β细胞毒性大环内酯的化验的制作方法

专利名称：β细胞毒性大环内酯的化验的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种评估方法，该方法被用来评估植物如果被食用对哺乳动物糖尿病的发病和病情发展造成影响的倾向性，并且更特别地是涉及一种评估方法，该方法被用来评估块茎蔬菜如果被食用对哺乳动物糖尿病的发病和病情发展造成影响的倾向性。本发明的方法用于鉴定由于饮食的摄入而易患糖尿病的哺乳动物等方面。本发明还涉及个体患糖尿病的危险程度的评估方法。本发明还进一步提供了用于预防和/或治疗糖尿病的方法。
本发明的技术背景本说明书中被作者引用的出版物目录清单被附在说明书的后面。
该说明书中的任何现有技术参考文献不应被认为那些现有技术在澳大利亚构成了部分公知常识。
糖尿病的特征是由于碳水化合物代谢紊乱而引起血液和尿液中的葡萄糖浓度增高。尤其是由于胰岛素分泌减少而满足不了需要而导致人体不能适当代谢葡萄糖。胰岛素由胰腺胰岛中的β-细胞产生而且胰岛素使得人体能够利用葡萄糖作为能源。当这一过程不能进行时，人体就通过利用其它能源如储存的脂肪作为补偿。然而，由于进行过度的脂肪代谢而导致血流中的葡萄糖浓度的迅速增高和酮的积累。如果不进行处理，这些事件能够导致危及生命的病症出现，该病症被称作“糖尿病酮酸中毒”。
糖尿病通常被分为1型糖尿病和2型糖尿病这两种。1型糖尿病(由于在儿童期或青春期发病而通常被称作幼发糖尿病)是一种由于胰腺胰岛中的产胰岛素的β-细胞遭到选择性破环而引起的衰弱性自身免疫病症。该病症的发病是突然的而且通常在20岁前发病。然而，目前1型糖尿病在成年人中的发病率正在增高。该疾病的特点是β-细胞功能缺乏以及不产生胰岛素，因此需要进行胰岛素治疗。然而2型糖尿病的特点是通常在35岁以上的个体中逐渐发病并且经常伴有肥胖和其它代谢紊乱。通常无明显症状出现。该病症的特点是β-细胞功能异常。
尽管1型和2型糖尿病在病原学上有差异，但是该两种糖尿病的早期都发现胰岛素分泌缺陷。2型糖尿病的一个特有特征是胰岛素原及其部分切割产物的分泌增加(Temple等，1989)。尽管也有人提议可能是由于固有β-细胞缺陷的作用优先于胰岛素阻力或与胰岛素受阻同时发挥作用(Porte，1999)，但是这可能是由于外周和肝脏胰岛素阻力而导致β-细胞的代谢压力和胰岛素原的过早释放从而增加了对胰岛素的需要程度所造成的。胰岛素原分泌的增强也发生在1型糖尿病的临床前阶段(Chaillous等，1996；Roder等，1994；Lindgren等，1991)。在胰岛炎和明显糖尿病发作之前，在1型糖尿病的小鼠模型体内，即非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠体内β-细胞对葡萄糖的应答发生了改变并且血胰岛素增多(Amrani等，1998)。在1型糖尿病的临床前阶段中，没有发现人体和NOD小鼠体内存在着胰岛素阻力或血糖过多。而且，胰岛素分泌缺陷具有自身免疫基础，即是固有性质的，具有与β-细胞暴露于细胞因子时诱导一氧化氮合成有关的炎症背景(Arnush等，1998；Corbett等，1992；Hostens等，1999；Rabinovitch，1998；Sjoholm，1998)。
虽然与1型和2型糖尿病相关的胰岛素分泌缺陷和血胰岛素原增多似乎起因不同，但是某些病原生物化学机制可能相似。从中释放胰岛素的未成熟分泌颗粒的腔必须被酸化，从而使得激素原转化酶(PC)能够将新合成的胰岛素原分子被有效裂解成胰岛素原和C-肽(Orci等，1994；Paquet等，1996)。颗粒酸化是一个必需步骤，由于中和分泌颗粒活性导致胰岛素的切割不完全(Orci等，1994)和胰岛素原向构成型分泌途径的漏失(Kuliawat和Arvan，1994)。酸化是通过由液泡ATP酶(vATP酶)将质子转运到泡室中来介导的(Forgac，1999)。通过vATP酶转运质子的过程完全取决于ATP，因此对降低细胞的ATP水平的病症敏感，所述病症诸如由2型糖尿病的胰岛素阻力和血糖过多引起的作用于β-细胞的代谢压力。vATP酶活性还对一氧化氮敏感(Tojo等，1994；Forgac，1999；Swallow等，1991)。所以，β-细胞中与细胞因子接触时诱导一氧化氮合成，就象在1型糖尿病的胰岛炎阶段发生的一样，可能会降低vATP酶的活性。因此，尽管在1型和2型糖尿病中导致β-细胞机能障碍的原因不同，然而引起在1型和2型糖尿病中见到的血胰岛素原增多的生化过程相似。
因此，不断需要对能够诱导或调节与糖尿病有关的生化失调的因素进行鉴定。在进行本发明的工作中，本发明人意外地发现能够感染块茎蔬菜的链霉菌属的菌种产生某些对β-细胞功能活性具有不利作用的大环内酯。因此，食用被感染的蔬菜可引发糖尿病。这些大环内酯还被认为具有抑制vATP酶活性因而下调基础胰岛素分泌的作用但对β-细胞可能具有直接的毒性作用。目前通过鉴定环境对糖尿病的影响为目的在于研究一种评估可食用植物如块茎蔬菜对糖尿病的发病和/或病情发展造成影响的倾向性的方法提供了便利。为了评估大环内酯的摄入水平，本文还提供了用于筛选个体的方法，所述大环内酯的摄入水平被作为与糖尿病引发物接触的指标。本发明还在调节所摄入大环内酯的功能活性的基础上，诸如在通过中和所述大环内酯或调节饮食摄取量从而降低患糖尿病或具有患糖尿病倾向性的个体内的大环内酯摄取量，为研究糖尿病-相关治疗和预防方法提供了便利。
发明概述通过本发明的说明书和后面所附的权利要求，除非本文另有说明，“含有”及其变化形式如第三人称单数形式的“含有”和现在分词形式的“含有”应被理解成包含了所述的整体或步骤，或整体或步骤的集合，但不排除任何其它整体或步骤，或整体或步骤的集合。
因此，本发明的一个方面针对一种评估可摄入物质被哺乳动物摄入后诱导、上调或促成所述哺乳动物糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的方法，所述方法包括筛选该物质是否表达一种或多种β-细胞毒性大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物，其中所述大环内酯的表达是所述物质诱导、上调或促成糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的指标。
本发明的另一个方面针对一种评估植物或其繁殖材料被哺乳动物食用后诱导、上调或促成所述哺乳动物糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的方法，所述方法包括筛选所述植物或其繁殖材料是否表达一种或多种β-细胞毒性大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物，其中所述大环内酯的表达是所述植物或其繁殖材料诱导、上调或促成糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的指标。
本发明的另一个方面更具体地提供了一种评估块茎蔬菜被哺乳动物食用后诱导、上调或促成所述哺乳动物糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的方法，所述方法包括筛选所述块茎蔬菜是否表达一种或多种β-细胞毒性大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物，其中所述大环内酯的表达是所述块茎蔬菜诱导、上调或促成糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的指标。
另一方面提供了一种评估马铃薯被哺乳动物食用后诱导、上调或促成所述哺乳动物糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的方法，所述方法包括筛选所述马铃薯是否表达一种或多种β-细胞毒性大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物，其中所述大环内酯的表达是所述马铃薯诱导、上调或促成糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的指标。
另一方面提供了一种评估甜菜被哺乳动物食用后诱导、上调或促成所述哺乳动物糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的方法，所述方法包括筛选所述甜菜是否表达一种或多种β-细胞毒性大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物，其中所述大环内酯的表达是所述甜菜诱导、上调或促成糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的指标。
另一方面提供了一种评估胡萝卜被哺乳动物食用后诱导、上调或促成所述哺乳动物糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的方法，所述方法包括筛选所述胡萝卜是否表达一种或多种β-细胞毒性大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物，其中所述大环内酯的表达是所述胡萝卜诱导、上调或促成糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的指标。
另一方面提供了一种评估植物或其繁殖材料被哺乳动物食用后诱导、上调或促成所述哺乳动物糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的方法，所述方法包括筛选所述植物或其繁殖材料是否表达一种或多种巴弗洛霉素大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物，其中所述巴弗洛霉素大环内酯的表达是所述植物或其繁殖材料诱导、上调或促成糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的指标。
