系数系数ki相加，其中加权系数与相应记录的测量误差的平方成反比，其表达式如下ki=(N-1)2/(Σp=1NSp-Si·N)2]]>和S=(Σi=1NkiSi)/(Σi=1Nki)]]>
全文摘要
本发明涉及一种在医学生物学、生物工程学和兽医学实践中用于对含有白蛋白的样品的白蛋白的转移特性变化进行ESR－频谱测定的方法，用于对人体和动物体中地热生理和病理变换进行诊断和/或控制，对含有白蛋白的制剂，尤其是血液制品的质量进行检查。本发明的主题还包括实施本发明方法的ESR－频谱仪，该仪器作为自动分析仪使用简便可靠满足现代临床实验条件的要求，其中自动设备控制、信号寄存和与计算机程序配合进行测量数据的诊断分析的信号分析综合在一起。
文档编号G01R33/31GK1418314SQ01805754
公开日2003年5月14日 申请日期2001年2月28日 优先权日2000年2月28日
发明者伏拉迪米尔·姆拉夫斯基, 亚利山大·米卢亭, 格尔特·A·马休斯, 京特·塞伯特 申请人:E.W.商贸和咨询有限公司