另一方面提供了一种评估植物或其繁殖材料被哺乳动物食用后诱导、上调或促成所述哺乳动物糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的方法，所述方法包括筛选所述植物或其繁殖材料是否表达一种或多种刀球肮霉素大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物，其中所述刀球肮霉素A的表达是所述植物或其繁殖材料诱导、上调或促成糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的指标。
另一方面提供了一种诊断哺乳动物中存在的糖尿病危险因素的方法，所述方法包括筛选所述哺乳动物是否表达一种或多种β-细胞毒性大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物的，其中所述大环内酯的表达是所述哺乳动物糖尿病的发病和/或病情发展的危险性的指标。
本发明的另一方面提供了一种诊断人的糖尿病危险因素的方法，所述方法包括筛选人是否表达一种或多种巴弗洛霉素大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物，其中所述巴弗洛霉素的表达是所述人的糖尿病发病和/或病情发展的危险性的指标。
优选地，所述巴弗洛霉素是巴弗洛霉素A1、A2、B1、B2和/或C。
另一个优选的方面提供了一种诊断人的糖尿病危险因素的方法，所述方法包括筛选人是否表达一种或多种刀球肮霉素大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物，其中所述刀球肮霉素A的表达是所述人的糖尿病发病和/或病情发展的危险性的指标。
优选，所述刀球肮霉素是刀球肮A、B、C和/或D。
本发明的另一个方面提供用于测定植物及其繁殖材料或生物样品的诊断试剂盒，该试剂盒以区室的形式包含适于盛放用于检测β-细胞毒性大环内酯的物质的第一区室和适于盛放用于促进第一区室内的物进行检测的试剂的第二区室。还可以包含其它区室，例如用于收集生物样品的区室。所述物质可以是抗体或其它合适的检测分子。
本发明的另一个方面针对一种预防、减少或减轻哺乳动物患糖尿病的方法，所述方法包括下调由所述哺乳动物表达的β-细胞毒性大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物的功能活性。
本发明的另一个方面涉及一种含有β-细胞毒性大环内酯拮抗剂和一种或多种药用载体和/或稀释剂的药物组合物。所述拮抗剂作为活性成分。
应当理解除了下调已被哺乳动物摄入的β-细胞毒性大环内酯的功能活性外，本发明还涉及在被哺乳动物摄入之前降低β-细胞毒性大环内酯的功能活性。
另一方面提供了一种预防、减少或减轻哺乳动物糖尿病的方法，所述方法包括减少哺乳动物食用植物或其繁殖材料的量，其中所述植物表达一种或多种β-细胞毒性大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物。
附图简述

图1是口服葡萄糖耐受试验的图示。对照值获得自每个时间点针对6只小鼠中的每只小鼠的3个测量值。巴弗洛霉素A1处理数据获得自每个时间点针对6只小鼠中的每只小鼠的1个测量值。对这些观察值进行斯氏t试验分析发现存在显著差异7天相对120分钟时的所有对照p＝0.00621天相对15分钟时的所有对照p＝0.0421天相对120分钟时的所有对照p＝0.009图2是引起胰岛β-细胞分泌颗粒中胰岛素含量增加的液泡ATP酶抑制作用的图示。利用抗-猪胰岛素抗体通过间接免疫荧光检测石蜡包埋切片中的胰岛内胰岛素。利用MCID图像分析软件分析由表面荧光显微镜收集的数字化图像上的染色密度以便提供对所结合的抗-胰岛素抗体数量的半定量测量值。对5只对照小鼠和6只经巴弗洛霉素A1处理的小鼠中的每只小鼠的至少9个胰岛进行了测定，并且将来自每组中所有小鼠的每个胰岛的单个数值合并起来以便进行分析。对每个胰岛进行测定，减去同一胰岛附近的外分泌组织测量的背景值。单位是任意的荧光单位并且数据被表示为平均值和标准误差的形式。
图3是与10nM巴弗洛霉素A1接触3小时后由小鼠胰岛β-细胞系MIN6所释放的胰岛素量。培养基被换成含有0、4、16或24mM葡萄糖和抑制剂并放继续放置3小时的培养基。胰岛素的释放通过放射免疫分析来测定。
图4.对分别在相隔一星期的两个时间点施用了巴弗洛霉素A1的小鼠进行处理后的90天跟踪观察。没有观察到抑制剂处理组或载体处理组在体重方面的显著差异。尽管在观察期内所有小鼠的随机血糖(RBG)仍保持在标准范围内，但是各组之间确实存在着RBG方面的差异，即被处理的小鼠在处理后的第50天首次测定的RGB浓度增加了(p＜0.05，重复测定ANOVA)。
图5是从巴弗洛霉素A1处理的小鼠体内得到的胰岛的图像，从该图像上可以看出形态发生了明显的改变。对石蜡包埋的小鼠胰腺切片的胰岛素进行免疫染色，然后用苏木紫进行复染。A代表未经处理的对照以及B代表经处理的小鼠而且在C中显示了胰岛结构被破坏，该结构被破坏具体体现在形成了与胰腺管相关的胰岛细胞簇。
图6是施用巴弗洛霉素A1后胰岛的尺寸图。胰岛尺寸的减小是液泡ATP酶抑制的长期结果。在施用巴弗洛霉素A1后的第1、7、26或90天检查胰腺形态。胰岛尺寸通过利用MCID软件测量经胰岛素抗体染色呈阳性的胰腺切片面积而得到。
对照-来自12只小鼠的223个胰岛第1天-来自3只小鼠的81个胰岛第7天-来自3只小鼠的125个胰岛第26天-来自4只小鼠的90个胰岛第90天-得自4只小鼠的81个胰岛黑方块代表平均值，虚线方框代表25-75％，棒代表90％，以及点表示异常值。
图7是分离自马铃薯疮痂的链霉菌种EF-73的乙酸乙酯提取物的RP-HPLC色谱图。色谱柱用30-100％的乙腈线性梯度进行展开，然后用100％的乙腈进行等度展开。检测色谱峰在254nm处的吸收值(AU)。在灵敏的生物测定中峰1、5和6(*)能够抑制丫啶橙吸收，这表明在这些级分中存在着vAP酶抑制剂/离子载体。峰5的初步质谱数据表明分子量为816道尔顿，是巴弗洛霉素(巴弗洛霉素B1)的特征，峰5和峰6的保留时间与确认的巴弗洛霉素B1的保留时间(箭头所指)接近。
图8是施用BA1后，在固定时间间隔未患糖尿病小鼠的百分率图。
本发明的详述本发明在一定程度上出人预料地预示了源自常见土壤微生物的大环内酯对胰腺胰岛β-细胞功能和存活力产生不利的影响，并且还预示了口服大环内酯将对β-细胞功能产生不利的影响。因而由这些发现得出含在人饮食中的β-细胞毒性大环内酯促进糖尿病的发病和/或病情发展。因此，这些发现促进了筛选方法的研究，所述筛选方法针对植物材料，尤其是用于人类食用目的的植物材料的鉴定，所述植物材料，例如对遗传易感性个体，具有引发糖尿病的倾向。这些发现还促进了诊断方法的研究，该诊断方法涉及确定个体如遗传易感性个体是否摄入了一种或多种所述大环内酯并因此有危险或者已经产生了一种或多种糖尿病症状。还促进了预防和/或治疗方法的研究，该方法涉及下调个体摄入的大环内酯的功能活性或根本降低大环内酯的摄入。
因此，本发明的一个方面涉及一种评估摄入物质被哺乳动物食用后诱导、上调或促成所述哺乳动物糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的方法，所述方法包括筛选所述物质是否表达一种或多种β-细胞毒性大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物，其中所述大环内酯的表达是所述物质诱导、上调或促成糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的指标。
关于“物质”应当被理解为任何天然或非天然的组合物或分子。根据本发明，所述物质是一种可摄入物质。“可摄入的”是指所述物质被哺乳动物体所吸收。摄入的途径可以是任何途径如经口、经静脉或皮内。在一个优选的实施方案中，所述物质是一种经口摄入的植物。
因此本发明更具体地是涉及一种评估植物或其繁殖材料被哺乳动物食用后诱导、上调或促成所述哺乳动物糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的方法，所述方法包括筛选所述植物或其繁殖材料是否表达一种或多种β-细胞毒性大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物，其中所述大环内酯的表达是所述植物或其繁殖材料诱导、上调或促成糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的指标。
如上文详述，针对一些大环内酯对β-细胞的功能具有不利影响的意外发现促使出现了另外一个更加惊奇的发现，即饮食与糖尿病发病之间具有一定的关系。特别是，大环内酯由链霉菌菌种表达的，特别是已知这些菌种存在于土壤并大量滋生在种植在该土壤中的植物材料中。链霉菌是形成孢子的革兰氏阳性菌。无论如何这些菌对本发明的理论或目的都不起限定作用，已知它们在土壤和水中生长缓慢同时长出类似于真菌菌丝体的丝状菌丝体。它们是多种包括链霉素、四环素、氯霉素和大环内酯在内的抗菌素的来源。应当了解产生那些大环内酯的链霉菌菌种可能以几种不同的关系与植物共存，例如，链霉菌能以菌落的形式在土壤中进行分裂和存活。由于这些菌落的位置与植物的一部分如根部或繁殖材料如块茎蔬菜临近，所以这些链霉菌中的某些可以被转移到植物上并在植物上继续存活和进行新陈代谢(因此产生大环内酯)或在所述植物上以菌落的形式进行侵染并继续扩展。所述链霉菌可以定位在植物上的任何部位，诸如植物的表面或植物组织本身内部。已知某些放线菌和植物以内生寄生菌的关系存在并通过被侵染的亲本植物的繁殖材料被转移到新生作物上。而且，尽管许多植物内生放线菌菌落生长在所述植物的根部或定位在土壤中的其它组织中，然而也知道它们在其它部位如叶子或茎上与植物共存。
术语“表达”应被广义理解为β-细胞毒性大环内酯与植物体的任何相关方式，诸如，但不限于被动吸收或吸收大环内酯本身，或直接从土壤转移到植物表面的链霉菌或由生长在植物上或接近植物表面或与植物以内生寄生菌的方式存在的链霉菌产生大环内酯。还应当了解所述植物或其繁殖材料“表达”大环内酯，只要所述大环内酯与所述植物的至少一个部位结合。没有必要对整个植物进行大环内酯的测定。因此，如下文进一步详细描述的，尽管本发明的一个优选实施方案是筛选块茎植物如马铃薯是否被链霉菌感染，然而本发明应被理解为扩大筛选可以被食用的任何类型的植物。而且，植物体的任何部位可以是筛选的对象，所述部位是诸如可以作为食用对象的部位或其它合适的部位，筛选的结果是可以指示食用对象的植物部位被感染的程度。
关于“植物”应当被理解为任何天然过非天然存在的植物。例如，开花作物、谷类作物(例如小麦和大麦)和园艺作物(例如番茄、甜菜、萝卜和马铃薯)。“非天然的”是指植物体在按照本发明的方法进行筛选前经过某些人工操纵或改性。操纵的实例包括但不限于对植物进行的遗传操纵或用外源的、蛋白质或非蛋白质类分子对幼苗或繁殖材料进行的处理。进行遗传操纵可以例如改善生产特性或引进一种或多种生控特性。非天然存在的植物可以是任何来源的。例如，对于一种被遗传改性的非天然植物来说，该植物可以是一种本身进行了遗传改性的植物或该植物是由遗传改性的种子培养出来的植物。或者，所述植物可以得自本身源于遗传改性的植物的种子。优选地所述植物是一种块茎蔬菜以及甚至更具体地是马铃薯植物、甜菜植物或胡萝卜植物。
关于“繁殖材料”应当被理解为任何种类的细胞材料，由该细胞材料植物可以发芽或生长。繁殖材料的实例包括但不限于块茎、种子、插条或细胞悬浮液。所述繁殖材料可以是任何适当的形式。例如，繁殖材料可以是新收获的或可以得自保存样品，诸如块茎样品或在筛选前已进行了保存的细胞冷冻保存品。优选地所述繁殖材料是一种块茎蔬菜以及甚至更具体地是马铃薯、甜菜或胡萝卜。
因此，本发明更具体地提供了一种评估块茎蔬菜被哺乳动物食用后诱导、上调或促成所述哺乳动物糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的方法，所述方法包括筛选所述块茎蔬菜是否表达一种或多种β-细胞毒性大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物，其中所大环内酯的表达是所述块茎蔬菜诱导、上调或促成糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的指标。
在一个优选的实施方案中，提供了一种评估马铃薯被哺乳动物食用后诱导、上调或促成所述哺乳动物糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的方法，所述方法包括筛选所述马铃薯是否表达一种或多种β-细胞毒性大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物，其中所大环内酯的表达是所述马铃薯诱导、上调或促成糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的指标。
在另一个优选的实施方案中，提供了一种评估甜菜被哺乳动物食用后诱导、上调或促成所述哺乳动物糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的方法，所述方法包括筛选所述甜菜是否表达一种或多种β-细胞毒性大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物，其中所大环内酯的表达是所述甜菜诱导、上调或促成糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的指标。
在另一个优选的实施方案中，还提供了一种评估胡萝卜被哺乳动物食用后诱导、上调或促成所述哺乳动物糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的方法，所述方法包括筛选所述萝卜是否表达一种或多种β-细胞毒性大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物，其中所大环内酯的表达是所述萝卜诱导、上调或促成糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的指标。
“大环内酯”属于由几种链霉菌菌株产生的一组抗生素中的一种。这些分子具有复杂的大环结构而且某些分子被认为通过封闭50S核糖体亚单位而抑制蛋白质合成，然而其它分子则抑制vATP酶的活性。大环内酯在临床上通常被用作广谱抗菌素，尤其是抗革兰氏阳性菌，其它被用作抗-线虫抗生素。关于“β-细胞毒性大环内酯”应当被理解为对胰腺胰岛的β-细胞的功能和/或形态直接或间接地产生不利影响的大环内酯。在本发明中，当β-细胞的至少一种功能活性或形态学特性受到改变以至于被消除、降低或者被不适当地改变时认为β-细胞体受到不利的影响。所述不利影响可以是永久的或短暂的。直接的影响是指大环内酯作用于β-细胞本身从而调控一种或多种功能活性或形态学特性而间接作用是指大环内酯作用于除β-细胞以外的其它分子，而该分子反过来直接或间接不利地改变β-细胞的一种或多种功能活性或形态学特性。应当理解该定义的含义包括大环内酯还可以具有除不利地改变β-细胞的功能和/或形态以外的一种或多种其它功能活性。优选地，所述β-细胞毒性大环内酯是巴弗洛霉素或刀球肮霉素。
因此，在一个优选的实施方案中，提供了一种评估植物或其繁殖材料被哺乳动物食用后诱导、上调或促成所述哺乳动物糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的方法，所述方法包括筛选所述植物或其繁殖材料是否表达一种或多种巴弗洛霉素大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物，其中所述巴弗洛霉素大环内酯的表达是所述植物或其繁殖材料诱导、上调或促成糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的指标。
优选地，所述巴弗洛霉素大环内酯是巴弗洛霉素A1、A2、B2或C中的一种或多种。
甚至更优选所述植物或其繁殖材料是块茎蔬菜而更优选马铃薯、甜菜或胡萝卜。
在另一个优选的实施方案中，提供了一种评估植物或其繁殖材料被哺乳动物食用后诱导、上调或促成所述哺乳动物糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的方法，所述方法包括筛选所述植物或其繁殖材料是否表达一种或多种刀球肮霉素大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物，其中所述刀球肮霉素A的表达是所述植物或其繁殖材料诱导、上调或促成糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的指标。
优选地，所述刀球肮霉素是刀球肮霉素A、B、C或D中的一种或多种。
优选所述植物或其繁殖材料是块茎蔬菜而更优选马铃薯、甜菜或胡萝卜。
本发明不局限于任何一种理论或作用模式，巴弗洛霉素A1降低肾细胞匀浆中的vATP酶活性。这种作用持续几天，表明从组织中清除抑制剂活性的速率很慢。发生在胰岛β-细胞中的vATP酶抑制作用导致胰岛素分泌的改变，并且使得对动物体内的血糖控制作用很差。该作用包括抑制胰岛素的基础分泌和通过破坏第一阶段的胰岛素分泌而改变口服葡萄糖的耐受剂量。
认为抑制胰岛素基础释放的vATP酶抑制作用的间接机理是GLUT4向质膜上转运。特别是，巴弗洛霉素A1诱导的体内GLUT4转运被认为能够提高外周组织进行胰岛素-非依赖性葡萄糖吸收的效率从而降低了对胰岛素的需要量和降低了空腹质膜胰岛素浓度(Chinni和Shishera，1999)。因此巴弗洛霉素A1对GLUT4的转运作用与胰岛素基础分泌的抑制作用结合的效果被认为可以降低空腹质膜胰岛素浓度。在空腹胰岛素水平降低的同时胰岛内免疫反应性胰岛素的浓度提高了。通过利用促胰岛素分泌剂在翻译水平上诱导胰岛素的生物合成来协调胰岛素的生物合成和分泌。当空腹血糖浓度保持正常，葡萄糖继续促进胰岛素原进行生物合成，同时抑制胰岛素分泌时，将导致胰岛素原/胰岛素在胰岛分泌泡中的积累。
小鼠的葡萄糖耐受试验表明在进行口服葡萄糖耐受试验的过程中较早地出现了较高的血糖峰。葡萄糖攻击2小时后血糖回到正常值，在被处理的小鼠和未处理小鼠体内由葡萄糖诱导的胰岛素血清浓度相似，表明胰岛β-细胞仍然能够进行由葡萄糖诱导的胰岛素分泌。这表明葡萄糖耐受性的改变是由于需要更高的葡萄糖浓度来诱导足量胰岛素的释放从而促进葡萄糖的吸收。据分析巴弗洛霉素A1在到达质膜之前干扰分泌颗粒的生物生成从而造成胰岛素分泌缺陷。
本发明不受任何理论或作用模式的限制。令人惊奇地发现对巴弗洛霉素A1的暴露影响胰岛β-细胞的形态。在暴露于巴弗洛霉素A1后的第1或第3个星期对小鼠进行的口服葡萄糖耐受试验结果表明在受葡萄糖攻击后15分钟血糖浓度逐渐升高。在第3个星期，胰岛形态正常，表明葡萄耐受性的改变不是由于β-细胞的丢失所造成的，而是由于内在的生理缺陷造成的。然而，在90天中，通过随机血糖浓度评估的葡萄糖耐受性逐渐恶化而且胰岛发生了以破裂或再生为标志的形态变化。β-细胞量也似乎降低了。这说明vATP酶的抑制作用引起了胰岛β-细胞功能的缺陷，其继续恶化最终导致β-细胞死亡和/或再生。
本文所指的大环内酯的“衍生物”包括其天然或重组来源的片段、部分、部分和变异体，所述重组来源包括融合蛋白。“重组来源”是指产生大环内酯的链霉菌被遗传改造从而使得大环内酯的表达产物被改性。例如当遗传改造的微生物被有意或无意释放到环境当中时，则可能发生这种情况。大环内酯的部分或片段包括例如大环内酯的活性区域。
大环内酯的“变异体”或“突变体”应当被理解成具有所述大环内酯的至少某些功能活性。变异或突变可以是包括遗传或非遗传变异或突变在内的任何形式。所述变异或突变可以自然发生或非自然地发生。
“同系物”是指按照本发明的方法所筛选的、来自常见大环内酯产生菌种或菌属以外的其它菌种或菌属的大环内酯。这种情况例如属于找到了除目前已知的产生所述大环内酯的菌种以外的而能够产生功能类似的大环内酯的链霉菌种或者属于找到了非链霉菌的放线菌属如小双孢菌，小单孢菌或诺卡氏菌，这些放线菌能够产生与本文所定义的大环内酯的功能类似的分子。
本发明涉及筛选植物或其繁殖材料是否具有影响糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的方法。“倾向性”是指如果植物表达β-细胞毒性大环内酯并被摄入，比不表达大环内酯的植物更有可能影响糖尿病的发病和/或病情发展。也就是说，是一种相对的风险性指标。因此，应当理解表达β-细胞毒性大环内酯的植物不会导致所有摄入所述植物的个体患上糖尿病。例如，有些个体由于其遗传组成的原因比遗传组成不同的其它个体更易受到β-细胞毒性大环内酯的不利影响。由于影响糖尿病倾向性的诸多遗传因素还没有被完全掌握，所以本发明的方法尤其用于鉴定饮食因素对至少某些个体，例如具有遗传易感性的个体的糖尿病发病的作用。因此，提供了一个体系，通过该体系可以作出与糖尿病风险系数和个体或群体的饮食有关的有意义的判断。
关于“促成”糖尿病的发病和/或病情发展的β-细胞毒性大环内酯应被理解为所述大环内酯是糖尿病的唯一诱因或是几种影响因素中的一种。例如，对于某些个体来说，β-细胞毒性大环内酯的摄入可能是引起糖尿病发病或上调如加重糖尿病的病情或发生所需的唯一因素。或者，β-细胞毒性大环内酯的摄入可能与其它饮食或非饮食因素(诸如遗传倾向)共同引起糖尿病的发病或上调。在没有大环内酯存在的情况下，可能不会发病或引起上调，或者严重程度显著降低。在流行病学意义上，接触大环内酯可能是导致糖尿病的一个主要原因。
因此，关于对哺乳动物糖尿病的发病和/或病情发展的“锈导、上调或促成”应被理解为诱导、上调或促成糖尿病的任何一种或多种症状。糖尿病的症状包括但不限于葡萄糖浓度异常或葡萄糖浓度的波动、胰岛素浓度异常、口渴、尿频、体重下降、视觉模糊、头痛和腹痛。应当理解本发明的方法涉及鉴定植物或其繁殖材料诱导、上调或促成一种或多种所述症状的发病和/或病情发展的倾向性。“病情发展”是指糖尿病严重程度的上升或特定症状的诱发，该特定症状曾处于一种减轻状态或尽管个体作为糖尿病患者的状态但其未经历过该特定症状。还包括不断出现本来可以在程度上减轻或甚至消失的症状。
关于“糖尿病”应当被理解为是一种产生不够高的胰岛素浓度来维持生物学上的正常葡萄糖浓度。如上文所详细描述的，本发明所研究的糖尿病可以只由β-细胞毒性大环内酯来诱导或者可以由β-细胞毒性大环内酯与其它一些影响因素或组成原因一起来诱导。或者，β-细胞毒性大环内酯可以单独发挥作用或与其它因素一起来影响糖尿病病情的发展。因此，当糖尿病是由一些影响因素所造成的时候，除β-细胞毒性大环内酯以外的这些影响因素可包括胰腺胰岛细胞中存在的先天缺陷、针对胰腺β-细胞的自身免疫应答的发作(例如1型糖尿病/IDDM，在成人中也被称作潜伏性自身免疫糖尿病或LADA的进展缓慢的成年发病IDDM)、由饮食因素(非大环内酯类)或逆境引起的胰腺胰岛细胞的功能缺陷(例如2型糖尿病/成年发病糖尿病、非胰岛素依赖性糖尿病、NIDDM)、胰腺胰岛细胞损伤，如但不限于由身体受伤引起的损伤、由非自身免疫病症中的任一种引起的或作为非相关疾病的发病或治疗所产生的副作用的胰腺胰岛细胞退化。因此本文所指的“糖尿病”包括典型的1型糖尿病、2型糖尿病和包括妊娠糖尿病在内的其它糖尿病。
本文使用的术语“哺乳动物”包括人、灵长目动物、家畜(例如马、牛、羊、猪、驴)，实验动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)、宠物(例如狗、猫)和捕获的野生动物(例如袋鼠、鹿和狐狸)。优选地所述动物是人或实验动物。甚至更优选地是所述动物是人。
筛选植物或其繁殖材料表达β-细胞毒性大环内酯的合适方法对于本技术领域的技术人员是已知的并且包括但不限于(i)通过针对标记和测定所述大环内酯的技术进行的植物切片染色或细胞悬浮物分析。
例如，可将目标大环内酯与特异性抗体接触，所述抗体可以是被报道分子标记的或未被标记的。根据所述目标的数量和报道分子的信号强度，通过采用抗体进行直接标记可以检测所结合的目标。或者，使特异于第一种抗体的第二种被标记抗体与目标-第一抗体复合物接触从而形成一种目标-第一抗体-第二抗体三联复合物。该复合物可以通过报道分子发出的信号来检测。
本说明书使用的“报道分子”是指由其化学性质提供了一种可分析测定信号的分子，所述信号能够测定结合抗原的抗体。所述测定可以是定性的也可以是定量的。这种分析方法中最常用的报道分子是酶、荧光团或含有放射性核素的分子(即放射性同位素)和化学发光分子。
在酶免疫分析(EIA)过程中，酶通常通过戊二醛或过碘酸盐与第二抗体结合。然而为了容易识别，可以使用多种不同的缀合技术，这些技术容易被技术人员所掌握。常用酶包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶等。与特定酶一起使用的底物常被选择用来通过利用相应的酶进行水解来产生可测的颜色变化。合适酶的实例包括碱性磷酸酶和过氧化物酶。除上述的产色底物外也可以利用产生荧光产物的荧光物质。在所有情况下，将酶标记的抗体加到第一抗体-半抗原复合物中，从而进行结合，然后冲洗掉过量的试剂。再将含有适当底物的溶液加到抗体-抗原-抗体的复合物中。所述底物与连接了第二抗体的酶进行反应，产生了定性的视觉信号，由此给出样品中半抗原含量的指标，所述视觉信号可进一步进行定量，通常进行分光光度定量。
或者，荧光化合物如荧光素和碱性蕊香红，可以被化学偶联到抗体上而不改变其结合能力。当受到特定波长的光照射而被激活时，荧光染料标记的抗体吸收光能，从而将分子诱发到激发状态，接着发射出光学显微镜可目测到的特征颜色。在EIA过程中，将荧光标记的抗体与第一抗体-半抗原复合物结合。冲洗掉未结合的试剂后，采用合适波长的光照射保留下的三联复合物，观察到的荧光表明目标半抗原的存在。免疫荧光技术和EIA技术在本技术领域中已相当成熟并且对于本发明的方法是特别优选的。然而，也可以使用其它报道分子如放射性同位素、化学发光分子或生物发光分子。
(ii)功能分析建立在对源于培养细胞的膜级分、哺乳动物器官、酵母中的vATP酶或任何其它来源的vATP酶的活性产生抑制作用筛选的基础上。vATP酶的活性是通过ATP的消耗或无机磷的释放所测得的ATP酶总活性的部分，该活性对巴弗洛霉素或任何其它vATP酶抑制剂敏感。
(iii)采用适当的标准品通过HPLC、气相色谱、质谱对大环内酯进行鉴定。
例如，可利用有机溶剂萃取样品、RP-HPLC分离萃取物中的组分、利用生物分析法检测峰级分并通过UV光谱测定法、质谱和/或核磁共振测定活性种类，从而实现鉴定次级生物活性代谢物(诸如巴弗洛霉素和刀球肮霉素)。本发明不局限于任何理论或作用模式，纳克级的vATP酶抑制剂和离子载体可以通过利用vATP酶将质子跨膜转运来酸化胞内区室的事实而得到检测。通过食酸性细胞渗透颜料如丫啶橙的积累来对所产生的pH梯度进行测定。当这些pH梯度通过离子载体(例如尼日利亚菌素)或通过vATP酶的直接抑制作用(例如巴弗洛霉素和刀球肮霉素)而遭到破坏时，所述颜料不在胞内区室中进行积累，其中所述离子载体能加快离子的跨膜运动。
除了筛选植物体是否表达大环内酯从而确定所述植物体影响糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性外，对大环内酯的植物表达与糖尿病的发病之间的因果关系进行鉴定也促进了针对评估哺乳动物体内存在的大环内酯筛选方法的研究，该大环内酯作为哺乳动物患糖尿病可能性的指标或作为已有糖尿病的存在和/或病情进展的促成因素。
因此，本发明的另一方面提供了一种诊断存在于哺乳动物体内的糖尿病危险因素的方法，所述方法包括筛选哺乳动物是否表达一种或多种β-细胞毒性大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物，其中所述大环内酯的表达是所述哺乳动物糖尿病的发病和/或病情发展的危险性的指标。
关于“表达”应被理解为所述大环内酯在哺乳动物内的存在。大环内酯的存在可能是由于食用了被污染的植物如块茎蔬菜而摄入了大环内酯或者可能是由于食用了感染了链霉菌的植物，当链霉菌被摄入后，其继续产生大环内酯。
“诊断”“糖尿病危险因素”的存在是指已公开的方法使人们能够确定(i)还没有表现出任何糖尿病相关症状的个体由于摄入了β-细胞毒性大环内酯而处于已具有患糖尿病的倾向性的危险境地。
(ii)糖尿病个体患者的糖尿病发病和/或病情进展由于摄入了β-细胞毒性大环内酯而可能受到诱导或被上调。
关于“糖尿病”、“哺乳动物”、“β-细胞毒性大环内酯”、“其衍生物、变异体、突变体或同系物”和“发病和/或病情进展”应当被理解为与上文中所定义的具有相同含义。
在一个优选的实施方案中提供了一种诊断人体内存在的糖尿病危险因素的方法，所述方法包括筛选人是否表达一种或多种巴弗洛霉素大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物，其中所述巴弗洛霉素的表达是所述人糖尿病的发病和/或病情发展的危险性的指标。
优选地，所述巴弗洛霉素是巴弗洛霉素A1、A2、B1、B2和/或C。
在另一个优选的实施方案中提供了一种诊断存在于人体内的糖尿病危险因素的方法，所述方法包括筛选人是否表达一种或多种刀球肮霉素大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物，其中所述刀球肮霉素A的表达是所述人糖尿病的发病和/或病情发展的危险性的指标。
优选地，所述刀球肮霉素是刀球肮霉素A，B，C和/或D。
公开的筛选方法应当包括植物体、其繁殖材料或哺乳动物体内的β-细胞毒性大环内酯的一次测定和一段时间内的多次测定(例如当需要连续监控植物感染或哺乳动物个体患糖尿病的危险因素状况或者治疗或预防方案有效性时)。
本发明的另一个方面提供了用于测定植物及其繁殖材料或生物样品的诊断试剂盒，该试剂盒以区室化的形式包含适于盛放用于检测β-细胞毒性大环内酯的物质的第一区室和适于盛放用于促进第一区室内的物质进行检测的试剂的第二区室。还可以包含其它区室，例如收集生物样品的区室。所述物质可以是抗体或其它合适的检测分子。
对糖尿病的发病和/或病情发展与β-细胞毒性大环内酯摄入之间关系的阐述促进了预防和治疗方案的研究，该预防和治疗方案涉及在降低浓度如通过下调大环内酯的功能活性或调节饮食的摄取来减少大环内酯摄入量的基础上减少、改善或防止哺乳动物患糖尿病。
因此本发明的另一个方面涉及一种预防、减少或减轻哺乳动物患糖尿病的方法，所述方法包括下调由所述哺乳动物表达的β-细胞毒性大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物的功能活性。
优选地，所述β-细胞毒性大环内酯是一种巴弗洛霉素或刀球肮霉素A以及更优选地是所述巴弗洛霉素是巴弗洛霉素A1，A2，B1，B2和/或C3并且所述的刀球肮霉素是刀球肮霉素A、B、C和/或D。
关于“预防、减少或减轻”对象的主体糖尿病应被理解为预防、减少或减轻糖尿病的任何一种或多种症状。如上文所详述的，糖尿病的症状包括但不限于葡萄糖水平或葡萄糖水平的调节异常、胰岛素水平异常、口渴、尿频、体重减轻、视觉模糊、头痛和腹痛。应当了解本发明的方法可以减轻任何一种或多种症状或消除一种或多种症状。尽管完全正常化是最理想的，然而部分正常化也是有用的，例如降低1型糖尿病患者发生的糖尿病昏迷风险或者降低对静脉注射胰岛素的依赖程度。本发明的方法涉及防止出现任何一种或多种糖尿病症状。例如，对于具有患糖尿病倾向(例如遗传性倾向)的个体，其胰腺胰岛细胞逐渐退化或遭受严重的或无法挽回的损伤，可以采用本发明的方法来减轻胰腺胰岛细胞的进一步退化。
β-细胞毒性大环内酯功能活性的下调可以通过几种技术中的一种来实现，包括但绝不限于将蛋白质分子或非蛋白质分子引进所述哺乳动物体内，所述分子通过诸如拮抗大环内酯或至少部分下调大环内酯的功能来抵消β-细胞毒性大环内酯的作用。在另一个实施例中，所述蛋白质或非蛋白质分子可以作用于链霉菌从而阻止了大环内酯的表达和分泌。在另一个实施例中，所述蛋白质或非蛋白质分子通过作用于β-细胞使其免受大患内酯的作用可以起到抑制或至少降低大环内酯功能的作用。也就是说，所述分子对胰岛β-细胞具有保护作用，更具体地是可以避免由毒性大环内酯介导的不利作用。这些蛋白质和非蛋白质分子在下文中被称作“β-细胞毒性大环内酯拮抗剂”。
所述蛋白质分子可以是天然或重组来源的，所述重组来源包括融合蛋白或，例如来自天然产物的筛选。所述非蛋白质分子可以例如是核酸分子也可以是天然来源的，诸如从天然产物筛选的或者可以是化学合成的。本发明涉及β-细胞毒性大环内酯的化学类似物，该化学类似物能够作为拮抗剂。拮抗剂可以是任何能够阻断、抑制或阻止β-细胞毒性大环内酯正常发挥其生物功能的化合物。拮抗剂包括特异于β-细胞毒性大环内酯或部分β-细胞毒性大环内酯的单克隆抗体以及阻止β-细胞毒性大环内酯合成过程中所涉及的基因或mRNA进行转录或翻译的反义核酸。
例如本发明可以利用针对β-细胞毒性大环内酯的抗体，该抗体包括催化抗体。这种抗体可以是单克隆的或多克隆抗体并且可以选自自然存在的针对β-细胞毒性大环内酯的抗体或者可以特异地针对β-细胞毒性大环内酯而产生。在后一种情况下，β-细胞毒性大环内酯可以首先与载体分子结合。或者，可以使用抗体片段如Fab片段。而且，本发明涉及重组的和合成的抗体并涉及抗体杂合体。“合成抗体”在本文中包括抗体片段和杂合体。本发明的这种抗体特别适用于免疫疗法并且还可以作为评估编程性死亡或监控治疗方案程序的诊断工具。
例如，β-细胞毒性大环内酯可以被用来筛选天然存在的针对β-细胞毒性大环内酯的抗体。
所述蛋白质或非蛋白质分子可以直接或间接调节β-细胞毒性大环内酯的表达或β-细胞毒性大环内酯的活性。所述分子如果与β-细胞毒性大环内酯结合来调节β-细胞毒性大环内酯的表达或活性，则其为直接作用。所述分子如果与β-细胞毒性大环内酯以外的分子结合就起间接作用，所述其他分子直接或间接地调节β-细胞毒性大环内酯的表达或活性。因此本发明的方法涉及通过引发级联的调节步骤来调节β-细胞毒性大环内酯的表达或活性，所述级联的调节步骤能够调节β-细胞毒性大环内酯的表达或活性。
可以通过任何方便的途径来施用药物组合物形式的β-细胞毒性大环内酯拮抗剂。β-细胞毒性大环内酯拮抗剂或药物组合物被设计成具有治疗活性，其施用量取决于特定的病例。根据例如人或动物和拮抗剂来进行调整。可以使用很宽的剂量范围。可以调整用药方案以便提供最佳的治疗效果。例如，可以每天、每周、每月或以适当的其它时间间隔分次施用或者根据出现的紧急情况按比例减量施用。所述拮抗剂的施用可以通过便利的途径如口服、静脉内(如果是水溶性的)、鼻内、腹膜内、肌内、皮下、皮内或栓剂途径或植入(例如利用缓释分子)来进行。当使用特定的蛋白质拮抗剂时，这些肽能以非毒性药用盐如酸加成盐或金属复合物，例如同锌、铁等的复合物(作为该应用目的的盐)的形式进行施用。这种酸加成盐的实例是氯化氢、氢溴化物、硫酸盐、磷酸盐、马来酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、抗坏血酸盐、酒石酸盐等。如果所述活性组分是以片剂的形式进行施用，所述片剂含有粘合剂如黄芪胶、玉米淀粉或明胶；崩解剂如海藻酸；和润滑剂如硬脂酸镁。
本发明不局限于任何一种理论或作用模式，巴弗洛霉素A1已被证明能够抑制vATP酶的活性。因此，希望通过降低vATP酶抑制剂的浓度，如果是β-细胞毒性大环内酯的浓度，而至少在一定程度上恢复vATP酶的某些活性。而且，由于经过一段时间β-细胞形态发生退化，对个体进行连续监控来检测β-细胞毒性大环内酯浓度的变化，提供了一种确定开始进行治疗和/或预防处理的时机的手段从而避免或至少降低了β-细胞形态损伤的机率。
根据这些方法，本文中定义的拮抗剂可以与一种或多种其它化合物或分子共同施用。“共同施用”是指以同一制剂的形式同时施用或以两种不同的制剂形式通过相同或不同的途径同时施用或通过相同或不同的途径顺序施用。“顺序”施用是指在两种类型分子的施用之间存在着以秒、分钟、小时或天计的时间差。这些分子可以按照任何顺序进行施用。
在本发明的相关方面，接受治疗或预防处理的对象可以是需要治疗或预防处理的人或动物。在这方面，本文所涉及的“治疗”和“预防”应是广义的。术语“治疗”不一定是指哺乳动物一直被治疗到恢复程度。类似地，“预防”也不一定是指主体始终不被染上疾病。因此，治疗和预防包括减轻特定病症的症状或着避免或降低患上特定病症的危险性。“治疗”还可以是减小所患病症的严重程度或急性发病的频率。
尽管本发明的实例是采用了小鼠模型，但是在一个优选的实施方案中，治疗主体是哺乳动物以及更优选人，这并不意味着要将本发明方法的应用限定在其它物种，尤其是人。
本发明的另一个方面涉及一种含有β-细胞毒性大环内酯拮抗剂和一种或多种药用载体和/或稀释剂的药物组合物。该拮抗剂作为活性成分。
适于注射用的药物剂型包括无菌水溶液(如果是水溶性的)和无菌粉剂，该粉剂用于临时配制无菌注射溶液或分散液。在所有的情况下，所述制剂必须是无菌的并且其流动性必须达到容易注射的程度。在制备和贮存的条件下必须是稳定的并且必须在防微生物如细菌和真菌污染的条件下保存。所述载体可以含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、乙二醇和液体聚乙二醇等)等溶剂或分散介质，其适当混合物和植物油的溶剂或分散介质。通过例如利用包封材料licithin、通过在分散剂中保持所需的粒径和通过利用superfactant来维持合适的流动性。可以通过多种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、thirmerosal等来防止微生物污染。许多情况下，优选地包括等渗物质，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延长吸收的物质，例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射组合物的吸收时间。
无菌注射溶液是通过将所需量的活性化合物与以上列举的所需其它组分一起在适当的溶剂中来制备，然后进行过滤除菌。通常，分散液通过将多种无菌活性组分结合到含有碱性分散介质和以上列举的其它所需组分的无菌载体中来制备。用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂的优选制备方法是利用真空干燥和冷冻干燥技术由前面的无菌过滤溶液得到由活性组分和任何所需的附加成分组成的粉剂。
如果活性成分进行了适当保护，其可以与例如一种惰性稀释剂或与可同化的食用载体一起口服，或者可以被包封在硬质或软质明胶胶囊中，或者可以被压成片剂，或者可以被直接与食物结合在一起。对于口服治疗给药来说，所述活性化合物可以与赋形剂结合在一起并以可摄取的片剂、颊含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬液、糖浆、糯米纸囊剂等形式使用。这种组合物和制剂应当含有至少1％重量百分比的活性化合物。所述组合物和制剂的百分含量当然可以变化并且可以被方便地配制成约5％至约80％的重量百分含量。活性化合物在这种治疗用组合物中的含量是能够达到适当的剂量。本发明优选的组合物或制剂被制成口服剂量单位形式含有约0.1μg至2000mg的活性化合物。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可以含有下列物质粘结剂如黄芪胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂如磷酸二钙；崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂如硬脂酸镁；并且还可以添加甜味剂如蔗糖、乳糖或糖精或风味剂如薄荷、冬青油或樱桃风味剂。如果剂量单位形式是胶囊，除了上述种类的物质外，还可以含有液体载体。其它各种物质可以以包衣的形式存在或对该剂型单位的物理形式进行改构。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用虫胶、糖或其两种进行包衣。糖浆或酏剂可以含有所述活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和丙酯、染料和风味剂如樱桃或桔子味的风味剂。当然，用于制备任何剂量单位形式的物质应当是药学纯的并且在所需用量范围内基本是无毒性的。另外，所述活性化合物可以被结合到缓释制剂中。
药用载体和/或稀释剂包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。这种作为药学活性物质的介质和添加剂的用途在本技术领域中已知。除非与活性组分不相容，任何介质或添加剂都可在治疗组合物中使用。还可将附加的活性成分结合到组合物中。
以易于施用和均一剂量的剂量单位形式配制非肠道用药组合物特别有利。本文使用的剂量单位形式是指适于被治疗哺乳动物患者的单一剂量的物理上不连续的单位；每个单位含有预定量的活性物质和所需的药用载体，所述预定量被计算成能够产生所需治疗效果的量。本发明的新型剂量单位形式的定义由(a)所述活性物质的独特性质和需要达到的治疗效果和(b)复合活性物质以治疗活体疾病领域内所固有的局限性来说明和直接决定，该疾病正如本文所详细记载的，其中所述活体身体健康受到损害。
主要活性成分以有效量与适当药用载体一起被复合成上文公开的剂量单位形式来方便和有效地施用。一个单位的剂量形式，例如，可含有含量为0.5μg至约2000mg的主要活性化合物。以比例表示，每毫升的载体通常存在约0.5μg至约2000mg的主要活性化合物。对于含有附加活性成分的组合物来说，剂量是由所述成分的通用剂量和施用方式来决定。
所述药物组合物还可含有遗传分子如能够转染靶细胞的载体，其中所述载体携带了能够调控大环内酯的表达或活性的核酸分子。所述载体可以是，例如，一种病毒载体。本发明应当为理解成能够扩展到将这种载体用于基因治疗。
应当理解除了下调被哺乳动物摄入的β-细胞毒性大环内酯的功能活性外，本发明还涉及β-细胞毒性大环内酯在被哺乳动物摄入之前，其功能活性就被降低。例如，理想的是进行大规模的植物材料的处理，所述植物材料诸如是块茎蔬菜，该植物被产生这些大环内酯的细菌所感染。这种处理可以，例如，在消费者购买植物之前就进行。利用一种或多种本文记载的拮抗剂处理植物的方法对于本技术领域的技术人员来说是熟知的。
另一方面提供了一种预防、减少或减轻哺乳动物患糖尿病的方法，所述方法包括减少所述哺乳动物对植物或其繁殖材料的食用量，其中所述植物表达一种或多种β-细胞毒性大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物。
优选地，所述β-细胞毒性大环内酯是巴弗洛霉素或刀球肮霉素以及更优选所述巴弗洛霉素是A1、A2、B1、B2和/或C而且所述刀球肮霉素是刀球肮霉素A、B、C和/或D。
在另一个最优选的实施方案中，所述植物是茎块蔬菜植物以及更具体地是马铃薯、甜菜或胡萝卜。
在以下非限制性实施例中记载了本发明的其它特征。
实施例1液泡ATP酶抑制剂，巴弗洛霉素A1在小鼠体内引起胰岛素分泌缺陷(i)材料和方法小鼠Balb/c雄性小鼠由Monash University Central Animal House和Breeding Facility提供。Monash大学生化系动物伦理委员会批准了所有的动物实验。将巴弗洛霉素A1(Sigma)溶解在70％的乙醇中后再用10倍的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)稀释从而制成4.8μg/ml的工作贮液。通过腹膜内注射对每组中的3至9只小鼠以每公斤(体重)12μg的量施用巴弗洛霉素A1，结果使得血液中的巴弗洛霉素A1最终浓度达到275nM，假设每千克小鼠的血液体积是70ml。该浓度在体外能够充分抑制vATP酶活性，而没有检测到对P-ATP酶或F-ATP酶活性产生抑制(Drose等，1997)。对照小鼠得到的是不含抑制剂的乙醇/PBS载体溶液。
vATP酶活性的测定采用戊巴比通(Nembutal)以每千克体重35mg的量对7只对照小鼠、4只预先用巴弗洛霉素A1处理了1天的小鼠和4只预先用巴弗洛霉素A1处理了7天的小鼠进行麻醉，然后取出肾并立即用干冰冷冻并且在处理之前一直保存在-80℃下。对所述肾进行称重后利用研钵和研棒在液氮中进行匀浆。然后加入1ml含10mM Tris-Cl pH8.0和2mM MgCl2的蛋白酶抑制剂并在杜恩斯匀浆器中冲击5次以便进一步被匀浆。然后将1ml溶液(0.5M蔗糖，40mM Tris-Cl pH8.0和2mMMgCl2)加到匀浆中并在4℃下以700xg离心10分钟以便使悬浮液澄清。然后通过在有或无15ul的1uM巴弗洛霉素A1存在的条件下，以200ul的反应终体积，在微滴板的孔中将100ul稀释度为1∶100的组织提取物与1mM ATP一起在Tris缓冲盐溶液(TBS)中温育30分钟以便测定双份的含有可溶性的及膜结合成分的上清液中的ATP酶活性。利用Chan等的单步法(1986)测定释放出来的无机磷，在660nm的波长下利用微滴板读数器读取吸光值。以背景磷酸盐浓度和ATP自动水解来校正结果数据。每个肾提取物的蛋白含量是通过Bradford试剂(Biorad)来测定的。
口服葡萄糖耐受试验(OGTTS)
对6只对照小鼠和6只被处理小鼠的各组进行6-7个小时的禁食，然后通过腹膜内注射的方式采用戊巴比通(Nembutal)以每千克体重35mg的量进行麻醉以便减小压力诱导的血糖波动。通过强饲法将200mg/ml的D-葡萄糖(2mg/g体重)输送到胃中。按照下述方法在进行葡萄糖攻击后的15、30、60和120分钟测定禁食小鼠的血糖浓度。从尾静脉收集全血(约60ul)并立刻采用YSI葡萄糖分析仪通过葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖浓度。
免疫反应性胰岛素的测定用巴弗洛霉素A1或载体溶液处理9只小鼠的一组，然后禁食，用戊巴比通麻醉并用OGTT中所述的葡萄糖进行攻击。葡萄糖攻击15分钟后利用4×75ul的血流比容计试管从禁食小鼠或小鼠的眼眶血管丛流出的血收集用于胰岛素分析的血样。血清样品被稀释5倍或20倍后一式两份利用Linco敏感大鼠胰岛素放射免疫分析试剂盒进行胰岛素含量的测定。将得自葡萄糖攻击后15分钟被放血小鼠的胰腺切割后冷冻在干冰上。按照每克胰腺采用2ml的含1mg/ml BSA的PBS的比例在杜恩斯匀浆器中冲击10次来匀浆所述冷冻胰腺。利用3×10秒的猝发脉冲对浆液进行超声处理，然后在12000xg的条件下离心60分钟。将上清液保存在-20℃下。胰岛素含量通过敏感大鼠胰岛素RIA用稀释1000倍的浆液来测定。
组织学和免疫组织化学从被麻醉的小鼠体内切出胰腺、肝脏、肾和脑并立即固定在福尔马林中。石蜡包埋的切片(4um)用haemotoxylin和曙红染色或被制备成适于进行免疫组织化学或间接免疫荧光分析的形式。按照下述方法对脱石蜡切片进行免疫染色。在含1％脱脂奶粉的PBS中将所述切片封闭1小时。豚鼠(Dako)体内产生的抗胰岛素抗血清用含1％脱脂奶粉的PBS稀释50倍并在室温下放置60分钟。用PBS冲洗切片并与稀释度为1∶200的偶联于豚鼠抗血清的辣根过氧化物酶(Sigma)或稀释度为1∶400的偶联于豚鼠抗血清的FITC(Sigma)一起温育1小时。在与抗体进行温育前，利用0.5％的过氧化氢的甲醇溶液来失活内源性过氧化物酶活性并利用Sigma FAST-DAB过氧化物酶片剂检测偶联于结合的HRP抗体。FITC利用Olympus落射荧光显微镜来检测，利用数码相机和MCID软件获得图像并分析。
统计通过ANOVA和斯氏t试验对数据进行分析，结果显示出显著差异。其中数据分布不正常，采用了Mann-Whitney U-试验。利用Microsoft excel软件进行斯氏t-试验。利用Statistica forWindows(Statsoft)进行ANOVA和Mann-Whitney U-试验。
(ii)结果对小鼠进行腹膜内注射后通过测定肾脏内的巴弗洛霉素A1敏感性ATP酶活性来评估vATp酶的体内抑制作用，肾脏富集了vATP酶。对得自7只对照小鼠或提前1天或7天注射了巴弗洛霉素A1的每个试验组中的4只小鼠的肾匀浆进行测定(表1)。处理后的第1天和第7天对巴弗洛霉素A1敏感的ATP酶活性降低了50％(p＜0.05，斯氏t-试验)，但对巴弗洛霉素A1不敏感的ATP酶活性没有降低，表明处理的小鼠体内产生了特异性的vATP酶抑制作用。被处理的小鼠或对照小鼠的体重或肾蛋白含量不存在显著性差异(表1)。
表1

口服葡萄糖耐受试验通过OGTT以及血糖和血浆胰岛素浓度的测定来确定vATP酶体内抑制对胰岛β-细胞功能造成的结果。施用巴弗洛霉素A1或载体溶液后的2小时、7天或21天时对由6只小鼠组成的相同实验组进行OGTT。由于对照组的3次OGTT测量之间不存在血糖浓度的显著差异，所以将这三次测量值结合起来与被处理小鼠的每次OGTT测量值进行比较(图1)。施用巴弗洛霉素A1后的2小时，OGTT曲线与对照相类似(数据没有显示)。施用后7天，葡萄糖的禁食和峰值浓度与对照类似，但是巴弗洛霉素A1处理的小鼠在2小时后浓度显著降低(4.1±0.4vs5.4±1.6mM，P＝0.006，斯氏t试验)。这种效果也出现在处理后的第21天(4.2±0.2相对对照的5.4±1.6mM，P＝0.01，斯氏t试验)。施用抑制剂后第21天，被处理小鼠的葡萄糖浓度所达到的峰值显著高于对照(葡萄糖攻击后的15分钟被处理小鼠的12.5±2.4相对对照的9.5±1.8mM，P＝0.04，斯氏t试验)。小鼠禁食葡萄糖浓度没有发生变化。
巴弗洛霉素A1对血浆和胰腺胰岛素的影响对禁食小鼠测定血浆免疫反应性胰岛素浓度，并且在葡萄糖攻击后的第15分钟对用巴弗洛霉素A1或载体溶液处理的各8只小鼠组成的2个实验组进行血浆免疫反应性胰岛素浓度的测定。被处理小鼠的禁食胰岛素浓度显著低于对照(1.2±0.8对3.1±1.3，P＝0.004，斯氏t试验)。葡萄糖攻击后的第15分钟，血浆胰岛素浓度类似(15±10对13±11，P＝0.8，斯氏t试验)。
通过半定量荧光检测法测定胰腺胰岛素的总水平(图2)。利用抗-胰岛素抗体对石蜡包埋的胰腺切片进行间接免疫荧光检测，由每个胰岛发出的荧光强度通过数码图象捕获和利用MCID软件的测光密度术来进行定量分析。评价得自5只对照小鼠的7个胰岛，得自在剖开胰腺的前1天用巴弗洛霉素A1处理的3只小鼠的49个胰岛，以及得自在剖开胰腺的前7天用巴弗洛霉素A1处理的3只小鼠的49个胰岛。在分析数据之前减去每个胰岛附近的外分泌胰腺产生的背景荧光。得自对照小鼠的胰岛所发出的净荧光(中值＝41.5，范围＝7.7-72.7)比用巴弗洛霉素A1处理的小鼠低得多。这种增加在施用巴弗洛霉素A1后的1天(中值＝57.9，范围＝28.6-89.1)和7天(中值＝59.9，范围＝29.5-79.7)非常明显(p＜0.0001相对对照，Mann-Whitney U试验)。
胰腺免疫反应胰岛素含量直接通过对胰腺匀浆的RIA来测定。预先处理了14天的小鼠被禁食，然后在取出胰腺前的15分钟用葡萄糖进行攻击。5只处理的小鼠的胰腺含有的免疫反应胰岛素比4只对照小鼠的胰腺多70％(每克胰腺的中值＝565，范围＝287-718相对中值＝273，范围＝159-453μg IRI，p＜0.03，Mann-Whitney U试验)。
巴弗洛霉素A1的长期效应通过间隔时间为一星期的两次处理，分析巴弗洛霉素A1对4只小鼠的葡萄糖浓度和胰岛形态的长期影响。在90天内每星期随机测定一次血糖浓度(RBG)和体重并且将结果与用载体溶液处理的3只对照小鼠的结果进行比较。处理后的90天内每星期进行的血糖浓度的测定结果表明被处理小鼠的血糖浓度比对照小鼠的血糖浓度有了一个很小但却明显的增加(图3，p＜0.05，重复测定ANOVA)。处理组与对照组的体重没有明显差别。
在第90天实验结束时，检测胰岛的形态，结果发现产生了破裂和再生的征象(图4)。测量胰岛的尺寸并比较对照小鼠和提前1天、7天或26天进行了处理的小鼠的胰岛尺寸(图6)。对照与1天或7天处理组的胰岛之间没有差别但是提前26天或90天处理的小鼠的胰岛尺寸明显地减小了(p＜0.001，Mann-Whitney U试验)。肾脏、肝脏、睾丸和脑这些器官中没有检测到任何形态上的变化。组织切片中总胰岛面积占胰腺总面积的百分比是对照为0.32％，1天处理的小鼠为0.33％，7天处理的小鼠为0.30％，26天处理的小鼠为0.23％以及90天处理的小鼠为0.16％，但该差别不明显(p＝0.08，Mann-Whitney U试验)。得自12只对照小鼠的223个胰岛的平均尺寸是7900um2，得自4只提前26天处理的小鼠的90个胰岛的平均尺寸是4900um2，得自4只提前90天处理并使用了两剂量bafA1的小鼠的81个胰岛的平均尺寸是2800um2。
实施例3口服巴弗洛霉素A1和刀球肮霉素A对小鼠β-细胞的影响检测口服巴弗洛霉素A1(BA1)和刀球肮霉素A在小鼠β-细胞内产生的影响。免疫学和代谢特性差异非常大的三个品系的小鼠，C57B1/6、SJL和BALB’c可以被用来确定，例如对于重复施用低剂量的链脲菌素的模型来说，在具有适当遗传背景的小鼠体内，所述处理是否激发了胰岛的自体免疫。在连续5天的每一天通过强饲法经口施用BA1或通过腹膜内注射施用BA1。表中显示了对3个品系的小鼠分别进行处理的细节。
表2

胰岛β-细胞的功能可以通过在第6天进行的口服葡萄糖耐受试验(OGTT)来评估。所述处理预计抑制胰岛素的分泌并且导致受损的葡萄糖耐受性。产生葡萄糖耐受性的那些品系/剂量的组合可以通过测定血浆和胰岛中的胰岛素的水平来得到进一步的检测。通过在最终完成施用后的第10或20天利用TUNEL分析法检测每组中3只小鼠扰乱的胰岛形态和编程性细胞死亡情况来研究胰腺的组织学。这些实验可以证实和补充早期的观察，即BA1导致β-细胞的体内功能异常以及BA1和刀球肮霉素A经口施用是否有效。
实施例4食用马铃薯、马铃薯疮痂感染与1型糖尿病发病率之间的关系由于塔斯马尼亚人种群的结构和稳定性，塔斯马尼亚人胰岛素-糖尿病治疗的调查登记是研究1型糖尿病流行病学的独特资源。要求使用胰岛素治疗糖尿病且年龄低于65岁的所有塔斯马尼亚人居民进行了登记。全国大多数登记人员通过糖尿病诊所被征募。糖尿病调查人员将登记卡发放到具备资格进行填写的登记人员手中，然后自愿登记人员而被症募到，将这些表格送到Menzies中心。新的登记人员也可以通过已经登记在的人员而被征募，例如亲戚、澳大利亚糖尿病患者(Diabetes Australia)、媒体宣传、GPs和药业，并且在过去已通过国家糖尿病服务计划被征募到。该登记的优点在于它的完整性(84％)，Menzies中心机构与参与工作的临床医生之间的协调和登记人员的合作。
从所登记的1342个个体收集用于血清血研究的血液。用于该计划的1型糖尿病的选择是基于胰岛素的治疗、最初临床表现和由诊治医师出据的治疗病史记录。可获得的自身-抗体性质和C-肽用作附加的证实材料。
与塔斯马尼亚人种群中的1型糖尿病有关的环境接触可以通过基于环境调查表的病例-控制方案来确定。与食用块茎蔬菜，尤其是马铃薯，有关的问题以及包括在先与1型糖尿病有关的环境接触如母乳喂养(持续时间、例外和总量)、牛奶的摄取(牛奶基础的配方产品、牛奶、乳品)、童年的病毒感染和疫苗接种在内的相关疑问可以得到测量。
目前获得了至少400个具有完整临床和表型数据的1型糖尿病确诊的病例并且从选民中选出相同数目的在年龄和性别方面相当的对照。按照以下方式评估允许5％假阳性的统计能力(power)具有80％能力(power)的检测(a)肠病毒的机率(OR)＝1.5-1.7(18％的对照受到影响)，牛奶(66％的病例接触)并且没有进行母乳喂养(47％的对照接触)。
已知过去的饮食调查表有可能纳入了错误数据，因此不能基于阴性结果排除假说。所以，可以采用其它方法来寻找接触被链霉菌感染的块茎蔬菜与1型糖尿病发病率之间的关系，包括1型糖尿病的年发病率与马铃薯疮痂病在塔斯马尼亚人中进行流行之间的关系。
实施例5被感染植物体内的链霉菌毒素链霉菌属中的所有病原体菌株产生一种或多种相关的植物毒素(thaxtomin)而非病原体菌株则不产生。在没有病原体本身存在的条件下对正在发育的块茎蔬菜施用这些毒素能够引发常见疮痂病的全部普通症状。其它毒性次级代谢物的产生似乎也是植物病原性链霉菌的常见特征。例如，疮痂病型链霉菌菌株和另一个在日本分离的疮痂-诱发菌种产生刀球肮霉素A和B以及巴弗洛霉素和刀球肮霉素的产生菌种灰色链霉菌和淀粉酶产色链霉菌属于分离自块茎蔬菜的菌种。
已经研究出了一种用于鉴定抑制哺乳动物细胞中的重要细胞过程的生物活性次级代谢物的方法。该方法涉及样品的有机溶剂萃取，萃取物组分的RP-HPLC分离，峰值级分的生物学检测，通过UV-分光光度测定法、质谱测定和/或核磁共振鉴定活性种类。纳克级的vATP酶抑制剂和离子载体可以通过利用vATP酶对质子进行跨膜转运而使胞内区室得到酸化的事实而轻松测得。所得的pH梯度可以通过用显微镜观察嗜酸性细胞-渗透染料如丫啶橙的积累来测定。当这些pH梯度通过离子载体(例如尼日利亚菌素)或直接抑制vATP酶(即采用巴弗洛霉素和刀球肮霉素)而得到消除时，染料不在胞内区室中积累，其中所述离子载体加快了离子的跨膜运动。
方法对马铃薯皮或肉或培养液(2L燕麦片汁或Schnurer培养液，在30℃下剧烈搅拌14天)的样品进行研磨并用乙酸乙酯或氯仿进行萃取。利用Deltapak C18分析柱、用waters 600型溶剂输送系统，770自动样品器和996型双体光电二极管排列检测仪在210和254nm的波长下通过RP-HPLC来分离所述萃取物。收集峰值级分并按照下述方式进行生物活性检测在以1∶20-25稀释度含有HPLC峰值级分的标准培养基中将COS7细胞培养1小时。除去培养基并换上含有2μg/ml丫啶橙的培养基并在37℃/5％二氧化碳条件下的潮湿气氛中培养15-20分钟。然后利用蓝色激发光通过表面荧光显微镜术对细胞进行检测。抑制丫啶橙吸收的峰值级分通过利用Micromass ZMD ESI-MS的质谱测定来进一步定性，所述Micromass ZMD ESI-MS装配了Gilson306HPLC 215液体处理器和泵以及Agilent 1100系列双体光电二极管排列检测仪。
结果对分离自被感染植物的13个澳大利亚链霉菌株的提取物进行分析并且鉴定出了4个产毒菌株。从感染了常见疮痂病的马铃薯皮得到的提取物也能够消除哺乳动物细胞中的质子梯度。质谱测定结果表明这些毒素中的一种是以前定性的离子载体尼日利亚菌素，而其它三种是属于plecomacrolide抗菌素的巴弗洛霉素类和刀球肮霉素类的vATP酶抑制剂(表3)。
表3由引起疮痂病的链霉菌产生plecomacrolide和离子载体毒素。所述毒素以下述基础鉴定(i)未知物相对标准物的RP-HPLC保留时间，(ii)生物分析中对丫啶橙吸收的抑制作用，和(iii)生物活性级分的电子电离质谱测定(EI-MS)。

图7显示了在分离自马铃薯疮痂病损伤部位的链霉菌的提取物中鉴定巴弗洛霉素的色谱特性的一个实例。
实施例6v-ATP酶抑制剂对胰腺胰岛形态的影响利用巴弗洛霉素A1(BA1)或A(CMA)分析v-ATP酶抑制剂在C57B1/6J内对胰腺胰岛的大小和数量的影响。对由不产色链霉菌(Streptomyces achromogene)产生的链脲菌素，一种胰岛β-细胞特异性毒素也进行了检测，从而能够与v-ATP酶抑制剂的作用进行比较。
方法连续5天以5次剂量给每组的4只C57B1/6J雌性小鼠注射剂量为12ng/g体重的BA1、CMA或完全定性的胰岛β-细胞毒性链脲菌素。在第84天取出胰腺，然后对每只小鼠的三个福尔马林固定切片进行胰岛素免疫染色。利用MCID软件测定数字化图像上的胰岛素阳性的胰岛面积。
结果腹膜内注射剂量为12ng/g体重的BA1、CMA，使得胰岛大小发生了明显的改变。经BA1和CMA处理，小胰岛的数量增加了而大胰岛的数量仍保持不变(表4)。这与对β-细胞有毒性的链脲菌素的作用相反，链脲菌素的作用是降低了胰岛的数量但不诱导新胰岛的形成。这些结果表明vATP酶抑制剂对胰岛大小的影响不是特定小鼠品系或小鼠性别所特有的，并且也仅仅不局限于巴弗洛霉素A1，因为尽管分子结构有差别，但刀球肮霉素A1同样也能够改变C57B1/6J小鼠体内的胰岛的形态。
表4

实施例7非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠的糖尿病发病的加速NOD小鼠由于自身免疫介导的胰腺胰岛β-细胞损伤而患上自发性糖尿病。NOD小鼠所患糖尿病的特点类似于人，从而使NOD小鼠成为人类1型糖尿病的有用模型。4周龄时一断奶，被称作胰导炎的淋巴细胞在胰腺胰岛中的浸润现象就首先出现在NOD小鼠身上并且在18至32周龄期间首先出现了高血糖症。对NOD小鼠施用巴弗洛霉素A1来检测高血糖的发病是否被加速。
方法在连续5天的每一天给11周龄大小的NOD/lt雌性小鼠腹膜内注射剂量为12ng/g体重的巴弗洛霉素A1(10只小鼠)或磷酸盐缓冲液载体溶液(10只小鼠)。每周监控一次血糖并将糖尿病定义为血糖测量值高于11mmol/L。
结果采用巴弗洛霉素A1处理的实验组中的3只NOD小鼠首先患上了高血糖症，表明胰岛β-细胞损伤和高血糖症有些加快(图8)。
除了具体记载的变化或改进外，本技术领域的技术人员深知本文记载的发明易于进行任何变化和改进。应当理解本发明包括所有这些变化或改进。本发明还分别或组合包括本说明书所涉及或指明的所有步骤、特性、组合物和化合物，以及任意两种或多种所述步骤或特性的所有组合方式。
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权利要求
1.一种评估可摄入物质被哺乳动物摄入后诱导、上调或促成所述哺乳动物糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的方法，所述方法包括筛选所述物质是否表达一种或多种β-细胞毒性大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物，其中所述大环内酯的表达是所述物质诱导、上调或促成糖尿病的发病和/或病情发展的倾向性的指标。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述可摄入物质是一种植物或其繁殖材料。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述植物是块茎蔬菜。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述块茎蔬菜是马铃薯、甜菜或胡萝卜。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述β-细胞毒性大环内酯是巴弗洛霉素或其衍生物、变异体、突变体或同系物。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述巴弗洛霉素是巴弗洛霉素A1、A2、B1、B2和/或C。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述巴弗洛霉素是巴弗洛霉素A1。
8.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述β-细胞毒性大环内酯是刀球肮霉素或其衍生物、变异体、突变体或同系物。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述刀球肮霉素是刀球肮霉素A、B、C和/或D。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述刀球肮霉素是刀球肮霉素A。
11.一种诊断哺乳动物体内存在糖尿病危险因素的方法，所述方法包括筛选所述哺乳动物是否表达一种或多种β-细胞毒性大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物，其中所述大环内酯的表达是所述哺乳动物的糖尿病发病和/或病情发展的危险性指标。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中所述β-细胞毒性大环内酯是巴弗洛霉素或其衍生物、变异体、突变体或同系物。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述巴弗洛霉素是巴弗洛霉素A1、A2、B1、B2和/或C。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述巴弗洛霉素是巴弗洛霉素A1。
16.如权利要求11或12所述的方法，其中所述β-细胞毒性大环内酯是刀球肮霉素或其衍生物、变异体、突变体或同系物。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述刀球肮霉素是刀球肮霉素A、B、C和/或D。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述刀球肮霉素是刀球肮霉素A。
19.用于测定植物及其繁殖材料或生物样品的诊断试剂盒，该试剂盒以区室的形式包含适于盛放用于检测β-细胞毒性大环内酯的物质的第一区室和适于盛放用于促进第一区室内的物质进行检测的试剂的第二区室。
20.如权利要求19所述的试剂盒，其中所述植物是块茎蔬菜。
21.如权利要求20所述的试剂盒，其中所述块茎蔬菜是马铃薯、甜菜或胡萝卜。
22.如权利要求19-21中任一项所述的试剂盒，其中所述β-细胞毒性大环内酯是巴弗洛霉素或其衍生物、变异体、突变体或同系物。
23.如权利要求22所述的试剂盒，其中所述巴弗洛霉素是巴弗洛霉素A1、A2、B1、B2和/或C。
24.如权利要求23所述的试剂盒，其中所述巴弗洛霉素是巴弗洛霉素A1。
25.如权利要求19-21中任一项所述的试剂盒，其中所述β-细胞毒性大环内酯是刀球肮霉素或其衍生物、变异体、突变体或同系物。
26.如权利要求25所述的试剂盒，其中所述刀球肮霉素是刀球肮霉素A、B、C和/或D。
27.如权利要求26所述的试剂盒，其中所述刀球肮霉素是刀球肮霉素A。
28.一种预防、减少或减轻哺乳动物糖尿病的方法，所述方法包括下调由所述哺乳动物表达的β-细胞毒性大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物的功能活性。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
30.如权利要求28或29所述的方法，其中所述β-细胞毒性大环内酯是巴弗洛霉素或其衍生物、变异体、突变体或同系物。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述巴弗洛霉素是巴弗洛霉素A1、A2、B1、B2和/或C。
32.如权利要求21所述的方法，其中所述巴弗洛霉素是巴弗洛霉素A1。
33.如权利要求28或29所述的方法，其中所述β-细胞毒性大环内酯是刀球肮霉素或其衍生物、变异体、突变体或同系物。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述刀球肮霉素是刀球肮霉素A、B、C和/或D。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述刀球肮霉素是刀球肮霉素C。
36.一种含有β-细胞毒性大环内酯拮抗剂和一种或多种药用载体和/或稀释剂的药物组合物。
37.如权利要求36所述的药物组合物，该药物组合物按照权利要求28-33中任一项所述的方法进行使用。
38.一种预防、减少或减轻哺乳动物糖尿病的方法，所述方法包括减少所述哺乳动物对植物或其繁殖材料的食用量，其中所述植物表达一种或多种β-细胞毒性大环内酯或其衍生物、变异体、突变体或同系物。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述可摄入物质是一种植物或其繁殖材料。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述植物是块茎蔬菜。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述块茎蔬菜是马铃薯、甜菜或胡萝卜。
42.如权利要求38-41中任一项所述的方法，其中所述β-细胞毒性大环内酯是巴弗洛霉素或其衍生物、变异体、突变体或同系物。
43.如权利要42所述的方法，其中所述巴弗洛霉素是巴弗洛霉素A1、A2、B1、B2和/或C。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述巴弗洛霉素是巴弗洛霉素A1。
45.如权利要求38-41中任一项所述的方法，其中所述β-细胞毒性大环内酯是刀球肮霉素或其衍生物、变异体、突变体或同系物。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述刀球肮霉素是刀球肮霉素A、B、C和/或D。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述刀球肮霉素是刀球肮霉素A。
全文摘要
本发明涉及一种评估方法，该方法被用来评估植物如果被食用对哺乳动物糖尿病的发病和病情发展造成影响的倾向性，并且更特别地涉及一种评估方法，该方法被用来评估块茎蔬菜如果被食用对哺乳动物糖尿病的发病和病情发展造成影响的倾向性。本发明的方法用于鉴定由于饮食的摄入而易患糖尿病的哺乳动物等。本发明还涉及个体患糖尿病的危险程度的评估方法。本发明还进一步提供了用于预防和/或治疗糖尿病的方法。
文档编号G01N33/569GK1688885SQ02813123
公开日2005年10月26日 申请日期2002年5月22日 优先权日2001年5月31日
发明者M·A·米尔斯, I·R·麦凯, P·Z·兹梅特 申请人:莫纳什大学, 国际糖尿病研究院